蒜细胞SOD的提取与分离.docx

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1、蒜细胞SOD的提取与别离一.实验目的学习超氧化物歧化酶的提取与别离方法二.实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它 可催化超氧负离子(02)进行歧化反响，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2=O2+H2O2o 大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD,通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8 的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。三.实验方法及步骤3. SOD活力测定步骤实际操作、现象1.组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中 研磨，使组织或细胞破碎。2. SOD的提取将上述破碎的组织或细胞，加入2-3倍

2、体积 的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌 20min,使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离 心机在5000rpm,离心15min,弃沉淀，得提取液。提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶 剂搅拌15min, 5000rpm离心15min,去杂蛋白沉 淀，得粗酶液将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min,5000rpm 离心 15min,得 SOD 沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓 冲液中，于55 60热15min,离心弃沉淀，得至 SOD酶液。将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测 定各自的SOD活力。目的：原理：取3根小试管，按

3、下表分别加进各种试剂和样品液。试剂(ml)空白管对照管样品管碳酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液0.50.50.5蒸播水0.50.5样品液0.5混合均匀肾上腺素液0.50.5在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30。水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素(空白 管不加)，继续保温反响2min,然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管与样品管的 光密度值分别为A和B。在上述条件下,SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即： 酶活力(单位)=2(A-B)N/A式中N样品稀释倍数;2抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数(100%/50%)。假设以每毫升样品液的单位数表示，

4、那么按下式计算：酶活力单位/ml=2 (A-B) N/A V/V1=26 (A-B) N/A式中V反响液体积(6.5ml)； VI样品液体积(0.5ml)o最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化回收率。四.材料和试剂(1)新鲜蒜瓣(2)大蒜细胞，通过细胞培养技术获得(3)磷酸缓冲液：0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲溶液。(4)氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇=3： 5 (V/V)o(5)丙酮：用前冷却至4-10。碳酸盐缓冲液：0.05mol/L,pH10.2oEDTA 溶液：0.1mol/L。肾上腺素液：2mmol/Lo五、链接SOD是现在制药及化妆品行业中的宠儿，请分析其作用，并了解工业常用的生产方法及企业。