生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程24764.docx

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1、生物制品品生产和和检定用用动物细细胞基质质制备及及检定规规程本规程适适用于人人用生物物制品生生产/检检定用动动物细胞胞基质，包包括具有有细胞库库体系的的细胞基基质及原原代细胞胞。细胞胞基质系系指可用用于生物物制品生生产/检检定的所所有动物物或人源源的连续续传代细细胞系、二二倍体细细胞株及及原代细细胞。 生产非重重组制品品所用的的细胞基基质，系系指来源源于未经经修饰的的用于制制备其主主细胞库库的细胞胞系/株株和原代代细胞。生生产重组组制品的的细胞基基质，系系指含所所需序列的的、从单单个前体体细胞克克隆的转转染细胞胞。生产产的细胞胞基质，系系指通过过亲本骨骨髓瘤细细胞系与与另一亲亲本细胞胞融合的的

2、杂交瘤瘤细胞系系。一、对生生产用细细胞库细细胞基质质总的要要求用于生物物制品生生产的细细胞系/株均须须通过全全面检定定，须具具有如下下相应资资料，并并经国务务院药品品监督管管理部门门批准。（一）细细胞系/株历史史资料的的要求1. 细胞系/株来源源资料应具有细细胞系/株来源源的相关关资料，如如细胞系系/株制制备机构构的名称称，细胞胞系/株株来源的的种属、年年龄、性性别和健健康状况况的资料料。这些些资料最最好从细细胞来源源实验室室获得，也也可引用用正式发发表文献献。人源细胞胞系/株须具具有细胞胞系/株的组组织或器器官来源源、种族族及地域域来源、年年龄、性性别及生生理状况况的相关关资料。动物来源源的

3、细胞胞系/株须具具有动物物种属、种种系、饲饲养条件件、组织织或器官官来源、地地域来源源、年龄龄、性别别、病原原体检测测结果及及供体的的一般生生理状况况的相关关资料。如采用已已建株的的细胞系系/株，应应从具有有一定资资质的细细胞保藏藏中心获获取细胞胞，且应应提供该该细胞在在保藏中中心的详详细传代代过程，包包括培养养过程中中所使用用的原材材料的相相关信息息，具有有细胞来来源的证证明资料料 。2细胞胞系/株培养养历史的的资料应具有细细胞分离离方法、细细胞体外外培养过过程及建建立细胞胞系/株株过程的的相关资资料，包包括所使使用的物物理、化化学或生生物学手手段，是是否有外外源添加加序列，以以及细胞胞生长

4、特特征、生生长液成成分、选选择细胞胞所进行行的任何何遗传操操作或选选择方法法等。同同时还应应具有细细胞鉴别别、检定定、内源源及外源源因子检检查结果的的相关资资料。应提供细细胞培养养液的详详细成分分，如使使用人或或动物源源成分，如如血清、胰胰蛋白酶酶、水解解蛋白或或其他生生物学活活性的物物质，应应具有这这些成分分的来源源、制备备方法及及质量控控制、检检测结果果和质量量保证的的相关资资料。（二）细细胞库的的建立细胞库的的建立可可为生物物制品的的生产提提供已标标定好的的、细胞胞质量相相同的、能能持续稳稳定传代代的细胞胞种子。 1原材材料的选选择建立细胞胞库的各各种类型型细胞的的供体均均应符合合本规程

5、程细胞的的检定中相关关规定。神神经系统统来源的的细胞不不得用于于生物制制品生产产。细胞培养养液中不不得使用用人血清清，如需需使用人人血白蛋蛋白，则则须使用用有批准准文号的的合格制制品。消化细胞胞用胰蛋蛋白酶应应进行检检测，证证明其无无细菌、真真菌、支支原体或或病毒污污染。特特别应检检测胰蛋蛋白酶来来源的动动物可能能携带的的病毒，如如细小病病毒等。用于生物物制品生生产的培培养物中中不得使使用青霉霉素或-内酰胺胺(-Laactaam)类类抗生素素。配制制各种溶溶液的化化学药品品应符合合中国国药典（二部）或其他相关国家标准的要求。2细胞胞操作的的环境要要求细胞培养养的操作作应符合合中国药药品生产产质

6、量管管理规范范的要要求。生生产人员员应定期期检查身身体。在在生产区区内不得得进行非非生产制制品用细细胞或微微生物的的操作；在同一一工作日日进行细细胞操作作前，不不得操作作或接触触有感染染性的微微生物或或动物。3建立立细胞库库细胞库为为三级管管理，即即原始细细胞库、主主细胞库库及工作作细胞库库。如为为引进的的细胞，可可采用主主细胞库库和工作作细胞库库组成的的二级细细胞库管管理。在在某些特特殊情况况下，也也可使用用MCBB一级库库，但须须得到国国务院药药品监督督管理部部门的批批准。（1）原原始细胞胞库(PPCB)由一个原原始细胞胞群体发发展成传传代稳定定的细胞胞群体，或或经过克克隆培养养而形成成的

7、均一一细胞群群体，通通过检定定证明适适用于生生物制品品生产或或检定。在在特定条条件下，将将一定数数量、成成分均一一的细胞胞悬液，定定量均匀匀分装于于安瓿，于于液氮或或-1300以下冻冻存，即即为原始始细胞库库，供建建立主细细胞库用用。（2）主主细胞库库(MCBB)取原始始细胞库库细胞，通通过一定定方式进进行传代代、增殖殖后均匀匀混合成成一批，定定量分装装，保存存于液氮氮或-1130以下。这这些细胞胞必须按按其特定定的质控控要求进进行全面面检定，应合格。主细胞库用于工作细胞的制备，每个生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。（3）工工作细胞胞库(WWCB)工作细胞胞库的细细胞由MMCB细细胞

8、传代代扩增制制成。由由MCBB的细胞胞经传代代增殖， 达到一一定代次次水平的的细胞，合合并后制制成一批批均质细细胞悬液液，定量量分装于于安瓿或或适宜的的细胞冻冻存管，保保存于液液氮或-1300以下备备用，即即为工作作细胞库库。每个生生产企业业的工作作细胞库库必须限限定为一一个细胞胞代次。冻冻存时细细胞的传传代水平平须确保保细胞复复苏后传传代增殖殖的细胞胞数量能能满足生生产一批批或一个个亚批制制品。 复苏后后细胞的的传代的的水平应应不超过过批准的的该细胞胞用于生生产限制制最高限限定代次次。所制制备的WWCB必必须经检检定合格格（见本本规程细胞检检定中有关关规定）后后，方可可用于生生产。4细胞胞库

9、的管管理每种细胞胞库均应应分别建建立台帐帐，记录录放置位位置、容容器编号号、分装装及冻存存数量，取取用记录录等。细细胞库中中的每支支细胞安安瓿或细细胞冻存存管均应应注明细细胞系/株名、代代次、批批号、编编号、冻冻存日期期，储存存容器的的编号等等。冻存前细细胞活力力应在990%以以上，复复苏后细细胞存活活率应不不低于885%。冻冻存后的的细胞，应应至少作作一次复复苏培养养并连续续传代至至衰老期期，检查查不同传传代水平平的细胞胞生长情情况。主细胞库库和工作作细胞库库分别存存放。非非生产用用细胞应应与生产产用细胞胞严格分分开存放放。（三）细细胞检定定细胞检定定主要包包括以下下几个方方面：细细胞鉴别别

10、、外源源因子和和内源因因子的检检查、致瘤瘤性检查查等。必必要时还还须进行行细胞染染色体核核型检查查。这些些检测内内容对于于MCBB细胞和和WCBB细胞及及生产限限定代次次细胞均均适用。细胞检定定的基本本要求见见下表11。细胞胞库建立立后应至至少对MMCB细细胞及生生产终末末细胞进进行一次次全面检检定。每每次从MMCB建建立一个个新的WWCB，均均应按规规定项目目进行检检定。 表表1、 细胞检检定项目目要求检测项目目MCBWCB生产终末末细胞*细胞鉴别别+无菌检查查+支原体检检查+病毒污染染检查外源病毒体外培养养法+体内接种种法+-+种属特异异性病毒毒+-+逆转录病病毒+-+细胞致瘤瘤性+-+

11、*生产产终末细胞胞:是指指按生产规规模制备备的终末末代次细细胞。1细胞胞鉴别试试验新建细胞胞系/株株、细胞胞库(MMCB和和WCBB)和生生产终末末细胞应应进行鉴鉴别试验验，以确确认为本本细胞，无无其他细细胞的交交叉污染染。细胞胞鉴别试试验方法法有多种种，包括括细胞形形态、生生物化学学法(如同工工酶试验验)、免疫疫学检测测(如HLAA、种特特异性抗抗血清)、细胞胞遗传学学检测(如染色色体核型型、标记记染色体体检测)、遗传传标志检检测(如DNAA指纹图图谱、SSTR图图谱、基基因组二二核苷重重复序列列 )等等。可选其中中一种或或几种方方法，但但均须经经国家药药品检定定机构认认可。细细胞表型型特征

12、与与遗传学学特征相相结合来来判断，更更有利于于细胞鉴鉴别。2无菌菌检查取混合细细胞培养养上清液液样品，依法检查， 应符合要求（附录XII A）。 3支原原体检查查取细胞培培养上清清液样品品，依法法检查， 应符合合要求（附录XII B进行），应为阴性。4细胞胞内、外外源病毒毒因子检检查应注意检检查细胞胞系/株株中是否否有来源源物种中中潜在的的可传染染的病毒毒，以及及由于操操作带入入的外源源性病毒毒。细胞胞进行病病毒检查查的种类类及方法法，须根根据细胞胞的种属属来源、组组织来源源及细胞胞特性决决定。（1）细细胞形态态观察及及血吸附附试验取混合瓶瓶细胞样样品，接接种至少少6个细细胞培养养瓶或培培养皿

13、，待待细胞长长成单层层后换维维持液，持持续培养养两周。如有必必要,可可以适当当换液。每每日镜检检细胞，细细胞应保保持正常常形态特特征。如为贴壁壁细胞或或半贴壁壁细胞， 细胞至至少培养养14天后后，分别别取1/3细胞胞培养瓶瓶或培养养皿，用用0.22%0.55% 豚豚鼠红细细胞和鸡鸡红细胞胞混合悬悬液进行行血吸附附试验。加加入红细细胞后置置2830分钟钟，然后后置2002530分钟钟，分别别进行镜镜检，观观察红细细胞吸附附情况，结结果应红红细胞吸吸附应为为阴性。 新鲜红细细胞在228保存不不得超过过7天, 且溶溶液中不不应含有有钙或镁镁离子。（2）不不同细胞胞传代培培养法检检测病毒毒因子将待检细

14、细胞分别别接种下下列三种种单层细细胞，包包括猴源源细胞、人人源二倍倍体细胞胞和同种种属同组组织类型型来源的的细胞。每每种单层层细胞接接种至少少107个含有有原细胞胞培养上上清液的的活细胞胞悬液或或细胞裂裂解物，每每种细胞胞至少接接种2瓶瓶。接种种供试品量量应占维维持液的的1/44以上，培培养至少少14天。试验验应设立立病毒阳阳性对照照，包括括可观察察细胞病病变的病病毒阳性性对照、血血凝阳性性对照及及血吸附附阳性对对照。如如细胞裂裂解物对对单层细细胞有干干扰，则则应排除除干扰因因素。在培养第第7天时时，分别别取每种种接种的的单层细细胞上清清液各一一瓶，分分别接种种于新鲜鲜制备的的相应的的单层细细

15、胞上，继继续培养养7天，观观察细胞胞病变并并进行细细胞形态态观察及及血吸附试试验。每每种接种种的单层层细胞不不得出现现细胞病病变，血血吸附试试验应均均为阴性性。若待检细细胞已知知可支持持人巨细细胞病毒毒(CMMV)的的生长，则则应在接接种人二二倍体细细胞后至至少观察察28天，应应无细胞胞病变。同同时，应应进行血血吸附试试验,应为阴阴性。（3）接接种动物物和鸡胚胚法检测测病毒因因子MCB或或WCBB细胞、增增殖到或或超过生生产用体体外细胞胞龄限制制代次的的细胞须须采用动动物体内内接种法法进行外外源病毒毒因子检检测。选选用乳鼠鼠、成鼠鼠和鸡胚胚(两组不不同日龄龄)共计4组， 按表22所列方方法进行

16、行试验和和观察。接种细胞后，任何动物出现异常或疾病均应进行原因分析。观察到期时，应至少有80%以上接种动物或鸡胚健存，视为试验有效。接种动物未显示有外源病毒感染，则细胞判定为合格。表2动物物体内接接种法检检测外源源病毒因因子动物组要求数量接种途径径细胞浓度度 (个活活细胞/ml)接种细胞胞液量(ml/只)观察天数结果判定定乳鼠24小时时内10(22窝)脑内腹腔1x11070.0110.121应健存成鼠15220g10脑内腹腔1x11070.0330.521应健存鸡胚*9111日龄10尿囊腔1x11070.234尿液血凝凝试验阴性性鸡胚56日日龄10卵黄囊1x11070.55应存活豚鼠35050

17、00g5腹腔1x11075.042应健存，解剖无结结核病变变家兔1.52.55kg5皮下皮内*1x11079.00.1XX1021无异常，健健存* 经尿尿囊腔接接种的鸡鸡胚，在在观察末末期，应应用豚鼠鼠和鸡红红细胞混混合悬液液进行直直接红细细胞凝集集试验。*每只只家兔于于皮内注注射100处每处0.1mll对于新建建细胞系系/株，还还应接种种豚鼠和和家兔（见见表1）。豚豚鼠主要要用于检检查细胞胞内结核核分支杆杆菌，在在注射前前观察44周，结结核菌素素试验为为阴性者者方可用用于试验验。家兔兔主要用用于检测测猴来源源细胞中中是否存存在B病毒污污染，也也可用兔兔肾细胞胞培养法法代替。（4）逆逆转录病病

18、毒及其其他内源源性病毒毒或病毒毒核酸的的检测可采用下下列方法法对MCCB或WWCB细细胞、增增殖到或或超过生生产用体体外细胞胞龄限制制代次的的细胞进进行逆转转录病毒毒的检测测。逆转录录酶活性性测定：采用敏敏感的方方法,如产品品增强的的逆转录录酶活性性测定法法(PEERT)法或其其他灵敏敏度相当当的检测测逆转录录酶的方方法检测测细胞培培养液上上清中逆逆转录酶酶活性。透射电电镜检查查：收集集待检细细胞，低低速离心心后，弃弃上清，沉沉淀中应应含有11107个细胞胞，且细细胞存活活率应不不低于999%。在在沉淀中中加入固固定剂，于于4保存或或直接包包埋后制制备超薄薄切片，置置于铜网网上染色色后透射射电

19、镜观观察。感染性性试验：将待检检细胞感感染逆转转录病毒毒敏感细细胞，培培养后检检测。根根据待检检细胞的的种属来来源，须须使用不不同的敏敏感细胞胞进行感感染性试试验。这三种方方法具有有不同的的检测特特性及灵灵敏度，因因此应采采用不同同的方法法联合检检测。若若逆转录录酶活性性检测阳阳性时，建建议进行行透射电电镜检查查及感染性性试验，以以确证是是否有感感染性逆逆转录病病毒颗粒粒存在。小鼠来源源和其他他啮齿类类来源的的细胞系系或其杂杂交瘤细细胞系有有可能携携带潜在在的逆转转录病毒毒。因此此，对于于人-鼠杂交交瘤细胞胞系则应应进行特特异性逆逆转录病病毒检测测。如用用于单克克隆抗体体生产的的小鼠细细胞系，

20、则则可不检检测特异异性的逆逆转录病病毒，但但在生产产工艺中中应增加加病毒灭灭活程序序。（5）特特殊外源源病毒因因子的检检测应对MCCB或WWCB的的细胞进进行特殊殊病毒的的检测。检检测病毒毒的种类类应根据据细胞系系/株种种属、组组织来源源等确定定。如鼠源的的细胞系系，可采采用小鼠鼠、大鼠鼠和仓鼠鼠抗体产产生试验验检测其其种特异异病毒。人源的细细胞系/株，则则应检测测如人鼻鼻咽癌病病毒、人人巨细胞胞病毒、人人逆转录录病毒、人人乙型肝肝炎病毒毒、人丙丙型肝炎炎病毒。在在某些情情况下，也也可能进进行转化化病毒的的检测，如如人乳头头瘤病毒毒、腺病病毒及人人单纯疱疱疹病毒毒。这些些病毒的的检测可可采用适

21、适当的体体外检测测技术。5致瘤性性检查某些传代代细胞系系已证明明具有致致瘤性，如如来源于于啮齿类类的细胞胞系BHHK211，CHOO，C1227细胞胞等，或或细胞类类型属致致瘤性细细胞，如如杂交瘤瘤细胞，则则可不必必作致瘤瘤性检查查。某些传代代细胞系系已证明明在一定定代次内内不具有有致癌性性，而超超过某代代次则具具有致瘤瘤性，如如VERRO细胞胞，则必必须进行行致瘤性性检查。人上皮细细胞系、人人二倍体体细胞株株及所有有用于活活病毒疫疫苗生产产的细胞胞系/株应进进行致瘤瘤性检查查。另外外，新建建细胞系系/ 株必必须进行行致瘤性性检查。在某些情情况下，用用于人体体细胞治治疗及基基因治疗疗的细胞胞也

22、须进进行致瘤瘤性检查查。将MCBB或WCBB的细胞胞增殖到到或超过过生产用用体外细细胞龄限限制代次次，再进进行致瘤瘤性试验验。”下述两种种致癌性性试验方方法可任任选其一一：裸鼠至至少100只，将细细胞悬浮浮于适量量无血清清培养基基中，使使细胞浓浓度为55107个细胞胞/mll，每只只裸鼠皮皮下或肌肌内注射射0.22ml；同时用用Hella或Hepp-2细胞设设立阳性性对照，阳阳性对照照组至少少10只，每每只注射射0.22ml含含106个细胞；可用人人二倍体体细胞株株作为阴阴性对照照，阴性性对照组组至少110只，每每只注射射0.22ml含含1067个细胞。新生小小鼠(335日龄)，810gg小鼠

23、110只，在在出生后后第0天、2天、7天和第第14天，分分别用00.1mml抗胸胸腺血清清(ATTS)或或球蛋白白处理，然然后同上上每只皮皮下接种种107活细胞胞。并设设立阳性性对照组组，对照照组至少少接种110只。结果判定定： 定期观察察并触摸摸注射部部位有无无结节形形成，且且形成的的任何结结节均应应进行双双向测量量并记录录。 阳性对照照组应至至少有99只有进进行性肿肿瘤生长长时，试试验视为为有效。 如试验组组动物有有进行性性生长的的结节或或可疑病病灶，应应观察至至少12周；若若出现的的结节在在观察期期内开始始消退，则则应在结结节完全全消退前前，处死死动物并并进行解解剖作病病理及组组织学检检

24、查。未发生生结节的的动物半半数应观观察211天，剖剖检，另另外半数数动物应应观察112周，进进行病理理检查，剖剖检接种种部位，观观察各淋淋巴结和和各器官官有无结结节形成成，如有有怀疑，进进行病理理组织检检查，不不应有转转移瘤形形成。除上述体体内法外外，也可可采用软软琼脂克克隆形成成试验或或器官培培养试验验等体外外法检测测，特别别适用于于在低代代次时在在动物体体内无致致瘤性的的传代细细胞系。（四）生生产用细细胞培养养生产用原原材料的的选择和和细胞操操作环境境应符合合本规程程细胞库库的建立立中有关关规定。从冻存的的WCBB中取出出一支或或多支安安瓿，混混合后培培养，传传至一定定代次后后供生产产用。

25、其其代次不不得超过过该细胞胞用于生生产的最最高限定定代次。生产用细胞的最高限定代次应根据研究结果确定，但不得超过国际认可的最高限定代次。从WCB取出的细胞种子增殖的细胞不得再回冻保存后而再用于生产。体外培养养细胞龄龄的计算算二倍体细细胞龄以以细胞群群体倍增增（Poopullatiion Douubliing）计计算，以以每个培培养容器器细胞群群体细胞胞数为基基础，每每增加一一倍作为为一世代代，即一一瓶细胞胞传二瓶瓶(1:2分种种率)，再长长满瓶为为一世代代；一瓶瓶传四瓶瓶(1:4)为为二世代代；一瓶瓶传八瓶瓶(1:8)则则为三世世代。生生产用细细胞龄限限制在细细胞寿命命期限的的前2/3内。传代

26、细胞胞系则以以一定稀稀释倍数数进行传传代，每每传一次次为一代代。二、连续续传代细细胞系的的特殊要要求传代细胞胞系一般般是由人人或动物物肿瘤组组织或正正常组织织传代或或转化而而来，可可悬浮培培养或采采用载体体培养，能能大规模模生产。这这些细胞胞可无限限传代，但但到一定定代次后后，致瘤瘤性会增增强。所所以对生生产用传传代细胞胞系应进进行严格格检查。应应按本规规程细胞的的检定的规定定进行细细胞库的的检查。对对生产过过程中细细胞培养养的要求求如下：1用于于生产的的细胞代代次用于生产产的传代代细胞系系，生产产代次应应有一定定限制。用用于生物物制品生生产的细细胞最高高限定代代次，须须经批准准。2生产产过程

27、中中细胞培培养物检检查：对于病毒毒类制品品，在生生产末期期，应按按照本规规程中的的三.66（2）、（33）、（44）和（55）对生生产对照照用细胞胞进行检检查，并并合格。对对于在不不同时间间收集合合并的培培养物，应应在每次次收集时时检测对对照细胞胞培养物物。三、人二二倍体细细胞株的的特殊要要求新建的人人二倍体体细胞必必须具有有以下资资料：建建立细胞胞株所用用胎儿的的胎龄和和性别、终终止妊娠娠的原因因、所用用胎儿父父母的年年龄、职职业及健健康良好好的证明明（医师师出具的的健康状状态良好好、无潜潜在性传传染病和和遗传性性疾患等等证明），以以及胎儿儿父系及及母系三三代应无无明显遗遗传缺陷陷疾病历历史

28、的书书面调查查资料。人二倍体体细胞株株应在传传代过程程的早期期，选择择适当世世代水平平（2-8世代代）增殖殖出大量量细胞，定定量分装装后，置置液氮中中或130下冻存存，供建建立PCCB之用用，待全全部检定定合格后后，即可可正式定定为PCCB，供供制备MMCB用用。1染色色体检查查及判定定标准新建人二二倍体细细胞株及及其细胞胞库必须须进行染染色体检检查。对对于已建建株的人人二倍体体细胞株株，如WWI-338、MRCC-5、2BSS，KMBB17等等，在建建立MCCB时可可不必进进行细胞胞染色体体检查。但但如对细细胞进行行了遗传传修饰，则则须按新新建细胞胞株进行行染色体体检查。（1）染染色体检检查

29、新细胞建建株过程程中，每每812世代代应作一一次染色色体检查查，一株株细胞整整个生命命期内连连续培养养过程中中，至少少应有44次染色色体检查查结果。每次染色色体检查查，应至至少随机机取10000个个分裂中中期细胞胞，进行行染色体体数目、形形态和结结构检查查，并作作记录以以备复查查。其中中至少选选择500个分裂裂中期细细胞进行行显微照照相，作作出核型型分析，并并应粗数数5000个分裂裂中期细细胞，检检查多倍倍体的发发生率。每次染色色体检查查，应从从同一世世代的不不同培养养瓶中取取细胞，混混合后进进行再培培养，制制备染色色体标本本片。染染色体片片应长期期保存，以以备复查查。可用G分分带或QQ分带技

30、技术检查查50个中中期细胞胞染色体体带型，应应用照相相图片作作出带型型分析。（2）判判定标准准对10000个和和5000个中期期细胞标标本异常常率进行行检查，合合格的上上限(可信限限90% Pooisoon法)如表22。表2人二二倍体细细胞染色色体分析析标准检查细胞胞数异常10000500100染色单体体和染色色体断裂裂47268结构异常常17102超二倍体体852亚二倍体体*1809018多倍体*30174* 亚二二倍体如如超过上上限，可可能因制制片过程程人为地地丢失染染色体，应应选同批批号标本本重新计计数。* 一一个中期期细胞内内超过553条染染色体即即为一个个多倍体体。2 无菌菌检查每8

31、112世代代细胞培培养物，应应进行无无菌检查查， 依依法检查查， 应应符合规规定（附附录XIII AA）。3 支原原体检查查每8112世代代细胞培培养物，应应进行支支原体检检查，依依法检查查， 应应符合规规定（附附录XIII BB）。4 病毒毒检查二倍体细细胞株传传代过程程中，至至少对22个不同同世代水水平进行行病毒包包含体、乙乙型肝炎炎、丙型型肝炎、EB病毒，艾滋病病毒进行检查等，结果应均为阴性。5 致瘤瘤性检查查每8112世代代应作一一次致瘤瘤性检查查，（方方法见本本规程 致瘤性性检查），结结果应无无致癌性性。6生产过过程细胞胞培养检检查（1）染染色体检检查可根据制制品特性性及生产产工艺，

32、确确定是否否进行生生产过程程中细胞胞培养的的染色体体检查。， 通常含含有活细细胞的制制品或下下游纯化化工艺不不足的制制品，应应对所用用细胞培培养进行行染色体体检查及及评价。（见见本规程程 染色体体检查及及判定标标准）但如如采用已已建株的的人二倍倍体细胞胞生产，则则不要求求进行染染色体核核型检查查。（2）细细胞鉴别别试验按本规程程 细胞检检定中细胞胞鉴别试试验进行行。对于于每个制制品生产产用细胞胞每年应应至少进行行一次该项项检定。（3）无无菌检查查依法检查查，应符符合规定定（附录录XIII A）。（4）支支原体检检查依法检查查，应符符合规定定（附录录XIII B）。（5）正正常细胞胞外源病病毒因

33、子子检测制备病毒毒类制品品时，于于接种病病毒的当当天或在在连续传传代的最最后一次次接种病病毒时，留留取此批批细胞的的5%(或或不少于于5000ml)的细胞胞不接种种病毒，换换维持液液作为正正常细胞胞对照。与与接种病病毒的细细胞在相相同条件件下培养养，并按按附录C生产产用细胞胞外源因因子检查查项进行行检测。四、重组组细胞的的特殊要要求重组细胞胞系通过过DNAA重组技技术获得得的含有有特定基基因序列列的细胞胞系，因因此重组组细胞系系的建立立应具有有细胞基基质构建建方法的的相关资资料，如如细胞融融合、转转染、筛筛选、集集落分离离、克隆隆、基因因扩增及及培养条条件或培培养液的的适应性性等方面面的资料料

34、。细胞胞库细胞胞的检查查应按本本规程细胞的的检定的规定定进行，但但还应进进行下述述检查：1 细胞胞基质的的稳定性性生产者须须具有该该细胞用用于生产产的目的的基因的的稳定性性资料，包包括：重重组细胞胞的遗传传稳定性性、目的的基因表表达稳定定性、目目的产品品持续生生产的稳稳定性，以以及一定定条件下下保存时时细胞生生产目的的产品能能力的稳稳定性等等资料。2 鉴别别试验除按本规规程细胞鉴鉴别试验验进行外外，还应应通过检检测目的的蛋白基基因或蛋蛋白进行行鉴别试试验。3 重组组细胞产产物的外外源病毒毒因子检检测应按本规规程细胞形形态观察察及红细细胞吸附附试验和不同细细胞传代代培养法法检病毒毒因子的要求对对

35、细胞裂裂解物或或收获液液及生产产用培养养基进行行外源病病毒因子子的检测测。五、原代代细胞的的要求原代细胞胞应来源源于健康康的动物物脏器组组织或胚胚胎，包包括猴肾肾、地鼠鼠肾、沙沙鼠肾、家家兔肾、狗狗肾或动动物的胎胎儿和其其他组织织以及鸡鸡胚和鹌鹌鹑胚等等正常组组织，以以适当的的消化液液消化、分分散组织织细胞进进行培养养，原代代细胞不不能建立立细胞库库，只能能限于原原始培养养的细胞胞或传代代少数几几代内（一一般1-5代内内）使用用，无法法事先标标定。因因此，只只能严格格规范管管理和操操作措施施，以保保证以原原代细胞胞为基质质所生产产的制品品质量。（一）动动物组织织来源和和其他材材料1动物物组织来

36、来源应符合“凡例”的有关关要求。对对各种动动物都应应有明确确健康状状况和洁洁净级别别要求。2生产产或检定定用猴多采用非非洲绿猴猴、恒河河猴等，我我国以恒恒河猴为为主。应应为正常常健康猴猴，以笼笼养或小小群混养养。动物物用于制制备细胞胞前，应应有6周以上上的检疫疫期，检检疫期中中出现病病猴或混混入新猴猴，应重重新检疫疫。从外外面新引引入猴群群应作结结核菌素素试验及及猴疱疹疹I型病毒毒(B病毒毒)的检查查。胎猴肾可可用于生生产，对对其母猴猴应进行行检疫。（二）原原代细胞胞培养物物的检查查用于细胞胞制备的的动物剖剖检应正正常，取取留的器器官组织织亦应正正常，如如有异常常，不能能用于制制备细胞胞。1细

37、胞胞培养原原材料检检查及细细胞培养养操作按按本规程程原材料料的选择择及细胞培培养操作作的环境境要求进行。2细胞胞培养物物的检查查（1）细细胞形态态检查细胞在接接种病毒毒或用于于生产前前，其培培养物均均应进行行外观检检查和镜镜检，应应无任何何可疑、异异常和病病变，否否则不得得用于生生产。（2）对对照细胞胞检查每批消化化所得原原代细胞胞留取55%(或至少少5000ml)悬液，不不接种病病毒，细细胞浓度度和处理理均与生生产制品品过程相相同，至至少观察察14天，并并作下列列各项检检查，结结果均应应为阴性性。无菌检检查依法检查查，应符符合规定定（附录录XIII A）。支原原体检查查依法检查查，应符符合规

38、定定（附录录XIII B）。外源病病毒污染染的检查查 对观察察到期的的细胞，按按本规程程4（11）项细胞形形态观察察及血吸吸附试验验和4（22）项不同细细胞传代代培养法法检测病病毒因子子项进行行外源病病毒污染染检测。原代代细胞培培养物特特定病毒毒检查原代猴肾肾细胞培培养应检检查SVV40病病毒、猴猴艾滋病病毒和BB病毒。应应用Veero或或原代绿绿猴肾细细胞、兔兔肾细胞胞检查。地地鼠肾原原代细胞胞应用BBHK221细胞胞培养检检查，观观察细胞胞形态，如如有可疑疑应在同同种细胞胞上盲传传一代继继续观察察。六、检定定用细胞胞的要求求：检定用细细胞是指指用于生生物制品品制造过过程中检检定所使使用的细

39、细胞，包包括原代代细胞、连连续传代代细胞或或二倍体体细胞，也也有的是是经过特特定基因因修饰过过的细胞胞。检定定用细胞胞的质量量将会对对检定结结果的判判定具有有重要的的影响，因因此，为为保证检检定结果果的有效效性、可可靠性及及真实性性，国家家药品检检定检定定机构和和生物制制品生产产企业检检定部门门所用的的检定用用细胞应应符合下下列要求求。（一）细细胞资料料：1、 检定用细细胞应有有明确的的合法来源源，并具具有相关关的来源源证明资资料。 2、 如使用传传代细胞胞系/株株，应建建立细胞胞库体系系，即主主细胞库库及工作作细胞库库，如细细胞使用用量较少少，可建建立单一一细胞库库。应根根据供试试品的特特性

40、在确保检检测结果果可靠的的基础上上，在允允许的最最高限定定代次内内，规定定相应检检定用细细胞的代代次范围围， 应应为规定定代次的的1代。检定时时从工作作细胞库库复苏的的细胞，不不能再回回冻保存存。3、 应详细记记录检定定用细胞胞建库的的过程，包包括细胞胞培养所所用原材材料的来来源、批批号， 细胞生生长液的的配制方方法、使使用浓度度等，记记录细胞胞的传代代及冻存存过程，并并建立细细胞冻存存及使用用台账。（二）细细胞检定定：生物制品品检定用用细胞应应至少进进行以下下1-33项检定定， 根根据检定定用细胞胞用途的的不同， 还应按按照4项项下的有有关要求求进行相相关的检检定。1、细胞胞鉴别试试验按本规

41、程程一（三三）1项项进行，或或其他相相适应的的方法，应应确认为为本细胞胞而无其其他细胞胞的交叉叉污染。2、无菌菌检查依法检查查， 应应符合要要求（附附录XIII AA）。3、支原原体检测测依法检查查， 应应符合要要求（附附录XIII BB）。4. 外外源病毒毒污染检检查用于待检检样品外外源病毒毒污染检检查所用用的细胞胞，应采用用本规程程一（三三）4（22）项及及4（33）项鸡鸡胚接种种检查，应应无外源源病毒污污染。5、其他他检测：（1）致致瘤性检检查：对于待检检样品致致瘤性检检查时所所用的阳阳性对照照细胞，应采用用本规程程一（三三）5项项进行检检查，应应具有致致瘤性。（2）病病毒敏感感性检查查：用于病毒毒类待检检样品病病毒效价价测定的的检定用用细胞，应应进行病病毒敏感感性检查查，证明明所用细细胞具有有足够的的相应病病毒敏感感性。（3）细细胞功能能检查：用于待检检样品生生物学活活性、效效力或效效价测定定的检定定用细胞胞，应进进行此项项检查，证证明所用用细胞能能够有效效评价待待检样品品质量。