基因工程实验须知2615.docx

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1、基因工程程实验须须知一、每次次实验前前必须预预习实验验内容，了了解实验验的基本本原理、操作步步骤，禁禁止不预预习就做做实验。二、每次次实验必必须做好好实验记记录,每次实实验完成成后，根根据记录录写出实实验报告告。三、实验验所得结结果，如如不再供供下一次次实验用用，应交交给指导导教师，并并注明名名称、数数量、组组别、姓姓名等。四、实验验室应经经常保持持整洁、桌面上上不要乱乱放与本本次实验验无关的的书籍、仪器、药品。火柴头头、废纸纸、废液液等应放放入废液液桶中。倒入水水槽中的的废液（无无污染的的）立即即放水冲冲掉。五、爱护护仪器、节约药药品。仪仪器损坏坏后应立立即报损损，并按按规定赔赔偿。六、试验

2、验、药品品、公用用器具使使用后应应立即放放回原处处，注意意不要调调错试剂剂瓶塞或或滴管,以免污污染药品品。七、实验验室必须须安静，不不得阅读读与本次次实验无无关的书书籍：禁禁止吸烟烟及吃食食物。八、根据据实验记记录，及及时完成成实验报报告，不不按时交交报告者者，不予予记录实实验成绩绩。九、实验验完毕，值值日生应应将实验验室打扫扫干净，关关好水、电、门门、窗，离离开实验验室时，检查一遍，以免发生事故，确保安全。实验一 植物物基因组组DNAA提取目的：了解植物物细胞的的特点，掌掌握植物物基因组组DNAA分离、纯化的的原理。原理：用植物基基因组DDNA提提取液处处理研磨磨、收集集后的样样品，提提取液

3、中中的乙二二胺四乙乙酸二钠钠（EDDTA）能能螯合金金属离子子，以防防止破碎碎细胞的的脱氧核核糖核酸酸酶对DDNA的的降解作作用，而而细胞破破碎液中中的蛋白白酶K在在37温浴过过程中还还能降解解蛋白质质，从而而减少了了蛋白质质对DNNA的污污染。然然后用CCTABB处理，在在特定的的盐浓度度下，CCTABB使基因因组DNNA处于于溶解状状态，而而蛋白质质仍为沉沉淀。经经细胞破破碎液获获得的DDNA粗粗提取液液再用酚酚、氯仿仿、异戊戊醇处理理，其中中酚是高高效的蛋蛋白变性性剂，可可进一步步将蛋白白、脂类类和细胞胞碎片去去掉，然然后用氯氯仿、异异戊醇处处理，一一方面可可达到去去蛋白的的目的，另另一

4、方面面还可去去除残留留的酚。一、 材料植物的根根、茎、叶。二、 设备移液管，高高速冷冻冻离心机机，台式式离心机机，水浴浴锅。三、 试剂1、 CTABB或Naacl溶溶液：44.1克克NaCCl溶解解于800ml水水，缓慢慢加入110克CCTABB，加水水至1000mll。2、 其它试剂剂：氯仿仿、异戊戊醇（224：11），酚酚：氯仿仿：异戊戊醇（225：224：11），异异丙醇，TTE，110%SSDS，蛋蛋白酶KK（200mg/ml），55moll/LNNaCll。四、 操作步骤骤1、 选新鲜无无病虫害害的叶片片用自来来水冲洗洗吸干，用用蒸馏水水洗两次次，然后后用超纯纯水洗一一遍，吸吸干，剪

5、剪碎称00.5-0.225克。2、 将所取材材料放入入预冷的的研钵（研研钵提前前要灭菌菌），研研成粉末末后置于于7mll离心管管内（可可以换为为将样品品放置到到7mll离心管管中8000ull后用用玻棒捣捣碎）。3、 加入2.4mll 655预热热的CTTAB，充充分混合合后655水浴浴90mmin以以上，冷冷却到室室温，加加入等体体积氯仿仿异戊醇醇（244：1），轻轻轻颠倒倒混匀44离心心60000g10mmin，取取上清加加入2/3体积积的-200预冷的的异丙醇醇轻轻混混匀，-20度放置置20mmin，4离心50000gg5miin，去去上清。4、 再沉淀中中加入00.6mml的65 CT

6、TAB温温育30mmin，待沉淀充充分溶解解，加入入等体积积氯仿异异戊醇充充分混匀匀，4离心60000gg5miin，去去上清加加入2/3体积积的-220预冷的的异丙醇醇，轻轻混混匀-220放置200minn。4离心50000gg5miin，去去上清。5、 用70%乙醇清清洗沉淀淀两次，真真空抽干干，加入入2000l TTE溶解解DNAA后置于于4备用6、 提示：酚、氯仿仿、异戊醇醇的作用用：酚与氯仿仿是非极极性分子子，水是是极性分分子，当当蛋白水水溶液与与酚或氯氯仿混合合时，蛋蛋白质分分子之间间的水分分子就被被酚或氯氯仿挤去去，使蛋蛋白质失失去水合合状态而而变性。变性蛋蛋白质的的密度比比水的

7、密密度大，经过离心与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开，而酚与氯仿有机溶剂比重大，保留在最下层。作为表面面变性剂剂的酚与与氯仿，在在去除蛋蛋白质的的作用中中，各有有利弊。酚的变变形作用用大，但但酚与水水能有一一定程度度的互溶溶，因而而损失了了这部分分水相中中的DNNA。氯氯仿的变变形作用用不如酚酚效果好好，但氯氯仿不与与水相容容，不会会带走DDNA，所所以在抽抽提过程程中，混混合使用用酚与氯氯仿效果果最好。经酚第第一次抽抽提后的的水相中中有残留留的酚，由由于酚与与氯仿是是互溶的的，可用用氯仿第第二次变变性蛋白白质，此此时一起起将酚带带去。也也可以在在第二次次抽提时时将氯仿

8、仿与酚混混合(11:1)使用。异戊醇能能降低分分子表面面的张力力，可以以减少抽抽提过程程中的泡泡沫产生生，同时时异戊醇醇有助于于分相，使使离心后后的上层层水相，中中层变性性蛋白相相及下层层有机溶溶剂相维维持稳定定。实验二 基因的的PCRR扩曾反反应（聚聚合酶链链式反应应）目的：学习PCCR反应应的基本本原理及及相关实实验技术术原理：聚合酶链链式反应应（PCCR，ppolyymerrasee chhainn reeacttionn）实质质是体内内DNAA复制的的体外模模拟。当当双链DDNA变变性为单单链以后后，DNNA聚合合酶以单单链DNNA为模模版，并并利用反反应混合合物中的的四种ddNTPP

9、，以与与模板互互补的寡寡聚核苷苷酸链为为引物，合合成新的的DNAA互补链链。新合合成的DDNA链链的起点点，由加加入在反反应混合合物中的的一对寡寡聚核苷苷酸引物物在模板板DNAA链两端端的结合合点决定定，经过过PCRR的循环环即模板板DNAA变性为为单链、引物与与模板退退火（杂杂交）、DNAA合成三三步骤的的反复重重复，最最后，两两条引物物结合位位点之间间的DNNA区段段的拷贝贝数在理理论上可可扩增达达2n，使特特定的DDNA区区段得到到迅速、大量的的扩增。经过330335个循循环，可可将2kkb的DDNA从从1pgg扩增到到0.55-1g，能能够通过过琼脂糖糖凝胶电电泳检测测出来。转基因植植

10、物由于于含有目目的基因因，当用用针对目目的基因因来说为为特异的的一对寡寡聚核苷苷酸链作作为引物物，对其总总DNAA作PCCR时，可可以得到到特异性性产物（目目的基因因），而而非转基基因植物物的总DDNA不不会扩增增出特异异性产物物。一、 材料待扩增的的基因样样品二、 设备基因扩增增仪(PPCR仪仪)，台台式离心心机，电电泳仪，紫紫外监测测仪三、 器皿微量移液液器，微微量离心心管（00.5mml），微微量吸头头（Tiip头），电电泳槽四、 试剂Taq酶酶，dNNPT，110Taqq酶buuffeer，特特异寡聚聚核苷酸酸引物（pprimmer），模模板DNNA，无无菌去离离子水，无无菌矿物物质油

11、，琼琼脂糖，溴溴酚兰指指示剂。五、 方法1、 在0.55ml无菌菌Epppenddorff管中，分分别以被被检测植植物的总总DNAA、阴性性对照、阳性对对照DNNA为模模板，进进行PCCR扩增增反应，并并设置两两个空白白对照：没有DDNA和和没有引引物的。向各管中中依次加加入下列列试剂（总总的反应应体积为为50l）：无菌去离离子水 333322l1xTaaq缓冲冲液 5ldNTPP（各22.5mmmoll/l） 5l 引物R（220pmmol/l） 22.5l引物F（220pmmol/l） 2.5ll模板DNNA 112l（含含质粒DDNA00.0110.1gg或含植植物总DDNA00.055

12、0.5gg） 将以上上各试剂剂（Taaq酶除除外）混混匀后于于94变性110miin，取取出离心心管，快快速离心心几秒钟钟，使冷冷凝于管管盖上的的液体回回到管底底部，再再加入11lTTaqDDNA聚聚合酶（约约233U），混匀后后吸取少少量灭菌菌的矿物物质油覆覆盖于页页面上。使用待待加热帽帽的PCCR仪时时不必家家矿物油油。2、设置置PCRR的循环环程序，以以下循环环参数可可作为参参考：98预预变性22minn；944变性330660s；5357退火1mmin；72延伸112mmin，循循环255355次后，772延伸110miin（以以保证扩扩增出来来的片段段都是全全长的），扩扩增反应应完全

13、后后，取样样品反应应液550l，用用合适的的琼脂糖糖凝胶电电泳检测测扩增的的结果并并照相。提示：1、防止止污染：由于PCCR反应应的高灵灵敏性，所所以在操操作中要要严防环环境DNNA污染染，全部部器皿均均要求灭灭菌，最最好戴一一次性手手套进行行操作，矿矿物油要要分装，一一次用一一支。为防止止交叉污污染，最最好所有有PCRR试剂都都事先分分装成小小份备用用。装有有PCRR试剂的的微量离离心管打打开之前前，应先先在离心心机上作作瞬时离离心，这这样可减减少污染染机会。一般最最后加模模板DNNA，且且加样时时忌形成成喷雾，所所有非即用用管都应应盖严。只要有有可能，就就应设置置阳性对对照（即即由少量量适

14、当的的靶序列列参与的的PCRR）和一一个空白白对照（不不含模板板DNAA的PCCR），以以检测PPCR反反应系统统是否正正常。2、反应应系统组组成（1）引引物在PPCR中中的浓度度常是11mool/L，这这一浓度度足以完完成300个循环的的扩增反反应，更更高浓度度可能导导致出现现意外的的非靶序序列的的的扩增。如果引引物的浓浓度不足足，则PPCR的的效率极极低。（2）TTaqDDNA聚聚合酶催催化以典典型的PPCR反反应所需需酶量约约为2UU。酶量量少，扩扩增效率率低；酶酶过量，则则可能导导致非靶靶序列的的扩增。（3）ddDNAA系在饱饱和浓度度（每种种dDNNA200moolLL）下使使用。（

15、4）靶靶序列：含有靶靶序列的的DNAA以单链链或双链链形式加加入到PPCR混混合液中中。闭环环靶序列列DNAA的扩增增效率略略低于线线状DNNA，因因此用质质粒作反反应模板板时最好好先将其其线状化化。模板板DNAA中靶序序列的浓浓度因情情况而异异，可按按已知靶靶序列量量递减（11ng，00.1nng，00.011ng等等）的方方式设置置一组对对照反应应，以检检测扩增增反应的的灵敏度度是否符符合要求求。3、一般般来说，模模板的作作用量越越多，PPCR的的效率相相对也高高一些，但但有一定定的限制制，特别别是在模模板DNNA质量量不太好好，杂质质含量比比较多时时，模板板增多反反而会影影响PCCR的结

16、结果。4、若PPCR产产物呈降降解片段段首先减减少模板板DNAA用量。5、PCCR产物物非特异异性条带带较多应应首先提提高退火火温度，其其次减少少引物的的用量。有时可可以用首首次PCCR的产产物为模模板进行行再次PPCR以以得到专专一的特特异性条条带。实验三 碱法法小量制制备重组组质粒目的：掌握最常常用的提提取重组组质粒的的方法。原理：从大肠杆杆菌细胞胞中分离离质粒DDNA的的方法很很多。其其分离可可依据分分子大小小不同、碱基组组成的差差异以及及质粒DDNA的的超螺旋旋共价闭闭合环状状结构的的特点来来进行。目前常常用的有有碱变性性提取法法，羧基基磷灰石石柱层析析法、质质粒DNNA释放放法、两两

17、相法等等。其中中碱变性性法提取取效果良良好，既既经济且且收得率率较高，提提取到的的质粒DDNA可可用于酶酶切、连连接与转转化。碱变性抽抽取质粒粒DNAA是基于于染色体体DNAA于质粒粒DNAA的变形形与复性性的差异异而达到到分离的的目的。在pHH高达112.66的碱性性条件下下，染色色体的氢氢键断裂裂，双螺螺旋结够够解开而而变性。质粒DDNA的的大部分分液断裂裂，但超超螺旋共共价闭合合环状结结构的两两条互补补链不会会完全分分离，当当以pHH4.88的NaaAC高高盐缓冲冲液调节节其pHH值至中中性时，变变性的质质粒DNNA又恢恢复到原原来的构构型，保保存在溶溶液中，而而染色体体DNAA不能复复

18、性而形形成的缠缠连得网网状结构构。通过过离心，染染色体DDNA与与不稳定定的大分分子RNNA、蛋蛋白质-SDSS复合物物等一起起沉淀下下来而被被除去。一、 材料LB培养养基上生生长的菌菌落二、 设备振荡培养养箱、微微量离心心管、台台式高速速离心机机、恒温温高速离离心机、冰箱、微型电电泳槽三、 试剂准备备1、 溶液：50mmM葡萄萄糖，225mMM Trris-HCll（pHH8.00），110mMM EDDTA（ppH8.0）。1MTTriss-HCCl（ppH8.0） 12.5mll，0.5M EDTTA（ppH8.0）110mll，葡萄萄糖4.7300g，加加ddHH2O至5500mml。

19、高高温高压压灭菌115miin，贮贮存于44。2、 溶液：0.22N NNaOHH 1mml，110%SSDS 1mll，加dddH22O至110mll。使用用前临时时配置。3、 溶液：醋酸钾钾（KAAc）缓缓冲液（ppH4.8）。5M Kacc 3000mll，冰醋醋酸577.5mml，加加ddHH2O至5500mml、44保存备备用。4、TEE：100mM Triis-HHCl（ppH8.0），1mM EDTA （pH8.0）。1M Tris-HCl（pH8.0）1ml，0.5M EDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压湿热灭菌20min，4保存备用。5、苯酚酚/氯

20、仿仿/异戊戊醇（225：224：11）6、乙醇醇（无水水乙醇、70%乙醇）7、5TBEE：Trris碱碱54gg，硼酸酸27.5g，EEDTAA-Naa222H2OO4.665g，加加ddHH2O至至10000mll。高压湿热热灭菌220miin，44保存备备用。8、溴化化乙锭（EEB）：10mmg/mml9、Rnnasee A（RRNA酶酶 A）：不含DDNA酶酶（Dnnasee-frree）RRnasse AA的100mg/ml，TTE配置置，沸水水加热115miin，分分装后贮贮存于-20。10、66loaadinng bbufffer（上上样缓冲冲液）：0.225%溴溴酚蓝，00.25

21、5%二甲甲苯青FFF，440%（WW/V）蔗蔗糖水溶溶液。11、11% 琼琼脂糖凝凝胶：称称取0.2g琼琼脂糖于于三角烧烧瓶中，加加20mll 1TAEE，微波炉炉加热至至完全溶溶化，冷冷却至660左右，加加EB母母液（110mgg/mll）至终终浓度00.5g/mml（注注意：EEB为强强诱变剂剂，操作作时带手手套），轻轻轻摇匀匀。缓缓缓倒入架架有梳子子的电泳泳胶板中中，勿使使有气泡泡，静置置冷却330miin以上上，轻轻轻拔出梳梳子，放放入电泳泳槽中（电电泳缓冲冲液1TAEE），即可上上样。四、操作作步骤1、挑取取LB固固体培养养基上生生长的单单菌落，接接种于22.0mml LLB（含含相

22、应抗抗生素）液液体培养养基中，37、250rpm振荡培养过夜（约1214hr）。2、取11.5mml培养养物放入入微量离离心管中中，室温温离心880000g1miin，弃弃上清，将将离心管管倒置，将将液体尽尽可能流流尽。3、将细细菌沉淀淀重悬于于1000l预预冷的溶溶液中，剧剧烈振荡荡，使菌菌体分散散均匀。4、加2200l新鲜鲜配制的的溶液，颠倒倒数次混混匀（不不要剧烈烈振荡），并并将离心心管放置置于冰上上233minn，使细细胞膜裂裂解（溶溶液为裂解解液，故故离心管管中菌液液逐渐变变清）。5、加入入1500l预预冷的溶溶液，将管管温和颠颠倒数次次混匀，见见白色絮絮状沉淀淀，可在在冰上放放置3

23、5miin。溶溶液为中和和溶液，此此时K+使SDDS-蛋蛋白复合合物沉淀淀。6、加入入4500l的的苯酚/氯仿/异戊醇醇，振荡荡均匀，4离心12000g10min。7、小心心移出上上清于一一新微量量离心管管中，加加入2.5倍体体积预冷冷的无水水乙醇，混混匀，室室温放置置255minn，4离心1120000g15mmin。8、1mml预冷冷的700%乙醇醇洗涤沉沉淀12次，4离心8000g7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。9、沉淀淀溶于220ll TEE（含RRNasse AA20g/mml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存备用。提示：1、实验验安排：碱变性性法抽提提质粒DD

24、NA，除除了菌体体培养、质粒扩扩增金额额和收集集菌体外外，其提提取过程程大致可可分为三三个步骤骤：从染染色体DDNA中中分离质质粒DNNA，这这是提取取过程中中最关键键的操作作步骤;去除质质粒DNNA中的的RNAA;进一一步纯化化质粒DDNA，去去除蛋白白质等杂杂质。2、一些些试剂的的生化作作用原理理（1）溶溶液溶霉菌：水解菌菌体细胞胞壁的主主要化学学成分肽肽聚糖中中的-1,4糖苷苷键，因因而具有有溶菌作作用。葡萄糖：增加溶溶液的粘粘度，防防止DNNA受机机械剪切切力作用用而降解解。EDTAA：金属离离子螯合合剂，螯螯合Mgg2+，Ca2+等金属属离子，抑抑制脱氧氧核糖核核酸酶（DDNasse

25、）对对DNAA的降解解作用（DDNasse 作作用时需需要一定定的金属属离子强强度作辅辅基），同时EEDTAA的存在在，有利利于溶霉霉菌的作作用。因因为溶霉霉菌的反反应要求求有较低低的离子子强度环环境。（2）溶溶液-NaaOH-SDSS液NaOHH：核酸在在pH值值为59的溶溶液中是是最稳定定的，但但pH大大于122或小于于3时，就就会引起起双键之之间氢键键的解离离而变性性。在溶溶液中的NNaOHH浓度为为0.22N，加加入提取取液时，该该系统的的pH就就会高达达12.6，因因而促使使染色体体DNAA与质粒粒DNAA的变性性。SDS：为阴离离子表面面活性剂剂，主要要功能有有：溶解解细胞膜膜上的

26、脂脂肪与蛋蛋白，从从而破坏坏细胞膜膜；解聚细细胞中的的核蛋白白SDSS蛋白质质结合为为复合物物，使蛋蛋白变性性沉淀下下来，但但SDSS能抑制制核糖核核酸没的的作用，所所以在以以后的提提取过程程中，必必须把它它去除干干净，以以防用RRNasse去除除RNAA时受到到干扰。（3）溶溶液-3MM KAAc（ppH4.8）溶溶液：KAc的的水溶液液呈碱性性，为了了调节ppH至44.8，必必须加入入大量的的冰醋酸酸，所以以该溶液液实际上上是KAAc-HHAc的的缓冲液液。用ppH4.8的KKAc溶溶液是为为了把ppH122.6的的抽取液液pH调调回到中中性，使使变性的的质粒DDNA能能够复性性，并能能稳

27、定存存在。而而高盐的的3moolLL KAAc有利利于变性性的大分分子染色色体DNNA、RRNA以以及SDDS-蛋蛋白质复复合物凝凝聚而沉沉淀之。前者是是因为中中和核酸酸上的电电荷。减减少相斥斥力而互互相聚合合，后者者是因为为钠盐与与SDSS-蛋白白质复合合物作用用后，能能形成溶溶解度较较小的钠钠盐形式式复合物物，使沉沉淀完全全。（4）为为什么用用无水乙乙醇沉淀淀DNAA:此为实验验中最常常用的沉沉淀方法法。乙醇醇的优点点是低度度极性，可可以以任任意比例例和水相相混容，乙乙醇与核核酸不会会起任何何化学反反应，对对DNAA很安全全，因此此是理想想的沉淀淀剂。DNA溶溶液时以以水合状状态稳定定存在

28、的的DNAA，当加加入乙醇醇时，乙乙醇会夺夺去DNNA周围围的水分分子，使使DNAA失水而而易于聚聚合。一一般实验验中，是是加2倍倍体积的的无水乙乙醇与DDNA相相混合。其乙醇醇的最终终含量占占67%左右。因而也也可改用用95%乙醇来来代替无无水乙醇醇（因无无水乙醇醇价格更更贵），但但加955%乙醇醇使总体体积增大大，而DDNA在在溶液中中总有一一定程度度的溶解解，因而而DNAA损失也也增大，尤尤其用多多次乙醇醇沉淀时时，会影影响收得得率。折折衷的做做法是初初次沉淀淀DNAA是可用用95%乙醇代代替无水水乙醇，最最后的沉沉淀步骤骤要使用用无水乙乙醇。也也可以用用异丙醇醇选择性性沉淀DDNA，一

29、一般在室室温下放放置155300minn即可。使用乙醇醇在低温温条件下下沉淀DDNA，分分子运动动大大减减少，DDNA易易于聚合合而沉淀淀，且温温度越低低，DNNA沉淀淀得越快快。（5）RRNasse处理理核糖核核酸后，再再次沉淀淀DNAA时为什什么一定定要加NNaAcc至最浓浓度达00.10.225M。在pH88左右的的DNAA溶液中中，DNNA分子子是带负负电荷的的，加一一定浓度度的NaaAc，使使Na+中和DDNA分分子上的的负电荷荷，减少少DNAA分子之之间的同同性电荷荷相斥力力，易于于互相聚聚合而形形成DNNA纳盐盐沉淀。当加入入大量盐盐溶液浓浓度太低低时，只只有部分分DNAA形成D

30、DNA钠钠盐聚合合，这样样就造成成DNAA沉淀不不完全。当加入入的盐溶溶液浓度度太高时时，其效效果也不不太好，在在沉淀的的DNAA中，由于于过多的的盐杂质质存在，影影响DNNA的酶酶切等反反应，必必须要进进行洗涤涤或重沉沉淀。（6）为为什么将将DNAA保存于于TE缓缓冲液中中？在基因操操作实验验中，选选择缓冲冲液的主主要原则则是考虑虑DNAA的稳定定性及缓缓冲液成成分不产产生干扰扰作用。磷酸盐盐缓冲系系统（ppKa22=7.2）、硼酸系系统（ppKall=9.24）等等虽然也也都符合合细胞内内环境的的生理范范围（ppH），可可以作为为DNAA的保存存液，但但在转化化实验时时，磷酸酸根将与与Ca

31、22+产生生沉淀；在DNNA酶反反应时，不不同的煤煤对辅助助因子的的种类及及数量要要求不同同，有的的要求高高盐离子子浓度，有有哦则要要求低盐盐离子浓浓度，采采用Trris-HCLL（pKKa=88.0）的的缓冲系系统，由由于缓冲冲对时TTriss+/Triis，不不存在金金属离子子的干扰扰作用，故故在提取取或保存存DNAA时，大大都采用用Triis-HHCL系系统，而而TE缓缓冲液中中的EDDTA更更能稳定定DNAA的活性性。操作要领领：1、该实实验成功功的标志志是把染染色体DDNA，蛋蛋白质与与RNAA去除干干净。获获得一定定收得率率的质粒粒DNAA。去掉掉染色体体DNAA最为重重要，也也较

32、困难难。因为为在全部部提取过过程中，只只有一次次机会去去除染色色体DNNA，其其关键步步骤是加加入溶液液与溶液液时，控控制变性性与复性性操作时时机，既既要使试试剂与染染色体DDNA充充分作用用使之变变性；又要使使染色体体DNAA不断裂裂成小片片段而能能与质粒粒DNAA相分离离。这就就要求试试剂与溶溶菌液充充分摇匀匀。摇动动时用力力适当。一般加加入SDDS后要要注意不不能过分分用力振振荡，但但又必须须让它反反应充分分。2、当加加入溶液液5minn后，若若没有看看到溶液液变稠时时，实验验不能再再继续做做下去了了。3、配置置试剂时时，要用用重蒸水水配置外外，其器器皿必须须严格清清洗，最最后要用用重蒸

33、水水冲洗三三次，凡凡可以进进行灭菌菌的试剂剂与用具具都要经经过高压压蒸汽灭灭菌，防防止其他他杂质或或酶对DDNA的的降解，对对Ep管管、Tipp头与非非玻璃离离心管等等只能湿湿热灭菌菌，然后后放置在在50温箱中中烘干使使用。4、用乙乙醇沉淀淀DNAA时，要要观察水水相与乙乙醇之间间没有分分层现象象之后，才才可放在在冰箱中中去沉淀淀DNAA。实验四 DNNA的重重组连接接目的：了解T44DNAA连接酶酶的几种种生物学学功能及及用途；学习在在T4DDNA连连接酶的的作用下下，载体体与目的的基因的的几种不不同的连连接方式式以及在在标准的的连接反反应体系系中，质质粒载体体和插入入的外源源DNAA的比率

34、率关系和和各自的的用量；掌握用用Pmdd18-Tveectoor与PPCR产产物进行行T-AA克隆的的机理及及其应用用。原理： 外源源DNAA片段和和线状质质粒载体体的连接接，也就就是在双双链DNNA5-磷酸酸可生成成4个新新的磷酸酸二酯键键。但如如果质粒粒DNAA已去磷磷酸化，则则吸能形形成2个个新的磷磷酸二酯酯键。在在这种情情况下产产生的两两个杂交交分子带带有2个个单链切切口，当当杂交体体导入感感受态细细胞后可可被修复复。相邻邻的5-磷酸酸和3-羟基基间磷酸酸二酯键键的形成成可在体体外由两两种不同同的DNNA连接接酶催化化，这两两种酶就就是大肠肠杆菌DDNA连连接酶和和T4噬噬菌体DDNA

35、连连接酶。实际上上在有克克隆用途途中，TT4噬菌菌体DNNA连接接酶都是是首选的的用酶。这是因因为在下下述反应应条件下下，它就就能有效效地将平平端DNNA片段段连接起起来。DDNA一一端与另另一端的的连接可可认为是是双分子子反应，在在标准条条件下，其其反应速速度完全全由互相相匹配的的DNAA末端的的浓度决决定。不不论末端端位于同同一DNNA分子子（分子子内连接接）还是是位于不不同分子子（分子子间连接接），都都是如此此。现考考虑一种种简单的的情况，即即连接混混合物中中只含有有一种DDNA，也也就是用用可产生生粘端的的单个限限制酶切切割制备备的磷酸酸化载体体DNAA，再加作作用的底底物。如如果反应

36、应中DNNA浓度度低，则则配对的的两个末末端同一一DNAA分子的的机会较较大（因因为DNNA分子子的一个个末端找找到同一一分子的的另一末末端的概概率要高高于找到到不同DDNA分分子的末末端的概概率）。这样，在在DNAA浓度低低时，质质粒DNNA重新新环化将将卓有成成就。如如果连接接反应中中DNAA浓度有有所增高高，则在在分子内内连接反反应发生生以前，某某一个DDNA分分子的末末端碰到到另一DDNA分分子末端端的可能能性也有有所增大大。因此此在DNNA浓度度高时，连连接后的的初产物物将是质质粒二聚聚体和更更大一些些的寡聚聚体。一、 材料载体DNNA二、 仪器离心机、离心管管、恒温温水浴箱箱等三、

37、 试剂10BBufffer、无水乙乙醇、33moll/L NaAAc、775%的的乙醇、1TTE溶液液、T44连接酶酶四、 方法1、酶切切反应对质粒DDNA的的鉴定，只只不过是是质粒DDNA换换为载体体DNAA。若大大量酶切切，则成成比例增增加。A、 在0.55ml Epppenddorff管中加加重蒸水水6ll10Buffferr 1l酶11l混混匀，337CC水浴11h以上上。B、 取反应物物点样，观观察酶切切效果。C、 酶切完全全后，770CC 5mmin终终止反应应。2、加22倍体积积的预冷冷无水乙乙醇和11/100体积的的3mool/LL NaaAc混混匀，-20C2hh以上。3、离

38、心心150000rrpm15mmin,弃上清清。4、加入入75%乙醇洗洗涤2次次，离心心弃上清清，真空空抽干。5、加入入适量11TEE溶解。如此可可得线性性化载体体DNAA。6、测定定DNAA的含量量。7、加入入线性载载体DNNA和含含量34倍于于载体的的待插入入DNAA片段，连连接缓冲冲液及TT4连接接酶适量量至总体体积为22011，在112114CC反应112116h。8、连接接反应液液可置-20C保存存，供转转化用。提示：1、 设立两个个对照反反应：1） 只有质粒粒载体2） 只有外源源DNAA片段如果外源源DNAA不足，每每个反应应可用5501100nng质粒粒DNAA，并尽尽可能多多加

39、外源源DNAA，同时时保持连连接反应应体积不不超过11011.可用用至少33种不同同方法来来测定TT4噬菌菌体DNNA连接接酶的活活性。大大多数制制造厂商商（除NNew Engglannd BBiollabss公司外外）现在在都用单单位（WWeisss等，119688）对该该酶进行行标化。1个WWeisss单位位相当于于0.22个用外外切核酸酸酶耐受受试验来来定义的的单位（MModrrichh和Leehmaan,119700）或者者60个个粘端单单位（如如Neww Ennglaand Bioolabbs公司司所定义义）。因因此，00.0115 WWeisss单位位的T44噬菌体体DNAA连接酶

40、酶均为浓浓溶液（115单单位/l，可可用200mmool/LL TrrisClPPh7.6)、60mmmoll/L、5mmmol/L二硫硫苏糖醇醇、5000gg/mll牛血清清白蛋白白、500%甘稀稀释成1100单单位、mml的浓浓度置存存。处于于这种浓浓度并在在这种缓缓冲液中中的T44噬体DDNA连连接酶于于-200C保保存3个个月可保保持稳定定。2、 相对而言言，平端端连接是是低效反反应，它它要求以以下4个个条件：1） 低浓度（00.5mmmoll/L）的的ATPP(Feerreettii和Sggaraanekkka,19881)。2） 不存在亚亚精胺一一类的多多胺。3） 极高浓度度的连接

41、接酶（550Weeisss单位. Mll）。4） 高浓度的的平端。在反应混混合物中中加入一一些可促促进大分分子群聚聚作用并并可导致致DNAA分子凝凝聚成聚聚集体的的物质（凝凝聚体）、如聚乙乙二醇或或氯化六六氨合高高钴，可可以使如如何取得得适当浓浓度的平平端DNNA的问问题迎刃刃而解。在连接接反应中中，这些些物质具具有两个个作用：（1）它它们可使使平端DDNA的的连接速速率加大大133个数量量级，因因此可使使连接反反应在酶酶和DNNA浓度度不高的的条件下下进行。（2）它它们可以以改变连连接产物物的分布布，分子子内连接接受到抑抑制，所所形成的的连接产产物一律律使分子子间连接接的产物物。这样样，即使

42、使在有利利于自身身环化（jj:i=10）的的DNAA浓度下下，所有有的DNNA产物物也将是是线状多多聚体。（1） 聚乙二醇醇（PEEG80000）:A：用去去离子水水配制成成的PEEG 880000储存液液（400%）分分装成小小份，冰冰冻保存存，但加加入连续续反应混混合物之之前应将将其融化化并达到到室温。在含115%PPEG 80000的连连接反应应混合物物中，对对连接反反应的刺刺激效应应最为显显著。除除PEGG 80000和和T4噬噬菌体DDNA连连接酶以以外，其其他所有有连接混混合物的的组分应应于0C混合合，然后后加适当当体积的的PEGG 80000（处处于室温温），混混匀，加加酶后于于

43、20C进行行温育。B：连接接混合物物中含有有0.55mmool/LL ATTP和55mmool/LL Mggcl22时对连连接反应应的刺激激效应最最为显著著，甚至至ATPP浓度略略有增加加或Mggcl22度略有有降低，都都会严重重降低刺刺激的强强度（PPheiiffeer和ZZimmmermman,19883）。C：浓度度为155%的PPEG 80000可刺刺激带粘粘端的DDNA分分子的连连接效率率提高至至原来的的101000倍，反反应的主主产物时时串联的的多联体体。：PEEG 880000可刺激激短至88个核苷苷酸的合合成寡聚聚物的平平端连接接，在这这方面，它它于氯化化六氨合合高钴有有所不同

44、同。（2） 氯化六氨氨合高钴钴 ：氯化化六氨合合高钴可可用水配配成100mmool/LL贮存于于-200C，它它对连接接反应的的刺激具具有高度度的浓度度信赖性性。当连连接反应应混合物物中盐浓浓度为11.01.55mool/LL时，其其刺激作作用最大大。氯化化六氨合合高钴可可使平端端连接的的效率大大约提高高到原来来的500倍，但但只能使使粘端连连接的效效率提高高到原来来的5倍倍（Ruuschhe和HHowaard-Flaandeers,19885）。：在单单价阳离离子（330mmmol/L KKCL）存存在下，它它对平端端连接仍仍由一定定的刺激激作用，但但此时连连接产物物的分布布有所改改变。连连

45、接产物物不再使使清一色色的分子子间连接接产物，相相反，环环状DNNA将占占尽优势势。：与PPEG 80000不同同，氯化化六氨合合高钴不不能显著著提高合合成寡核核苷酸的的连接速速率。实验五、重组DDNA的的转化目的：学习用CCaCl2法转化化感受态态E.ccolii的方法法，并能进进行外源源的DNNA转化化，同时学学会用适适合的条条件对转转化细胞胞进行筛筛选。原理：体外连接接的DNNA分子子必须尽尽快引入入寄主细细胞，否否则会很很快降解解，而且且只有导导入到细细胞中后后，才能能扩增及及研究其其功能的的表达，细细胞转化化是常用用也是最最有效的的方法之之一，细细菌转化化是指裸裸露的（或或纯化的的）

46、DNNA被细细菌吸收收而导致致基因转转移的现现象。凡凡是能吸吸收游离离的DNNA片段段的细菌菌，称为为感受态态细菌，或或者说处处于感受受态。大大肠杆菌菌的感受受态需诱诱导。将对数生生长期的的细菌放放入0的CaaCl22低渗溶溶液中，细细胞膨胀胀，形成成原生质质球，诱诱导感受受态；DDNA加加入后，形形成抗DDNasse的基基磷酸钙钙复合物物，粘附附于原生生质球表表面，442热冲击击，DNNA被吸吸收，将将细胞混混合物涂涂布于合合适的（筛筛选）培培养基几几h，细胞胞得以恢恢复和复复壮，转转化基因因得以表表达，然然后根据据合适的的选择条条件可以以区分转转化细胞胞和非转转化细胞胞。一、 材料标准质粒粒DNAA；重组组质粒DDNA；大肠杆杆菌JMM1099二、 仪器超净工作作台；高高速冷冻冻离心机机；紫外外分光光光度计；手提示示高压灭灭菌锅三、 器皿微量移液液器；微微量吸头头；培养养皿；三三角瓶；离心管管；微量量离心管管；微孔孔滤膜及及滤器四、 试剂LB培养养基；00.1mmol/LCaaCl22；20mmmoll/LMMgSOO4；SOCC培养基基；SOBB培养基基；抗生素素五、 方法1、 从37保存的的新鲜平平板中挑挑取一个个大肠杆杆菌J