2022年基于测序的微生物多样性分析总结.docx

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1、精品_精品资料_一般认为土壤、海洋、肠道等生态系统中的微生物数量繁多、种类多样.传统的培育方法只限于对环境样品中极少部分（ 0.1%-1% ）可培育的微生物类群的讨论,而变性梯度凝胶电泳（ DGGE 、克隆文库等常规的分子生物学方法也因操作复杂、成本高、痕量菌发觉困难等因素无法达到深化分析环境微生物多样性的目的.高通量测序技术的显现,极大的促进了对环境中不行培育微生物以及痕量菌的讨论,为环境微生物多样性的讨论开启了新的讨论热 潮.微生物群落中物种的多样性依旧是目前讨论的重点.对群落结构的讨论,将有助于明白种群结构的稳固性,进而明白种群 内物种间的相互依靠、相互制约的内在联系,为将来构建功能性种

2、群服务.鉴于微生物群落是一个多物种的集合体,其中高达 95% 以上的微生物物种无法分别也不能独立培育,拼装出每个独立个体的基因组现在也无法实现,细菌16S 或真菌 ITS 测序分析依然是现阶段微生物群落多样性和多态性分析的基石.一、高通量测序背景介绍高通量测序技术,可以一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序 列测定,使得对 PCR 扩增产物直接进行序列测定成为可能.极大的促进了对环境中不行培育微生物以及痕量菌的讨论,为环境微可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_生物多样性的讨论开启了新的讨论热潮.目前高通量测序的主要可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_平台代表有 Ill

3、umina 公司的 Solexa 基因组分析仪 Illumina GenomeAnalyzer 、罗氏公司 Roche 的 454 测序仪 Roch GSFLX sequencer 和 ABI 的 SOLiD 测序仪 ABI SOLiD sequencer . 微生物多样性分析中,以Illumina 及 454 测序平台应用最为广泛. 二、工作流程1 PCR 引物的设计2 PCR 扩增条件摸索3 琼脂糖凝胶电泳检测结果4 全部样品进行 PCR5 PCR 产物的凝胶回收及检测6 PCR 产物精确定量 Qubit 2.0将纯化后的 PCF 产物采纳微量荧光核酸定量仪进行精确定量 精确到 0.1ng

4、/ul 7. 将定量后混匀的DNA 羊本再次进行磁珠法纯化后,进行高通量测序三、可分析项目1 有效序列数据统计在测序试验中, 通常采纳多个羊品平行测序的方法, 即多个羊品 混合测序. 为了能区分羊品, 各羊品中的序列均引入了一段标示 其羊原来源信息的 barcode 标签序列.如所测序列中不含有 barcode 标签序列, 就无法确定其羊原来源, 进而导致后续生物信息错误或意义不明. 因此,仅当原始序列中含有完整的 barcode可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_2） ）优化序列数据统计通常情形下, 有效序列可以直接用于后续生物信息学分析.在实 验过程中, 测序产物可能含有非特异

5、性扩增片段,利用特异性引 物信息可以将其去除.序列中可能含有模糊碱基（ ambiguous ）、 单碱基高重复区 （ homologous）以,长度过短的序列（ 序列长 度小于200bp ）,及 PCR 过程中产生的一些嵌合体,将这些序列纳入分析范畴会降低分析质量,因此修剪、去除（trim ）此部分 序列,可得到供精准分析的优化序列.在数据去除（trim ）时, 把 maxambig=Q axhomop=8 maxlength=200,及其嵌合体序歹 U 去掉,并对数据进行 统计,得到优化序列的百分率.3） ） OTU 生成依据序列的相像性,将序列归为多个OTU （ 操作分类单元）,以便后续分

6、析. OTU （ Operational Taxonomic Units）是在系统 发生学讨论或群体遗传学讨论中,为了便于进行分析,人为给某 一个分类单元（品系,种,属,分组等）设置的同一标志.在生物信息分析中,一般来说,测序得到的每一条序列来自一个菌.要明白一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息,就需要对 序列进行归类操作（ cluster ）.通过归类操作,将序列依据彼此的相像性分归为 很多小组,一个小组就是一个OTU 依据客户指定的相像度（ 96% 97 減者 98% ,对全部序列进行OTU 划分可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_OTU 分析主要步骤(1) 提取非重复序列

7、,碱基完全一样序列为重复序列.(2) 与 silva 库中的 aligned16S/18S, SSU核糖体序列比对.(3) Chimeric序列检测与去除(4) 距离运算与 OTU 聚类.4) 多样性分析 Alpha-diversity运算菌群丰度 Community richness 的指数有：(1) Chao ：是用 chaol算法估量群落中含OTU 数目的指数,chao1 在生态学中常用来估量物种总数,由Chao 1984最早 提出.(2) Ace ：用来估量群落中含有OTU 数目的指数,由 Chao 提出, 是生态学中估量物种总数的常用指数之一,与Chao I 的算法不 同.运算菌群多

8、样性 Community diversity 的指数有：(1) Simpson ：用来估算样品中微生物的多样性指数之一,由Edward Hugh Simpson 1949提出,在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性.Simpson指数值越大, 说明群落多 样性越低.(2) Shannon ：用来估算样品中微生物的多样性指数之一.它与Simpson多样性指数均为常用的反映alpha 多样性的指数.Shannon值越大,说明群落多样性越高.可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_Coverage : 是指各样品文库的掩盖率,其数值越高,就样本中序 列没有被测出的概率越低. 该指数实

9、际反映了本次测序结果是否 代表样本的真实情形.使用软件 : mothur 及 BioLinker 自编程序.5) 稀释性曲线 Rarefaction curve稀释性曲线 :一般是从样本中随机抽取肯定数量的个体,统计出 这些个体所代表物种数目,并以个体数与物种数来构建曲线.它 可以用来比较测序数量不同的样本物种的丰富度,也可以用来说 明样本的取样大小是否合理.分析采纳对优化序列进行随机抽样的方法,以抽到的序列数与它们所能代表OTU 的数目构建稀释性曲线.稀释性曲线 图中,当曲线趋向平整时,说明取样的数量合理,更多的取样只会产 生少量新的 OTU 反之就说明连续取样仍可能产生较多新的 OTU 因

10、此,通过作稀释性曲线,可以得出样品的取样深度情形.稀释性曲线分析结果默认是在97% 相像性水平下划分OUT 并制 作各样品的稀疏曲线.6) 分类学分析 Taxonomy 在之前的分析步骤中,已经将序列依据其自身的碱基组成的相像性, 分归到各 OTU 中.在进行分类学分析时,第一,将每一条优质序列都与 SILVA 最新版 数据库进行比对,找出其最相近且可信度达 80% 以上的种属信息.之后,将每一个OTU 中的所 有序列进行类比,找出同一 OTU 中的不同序列的最近祖先的种属信息.最终,将可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_量的情形下,确保得出信息的精确性.7） ） 样本间比较 各样

11、品群落结构分析柱状图或者饼状图在某一分类位置上依据各样品中的微生物组成绘制饼图或者柱状图.8） ） 全样品相像度分析树状图比较多个样品中 OTU 组成的差异及各 OTU 中含有序列的丰度,计算这些样品的相像性,并绘制相像性图谱.9） ） 样品 OTU 分布比较 -VENN 图统计多个样品中所共有的OTU 数目可以反映环境样品的相像性及重叠情形.10 ） Heatmap热图分析Heatmap可以用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息,它可以直观的将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来.常根 据需要将数据进行聚类,将聚类后的数据表示在heatmap的相像 性和差异性.如在属水平上对样品和OTU

12、 类型（样品所含菌属）进行聚类（依据是不同样品中各OTU 所含序列数越相近,即所含菌属数量越相近,样品间相像性越高）,对聚类后各样品中不同 OTU （不同菌属）所含序列的丰度作heatmap 图,能够反映 出在菌属水平上各样品菌落结构的相像性和差异性.将指定种属 水平上的分类信息分别依据样品和分类进行聚类后作出Heatmap图,能够反映出全部样品在各分类水平上表现的相像性或者差异性.11) 组间显著性差异分析 metastats分析分析多个样品时,假如这可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_两组条件下的多个样品,找出两组中具有显著差异的微生物类型.结果如下表所示：12) PCA 分析

13、 Principal Component AnalysisPCA 分析,即主成分分析,是一种对数据进行简化分析的技术,这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构,去除 噪音和冗余, 将原有的复杂数据降维,揭示隐匿在复杂数据背后的简洁结 构.它的优点是简洁,而且无参数限制,可以便利的应用于各个场 合.我们可以用PCA 来分析不同样品OTU 组成的差 异,通过方差分解,将多组数据的差异反映在二维坐标图上,坐标轴取能够最大反 映方差值的两个特点值.如样品组成越相像,反映在 PCA 图中的距离越近.不同环境间的样品可能表现出分散分布. PCA 分析可以用来反映不同样品中微生物群落组成的相像性以

14、及影响微生物多样性的主 要因素, 一般情形下是用来对假设进行验证.如 PCA 可以用来做以下分析：确定环境中的样品是否具有显著不同的微生物群落.将环境间的 差异以图的形式表现出来等.13) RDA 分析利用冗余分析 RDA 可以反映在 OTU 的水平或者某生物学分类水平上各样品中菌群与环境因子之间关系.14) UniFrac分析选取一个组的多个样品或者不同组的样品,进行Weighted可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_OTU 的水平上反映各样品间或者不同组间微生物群落结构的差异.15) 进化树分析选择各样品丰度 0.1% 的 OUT 的代表序列,构建系统发育树.16) 微生物种类分级进化树分析以样本所得 genus 菌种信息为源数据,对其进行微生物的分级进化树分析, 图中不同的颜色对应不同的样本,饼图的面积代表序列数目的多少, 最终一个级别的饼图代表每个genus 水平的序列 数目, 前一个级别饼图的大小为后面相应物种信息序列数目的汇总,所以级别越高,饼图的面积就会越大.可编辑资料 - - - 欢迎下载