微生物学实验指导书grfz.docx

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1、微生物学学实验指指导书生物技术术教学部部 初立立业 编编重庆邮电电学院生生物信息息学院20033年122月300日前言一、本课课程的性性质和任任务微生物学学实验是是生物学学重要的的基础课课之一，特特别是随随着分子子生物学学的发展展与拓宽宽，微生生物学方方法与技技术显得得尤为重重要。此此外，医医学、农农学、林林学等学学科，甚甚至地质质学、太太空学等等也需微微生物的的方法与与技术。因因此，熟熟悉掌握握微生物物学方法法与技术术，对其其它很多多学科的的发展有有直接的的影响。无无菌操作作技能和和无菌概概念的建建立是微微生物学学实验中中最重要要的内容容，微生生物学实实验课主要任任务是使使学生掌掌握研究究与

2、应用用微生物物的主要要方法与与技术，包包括经典典的、常常规的、以以及现代代的方法法与技术术，使学学生具有有适应于于从事相相关学科科的基础础理论研研究与实实际生产产应用的的微生物物学实验验技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。二、教学学要求与与教学方方法1. 教学要求求1) 注重微微生物学学基础实实验技

3、能能的掌握握与提高高，克服服盲目追追求新颖颖而忽视视基础的的倾向；2)实实验课前前要预习习，明确确每次实实验的目目的与基基本步骤骤；3) 在实验中中要有严严紧的科科学态度度，尊重重事实与与实验结结果，要要善于发发现新现现象；4) 树立密切切合作的的风气，包包括学生生与老师师、班与与班、组组与组、组组长与组组员之间间的密配配合。2. 教学方法法1)以以学生自自己动手手为主，老老师在适适当时间间予以提提示；2)对对实验中中所出现现的一些些现象多多向学生生提出问问题，使使它们学会会分析结结果，并并与理论论知识有有机结合合；3）根据据实验的的进行程程度，引引导学生生更深入入思考，逐逐步树立立他们的的创

4、新意意思；4）严格格要求使使操作技技能规范范化，老老师作示示范，强强调其要要点学生生自己练练。三. 教教学学时时分配与与安排本课程按按每周33学时安安排， 共6个个实验，总总学时118。目录实验一 细细菌的革革兰氏染染色3 实验二 根根霉、酵酵母菌形形态结构构的观察察4实验三 培培养基制制备6实验四 灭灭菌与消消毒9实验五微微生物的的分离和和纯化122实验六 微微生物的的生理生生化反应应144实验七 水水中细菌菌总数的的测定199实验八 放线菌菌形态的的观察221实验九 细菌菌的芽胞胞染色22实验十 微生物物菌种保保藏224实验一 细细菌的革革兰氏染染色法实验目的的： 1 学学习并初初步掌握握

5、革兰氏氏染色法法。2 了解革兰兰氏染色色的原理理及其在在细菌分分类鉴定定中的重重要性。实验原理理：革兰氏染染色法是是18884年由由丹麦病病理学家家Chrristtainn Grram氏氏创立的的，而后后一些学学者在此此基础上上作了某某些改进进。革兰兰氏染色色法是细细菌学中中最重要要的鉴别别染色法法。革兰氏染染色法的的基本步步骤是：先用初初染剂结结晶紫进进行染色色，再用用碘液媒媒染，然然后用乙乙醇（或或丙酮）脱脱色，最最后用复复染剂（如如番红）复复染。经经此方法法染色后后，细胞胞保留初初染剂蓝蓝紫色的的细菌为为革兰氏氏阳性菌菌；如果果细胞中中初染剂剂被脱色色剂洗脱脱而使细细菌染上上复染剂剂的颜

6、色色（红色色），该该菌属于于革兰氏氏阴性菌菌。革兰氏染染色法将将细菌分分为革兰兰氏阳性性和革兰兰氏阴性性，是由由这两类类细菌细细胞壁的的结构和和组成不不同决定定的。实实际上，当当用结晶晶紫初染染后，象象简单染染色法一一样，所所有细菌菌都被染染成初染染剂的蓝蓝紫色。碘碘作为媒媒染剂，它它能与结结晶紫结结合成结结晶紫一一碘的复复合物，从从而增强强了染料料与细菌菌的结合合力。当当用脱色色剂处理理时，两两类细菌菌的脱色色效果是是不同的的。革兰兰氏阳性性细菌的的细胞壁壁主要由由肽聚糖糖形成的的网状结结构组成成、壁厚厚、类脂脂质含量量低，用用乙醇（或或丙酮）脱脱色时细细胞壁脱脱水、使使肽聚糖糖层的网网状结

7、构构孔径缩缩小，透透性降低低，从而而使结晶晶紫-碘的复复合物不不易被洗洗脱而保保留在细细胞内，经经脱色和和复染后后仍保留留初染剂剂的蓝紫紫色。革革兰氏阴阴性菌则则不同，由由于其细细胞壁肽肽聚糖层层较薄，类类脂含量量高，所所以当脱脱色处理理时，类类脂质被被乙醇（或或丙酮）溶溶解，细细胞壁透透性增大大，使结结晶紫-碘的复复合物比比较容易易被洗脱脱出来，用用复染剂剂复染后后，细胞胞被染上上复染剂剂的红色色。实验器材材：1菌种种大肠杆杆菌 (Esccherrichhia colli)约约24hh营养琼琼脂斜面面培养物物，金黄黄色葡萄萄球菌(Staaphyyloccocccus aurreuss)约22

8、4h营营养琼脂脂斜面培培养物，蜡蜡样芽孢孢杆菌（BBaciilluus ccereeus）1220hh营养琼琼脂斜面面培养物物。2染色色剂革兰兰氏染色色液。3.仪器器或其它它用具显显微镜，酒酒精灯，载载玻片，接接种环，双双层瓶（内内装香柏柏油和二二甲苯），擦擦镜纸，生生理盐水水。实验内容容：1制片片取菌种培培养物常常规涂片片、干燥燥、固定定。*要用活活跃生长长期的幼幼培养物物作革兰兰氏染色色；以免免脱色不不完全造造成假阳阳性；火火焰固定定不宜过过热（以以玻片不不烫手为为宜）。2初染染滴加结晶晶紫（以以刚好将将菌膜覆覆盖为宜宜）染色色1-22minn，水洗洗。3媒染染用碘液冲冲去残水水，并用用碘

9、液覆覆盖约11minn，水洗洗。4脱色色用滤纸吸吸去玻片片上的残残水，将将玻片倾倾斜，在在白色背背景下，用用滴管流流加955%的乙乙醇脱色色，直至至流出的的乙醇无无紫色时时，立即即水洗。*革兰氏氏染色结结果是否否正确，乙乙醇脱色色是革兰兰氏染色色操作的的关键环环节，脱脱色不足足，阴性性菌被误误染成阳阳性菌，脱脱色过度度，阳性性菌被误误染成阴阴性菌，脱脱色时间间一般约约20-30ss。5复染染用番红染染液复染染约2mmin，水水洗。6镜检检干燥后，用用油镜观观察。菌体被染染成蓝紫紫色是革革兰氏阳阳性菌，被被染成红红色的为为革兰氏氏阴性菌菌。7混合合涂片染染色按上述方方法，在在同一载载玻片上上，以

10、大大肠杆菌菌和蜡样样芽孢杆杆菌或大大肠杆菌菌和金黄黄色葡萄萄菌作为为混合涂涂片、染染色、镜镜检进行行比较。实验报告告：1列表表简述33株细菌菌的染色色观察结结果（说说明各菌菌的形状状、颜色色和革兰兰氏染色色反应）。2你认认为哪些些环节会会影响革革兰氏染染色结果果的正确确性？最最关键的的环节是是什么？3现有有一株细细菌宽度度明显大大于大肠肠杆菌的的粗壮杆杆菌，请请你鉴定定其革兰兰氏染色色反应。你你怎样运用大肠肠杆菌和和金黄色色葡萄球球菌为对对照菌株株进行涂涂片染色色，以证证明你的的染色结结果正确确性。4你的的染色结结果是否否正确？如果不不正确，请请说明原原因。5进行行革兰氏氏染色时时，为什什么特

11、别别强调菌菌龄不能能太老，用用老龄细细菌染色色会出现现什么问问题？6革兰兰氏染色色时，初初染前能能加碘液液吗？乙乙醇脱色色后复染染之前，革革兰氏阳阳性菌和和革兰氏氏阴性菌应分别别是什么么颜色？7你认认为革兰兰氏染色色中，哪哪一个步步骤可以以省去而而不影响响最终结结果？在在什么情情况下可可以采用用？实验二 根根霉、酵酵母菌形形态结构构的观察察实验目的的：1观察察酵母菌菌的形态态及出芽芽生殖方方式，掌握酵酵母菌的的一般形形态特征征及其与与细菌的的区别。2学习习并掌握握观察霉霉菌的基基本方法法，了解四四类常见见霉菌的的基本形形态特征征。实验原理理：酵母菌是是不运动动的单细细胞真核核微生物物，其大大小

12、通常常比常见见细菌大大几倍甚甚至十几几倍。大大多数酵酵母菌以以出芽方方式进行行无性繁繁殖，有有的分裂裂繁殖；有性繁繁殖是通通过接合合产生子子囊孢子子。本实实验通过过美蓝染染液水侵侵片来观观察酵母母菌的形形态和发发芽生殖殖方式。美蓝是一一种无毒毒性的染染料，它它的氧化化型呈蓝蓝色，还还原型无无色。用用美蓝对对酵母的的活细胞胞进行染染色时，由由于细胞胞的新陈陈代谢作作用，细细胞内具具有较强强的还原原能力，能能使美蓝蓝由蓝色色的氧化化型变为为无色的的还原型型，因此此，具有有还原能能力的酵酵母活细细胞是无无色的、而而死细胞胞或代谢谢作用微微弱的衰衰老细胞胞则呈蓝蓝色或淡淡蓝色，借借此即可可对酵母母菌的

13、死死细胞和和活细胞胞进行鉴鉴别。霉菌可产产生分枝枝的菌丝丝体，分分基内菌菌丝和气气生菌丝丝，气生生菌丝生生长到一一定阶段段分化产产生繁殖殖菌丝，由由繁殖菌菌丝产生生孢子。霉霉菌菌丝丝体及孢孢子的形形态特征征是识别别不同种种类霉菌菌的重要要依据。霉霉菌菌丝丝和孢子子的宽度度通常比比细菌和和放线菌菌粗得多多，可用用低倍显显微镜观观察。观察霉菌菌的形态主主要有三三种方法法，直接制片片观察法法：是将培培养物放放置于乳乳酸石炭炭酸棉蓝蓝染色液液中，制制成霉菌菌制片镜镜检，其其制片的的特点是是：细胞胞不变形形；具有有防腐作作用，不不易干燥燥，能保保存较长长时间；能防止止孢子飞飞散；染染液的蓝蓝色能增增强反

14、差差。必要要时，还还可用树树脂封固固，制成成永久标标本长期期保存。载玻片培培养观察察法：用用无菌操操作将培培养物琼琼脂薄层层放置于于载玻片片上，接接种后盖盖上盖玻玻片培养养，霉菌菌即在载载玻片和和盖玻片片之间的的有限空空间内沿沿盖玻片片横向生生长。培培养一定定时间后后，将载载玻片上上的培养养物置显显微镜下下观察。这这中方法法既可以以保持霉霉菌自然然生长状状态，还还便于观观察不同同发育时时期的培培养物。 玻璃纸纸培养观观察法：霉菌的的玻璃纸纸培养观观察方法法与放线线菌玻璃璃纸培养养观察方方法相似似。这种种方法用用于观察察不同生生长阶段段霉菌的的形态，也也可获得得良好的的效果。实验器材材：1.菌种

15、种 酿酿酒酵母母（Saacchharoomycces ceerevvisiiae）培养约2day 的麦芽汁斜面培养物，曲霉 (Aspergillus sp.)，青霉 (Pencillium sp.)，根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培养2-5天的马铃薯琼脂平板培养物。2.溶液液或试剂剂 0.05%和0.1%吕吕氏碱性性美蓝染染色液，革兰氏氏染色用用碘液，乳酸石石炭酸棉棉蓝染色色液。3.仪器器或其它它用具 显微微镜， 载玻玻片 ，盖玻片片，无菌吸吸管 ，平皿 ，载玻片片， 盖玻玻片， U型型玻璃棒棒 ，解剖针针 ，镊子 ，50%乙醇 ，20%的甘油油等。实验内容容：（

16、一）酵酵母观察察1.美美蓝浸片片的观察察(1) 在载玻玻片中央央加一滴滴0.11%吕氏氏碱性美美蓝染色色液，然然后按无无菌操作作用接种种环挑取取少量酵酵母菌放放在染液液中，混混合均匀匀。(2) 用镊子子取一块块盖玻片片，先将将一边与与菌液接接触，然然后慢慢慢地将盖盖玻片放放下使其其盖在菌液液上。 (3) 将制片片放置约约3miin后镜镜检，先先用低倍倍镜后用用高倍镜镜观察酵酵母的形态和和出芽情情况，并并根据颜颜色区别别死活细细胞。(4) 染色约约0.5h后后再次进进行观察察，注意意死细胞胞数量是是否增加加。(5) 用0.05%吕氏碱碱性美蓝蓝染液重重复上述述操作。2.水碘液浸浸片的观观察在在载

17、玻片片中央加加一小滴滴革兰氏氏染色液液用碘液液，然后后在其上上加3小小滴水，取取少许酵酵母菌苔苔放在水水碘液液中混匀匀，盖上上盖玻片片后镜检检。（二）霉霉菌观察察1.直接接制片观观察法 在载玻玻片上加加一滴乳乳酸石炭炭酸棉蓝蓝染色液液，用解解剖针从从霉菌菌菌落边缘缘挑取少少量已产产孢子的的霉菌菌菌丝，先先置于550%乙乙醇中浸浸一下以以洗去脱脱落的孢孢子，再再放在载载玻片上上的染色色液中，用用解剖针针小心地地将菌丝丝分散开开。盖上上盖玻片片，放置置低倍镜镜下观察察，必要要时换高高倍镜观观察。2.载玻玻片培养养观察法法(1)培培养小室室的灭菌 在平皿皿皿底铺铺一张略略少于皿皿底的圆圆滤纸片片，再

18、放放一U型型玻璃棒棒，其上上放一洁洁净载玻玻片和两两块盖玻玻片，盖盖上皿盖盖。包扎扎后1221CC灭菌330miin，烘烘干备用用。(2)琼琼脂块的的制作 取已经经灭菌的的马铃薯薯琼脂培培养基667mml注入入另一个个灭菌平平皿中，使使之凝固固成薄层层。解剖刀刀切成00.51cmm2的琼脂脂块，并并将其移移至上述述培养室室中的载载玻片上上。(3)接接种 用用尖细的接接种针挑取很很少量的的孢子接接种于琼琼脂块的的边缘上上，用无无菌镊子子将盖玻玻片覆盖盖再琼脂脂块上。(4)培培养 先先在平皿皿的滤纸纸上加335mml灭菌菌的200%甘油油(用于于保持平平皿内的的湿度)，盖上上盖，228CC培养。(

19、5)镜镜检 根根据需要要可以在在不同的的培养时时间内取取出载玻玻片置低低倍镜下下观察，必必要时换换高倍镜镜。实验报告告：1绘图图说明你你所观察察到的酵酵母菌的的形态特特征2说明明观察到到的吕氏氏碱性美美蓝染液液浓度和和作用时时间不同同，对酵酵母菌死细胞胞数量有有何影响响？分析其原原因。3在显显微镜下下，酵母母菌有哪哪些突出出的特征征区别于于一般细细菌？4你主主要根据据哪些形形态特征征来区分分所观察察的四种种霉菌？5在显显微镜下下，细菌菌、放线线菌、酵酵母菌和和霉菌的的主要区区别是什什么？实验三 培养养基制备备实验目的的：了解解培养基基的制备备原理并并掌握其其制备过过程。实验原理理：培养基是是人

20、工配配制的适适合微生生物生长长繁殖或或积累代代谢产物物的营养养基质，用用以培养养、分离离、鉴定定、保存存各种微微生物或或积累代代谢产物物。由于各种种微生物物所需要要的营养养不同，所所以培养养基的种种类很多多。可以以根据微微生物种种类和实实验目的的不同分分成若干干类型。培培养基的的类别如如下：1.按照照培养基基的成分分来分培养基按按其所含含成分，可可分为合合成培养养基、天天然培养养基和半半合成培培养基三三类。 (1)合成培培养基。合合成培养养基的各各种成分分完全是是已知的的各种化化学物质质。这种种培养基基的化学学成分清清楚，组组成成分分精确，重重复性强强，但价价格较贵贵，而且且微生物物在这类类培

21、养基基中生长长较慢。如如高氏一一号合成成培养基基、察氏氏培养基基等。 (2)天然培培养基。由由天然物物质制成成，如蒸蒸熟的马马铃薯和和普通牛牛肉汤，前前者用于于培养霉霉菌，后后者用于于培养细细菌。这这类培养养基的化化学成分分很不恒恒定，也也难以确确定，但但配制方方便，营营养丰富富，所以以常被采采用。 (3)半合成成培养基基。在天天然有机机物的基基础上适适当加入入已知成成分的无无机盐类类，或在在合成培培养基的的基础上上添加某某些天然然成分，如如培养霉霉菌用的的马铃薯薯葡萄糖糖琼脂培培养基。这这类培养养基能更更有效地地满足微微生物对对营养物物质的需需要。2.按照照培养基基的物理理状态分分培养基按按

22、其物理理状态可可分为固固体培养养基、液液体培养养基和半半固体培培养基三三类。(1)固固体培养养基。是是在培养养基中加加入凝固固剂，有有琼脂、明明胶、硅硅胶等。固固体培养养基常用用于微生生物分离离、鉴定定、计数数和菌种种保存等等方面。(2)液液体培养养基。液液体培养养基中不不加任何何凝固剂剂。这种种培养基基的成分分均匀，微微生物能能充分接接触和利利用培养养基中的的养料，适适于作生生理等研研究，由由于发酵酵率高，操操作方便便，也常常用于发发酵工业业。(3)半半固体培培养基。是是在液体体培养基基中加入入少量凝凝固剂而而呈半固固体状态态。可用用于观察察细菌的的运动、鉴鉴定菌种种和测定定噬菌体体的效价价

23、等方面面。3.按照照培养基基用途分分培养基按按用途可可分为基基础培养养基、加加富培养养基、选选择培养养基和鉴鉴别培养养基。(1)基基础培养养基 含有有一般细细菌生长长繁殖需需要的基基本的营营养物质质。最常常用的基基础培养养基是天天然培养养基中的的牛肉膏膏蛋白胨胨培养基基。(2)加加富培养养基 是在在基础培培养基中中加入某某些特殊殊营养物物质，如如血、血血清、动动植物组组织提取取液，用用以培养养要求比比较苛刻刻的某些些微生物物。(3)选选择性培培养基 是是根据某某一种或或某一类类微生物物的特殊殊营养要要求或对对一些物物理、化化学抗性性而设计计的培养养基。利利用这种种培养基基可以将将所需要要的微生

24、生物从混混杂的微微生物中中分离出出来。鉴别培培养基 是是在培养养基中加加入某种种试剂或或化学药药品，使使微生物物培养后后会发生生某种变变化，从从而区别别不同类类型的微微生物。实验器材材：1溶液液或试剂剂 牛肉膏膏，蛋白白胨，琼琼脂，可可溶性淀淀粉，葡葡萄糖，孟孟加拉红红，链霉霉素，11moll/L NaOOH，lmool/LL HCCl，KNOO3，NaCCl，K2HPOO43H2O，MgSSO47H2O，FeSSO47H2O。2仪器器或其他他用具 试试管，三三角瓶，烧烧杯，量量筒，玻玻璃棒，天天平，牛牛角匙，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管，止水夹等。实验内容容

25、：（一）牛牛肉膏蛋蛋白胨培培养基的的配制牛肉膏蛋蛋白胨培培养基是是一种应应用最广广泛和最最普通的的细菌基基础培养养基。其其配方如如下：牛肉膏33g，蛋蛋白胨110g，Naccl5gg，琼脂脂1520gg，水10000mmL，PH77.47.661称药药品按实际用用量计算算后，按按配方称称取各种种药品放放入大烧烧杯中。牛牛肉膏可可放在小小烧杯或或表面皿皿中称量量，用热热水溶解解后倒入入大烧杯杯；也可可放在称称量纸上上称量，随随后放入入热水中中，牛肉肉膏使与与称量纸纸分离，立立即取出出纸片。蛋蛋白胨极极易吸潮潮，故称称量时要要迅速。2加热热溶解在烧杯中中加入少少于所需需要的水水量，然然后放在在石棉

26、网网上，小小火加热热，并用用玻棒搅搅拌，待待药品完完全溶解解后再补补充水分分至所需需量。若若配制固固体培养养基，则则将称好好的琼脂脂放入己己溶解的的药品中中，再加加热融化化，此过过程中，需需不断搅搅拌，以以防琼脂脂糊底或或溢出，最最后补足足所失的的水分。3调ppH 检测测培养基基的pHH，若pHH偏酸，可可滴加llmoll/L NaOOH，边边加边搅搅拌，并并随时用用pH试纸纸检测，直直至达到到所需ppH范围围。若偏偏碱，则则用lmmol/L HHCl进进行调节节。pHH的调节节通常放放在加琼琼脂之前前。应注注意pHH值不要要调过头头，以免免回调而而影响培培养基内内各离子子的浓度度。4过滤滤液

27、体培养养基可用用滤纸过过滤，固固体培养养基可用用4层纱布布趁热过过滤，以以利培养养的观察察。但是是供一般般使用的的培养基基，这步步可省略略。5分装装按实验要要求，可可将配制制的培养养基分装装入试管管或三角角瓶内。分分装时可可用漏斗斗以免使使培养基基沾在管管口或瓶瓶口上而而造成污污染。分装量：固体培培养基约约为试管管高度的的l/55，灭菌菌后制成成斜面。分分装入三三角瓶内内以不超超过其容容积的一一半为宜宜。半固固体培养养基以试试管高度度的1/3为宜宜，灭菌菌后垂直直待凝。6加棉棉塞试管口和和三角瓶瓶口塞上上用普通通棉花(非脱脂脂棉)制作的的棉塞。棉棉塞的形形状、大大小和松松紧度要要合适，四四周紧

28、贴贴管壁，不不留缝隙隙，才能能起到防防止杂菌菌侵入和和有利通通气的作作用。要要使棉塞塞总长约约2/3塞塞入试管管口或瓶瓶口内，以以防棉塞塞脱落。有有些微生生物需要要更好的的通气，则则可用88层纱布布制成通通气塞。有有时也可可用试管管帽或塑塑料塞代代替棉塞塞。7包扎扎加塞后，将将三角瓶瓶的棉塞塞外包一一层牛皮皮纸或双双层报纸纸，以防防灭菌时时冷凝水水沾湿棉棉塞。若若培养基基分装于于试管中中，则应应以5支或7支在一一起，再再于棉塞塞外包一一层牛皮皮纸，用用绳扎好好。然后后用记号号笔注明明、培养养基名称称、组别别、日期期。8灭菌菌将上述培培养基于于1211.3湿热灭灭菌200minn。如因因特殊情情

29、况不能能及时灭灭菌，则则应放入入冰箱内内暂存。9摆斜斜面灭菌后，如如制斜面面，则需需趁热将将试管口口端搁在在一根长长木条上上，并调调整斜度度，使斜斜面的长长度不超超过试管管总长的的1/22。10无无菌检查查将灭菌的的培养基基放入337温箱中中培养22448hh，无菌菌生长即即可使用用，或贮贮存于冰冰箱或清清洁的橱橱内，备备用。（二）高高氏号培养养基的配配制高氏1号号培养基基是用于于分离和和培养放放线菌的的合成培培养基。其其配方如如下：可溶性淀淀粉200g，KNOO3 1gg，NaCCl 00.5gg，K2HPOO43H2O 00.5gg，MgSSO47H2O 00.5gg，FeSSO47H2O

30、 00.011g，琼琼脂15520gg，水10000mmL，pH77.47.66。l称量量和溶解解先计算后后称量，按按用量先先称取可可溶性淀淀粉，放放入小烧烧杯中，并并用少量量冷水将将其调成成糊状，再再加入少少于所需需水量的的水，继继续加热热，边加加热边搅搅拌，至至其完全全溶解。再再加入其其他成分分依次溶溶解。对对微量成成分FeeSO447H2O可先配配成高浓浓度的贮贮备液后后再加入入，方法法是先在在10000mLL水中加加入1gg的FeSSO47H2O，配成成浓度为为0.001g/mL的的贮备液液，再在在10000mLL培养基基中加入入以上贮贮备液11mL即即可。待待所有药药品完全全溶解后后

31、，补充充水分到到所需的的总体积积。如要要配制固固体培养养基，其其琼脂溶溶解过程程同牛肉肉膏蛋白白胨培养养基配制制。2pHH调节、分分装、包包扎及无无菌检查查同牛肉肉膏蛋白白胨培养养基配制制。（三）马马丁氏培培养基的的配制马丁氏培培养基是是用于分分离真菌菌的选择择培养基基。其配配方如下下： KH22PO4 1g，MgSSO47H2O 00.5gg，蛋白白胨5gg，葡萄萄糖l00g，琼琼脂15520gg，水10000mmL，自自然pHH。1称量量和溶解解先计算后后称量，按按用量称称取各成成分，并并将其溶溶解在少少于所需需量的水水中。待待各成分分完全溶溶解后，补补充水分分到所需需体积。再再将孟加加拉

32、红配配成1%的水溶溶液，在在10000mLL培养液液中加入入以上孟孟加拉红红溶液33.3mmL，混混匀后，加加入琼脂脂加热融融化，方方法同牛牛肉膏蛋蛋白胨培培养基配配制。2分装装、包扎扎、灭菌菌及无菌菌检查同同牛肉膏膏蛋白胨胨培养基基配制。3链霉霉素的加加入链霉素受受热容易易分解，所所以临用用时，将将培养基基融化后后待温度度降至445左右时时才能加加入。可可先将链链霉素配配成1%的溶液液(配好的的链霉素素溶液保保存于-20)，在1000mLL培养基基中加11%链霉霉素0.3mLL ，使使每毫升升培养基基中含链链霉素330g。注意事项项：称药药品用的的牛角匙匙不要混混用，称称完药品品应及时时盖紧

33、瓶瓶盖。调调pH时要要小心操操作，避避免回调调。不同同培养基基各有配配制特点点，要注注意具体体操作。实验报告告：l配制制培养基基有哪几几个步骤骤?在操作作过程中中应注意意些什么么问题?为什么么?2培养养基配制制完成后后，为什什么必须须立即灭灭菌?若不能能及时灭灭菌应如如何处理理?已灭菌菌的培养养基如何何进行无无菌检查查?3 细菌能在在高氏号培养养基上生生长吗？为了分分离放线线菌，你你认为应应该采取取什么措措施？4 什么是选选择性培培养基？它在微微生物学学工作中中有何重重要性？5 如果在用用马丁氏氏培养基基分离真真菌时，发发现有细细菌生长长，你认认为是什什么原因因？你将将如何进进一步分分离纯化化

34、得到所所需要的的真菌？实验四 灭菌菌与消毒毒实验目的的：1了解解干热灭灭菌的原原理和应应用范围围。学习习干热灭灭菌的操操作技术术。2了解解高压蒸蒸气灭菌菌的基本本原理及及应用范范围。学学习高压压蒸气灭灭菌的操操作方法法。3了解解紫外线线灭菌的的原理和和方法。实验原理理：干热灭菌菌是利用用高温使使微生物物细胞内内的蛋白白质凝固固变性而而达到灭灭菌的目目的。细细胞内的的蛋白质质凝固性性与其本本身的含含水量有有关，在在菌体受受热时，当当环境和和细胞内内含水量量越大，则则蛋白蛋蛋凝固就就越快，反反之含水水量越少少，凝固固缓慢。因因此，与与湿热灭灭菌相比比，干热热灭菌所所需温度度要高（160170），时

35、间要长（12h），但干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。高压蒸气气灭菌是是将待灭灭菌的物物品放在在一个密密闭的加加压灭菌菌锅内，通通过加热热，使灭灭菌锅隔隔套间的的水沸腾腾而产生生蒸气。待待水蒸气气急剧地地将锅内内的冷空空气从排排气阀中中驱尽，然然后关闭闭排气阀阀，继续续加热，此此时由于于蒸气不不能溢出出，而增增加了灭灭菌锅内内的压力力，从而而使沸点点增高，得得到高于于1000的温度度。导致致菌体蛋蛋白质凝凝固变性性而达到到灭菌的的目的。在同一温温度下，湿湿热的杀杀菌效力力比干热热大。其其原因有有三：一一是湿热热中细菌菌菌体吸吸收水分分，蛋白白质较易易凝固

36、，因因蛋白质质含水量量增加，所所需凝固固温度降降低（表表1），二二是湿热热的穿透透力比干干热大（表表2），三三是湿热热的蒸气气有潜热热存在。1g水在100时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。表1蛋白白质含水水量与凝凝固所需需温度的的关系卵白蛋白白含水量量/%30分钟钟内凝固固所需温温度/505625748801880990614501601700表2干热热湿热穿穿透力及及灭菌效效果比较较温度/时间/hh透过布层层的温度度/灭菌20层10层100层层干热1330-1140486727055不完全湿热1005.3331011

37、01101完全在使用高高压蒸气气灭菌锅锅灭菌时时，灭菌菌锅内冷冷空气的的排除是是否完全全极为重重要，因因为空气气的膨胀胀压大于于水蒸气气的膨胀胀压，所所以，当当水蒸气气中含有有空气时时，在同同一压力力下，含含空气蒸蒸气的温温度低于于饱和蒸蒸气的温温度。灭灭菌锅内内留有不不同分量量空气时时，压力力与温度度的关系系见（表表3）表3 灭灭菌锅留留有不同同分量空空气时，压压力与温温度的关关系压力数全部空气气排出时时的温度度/2/3空空气排出出时的温温度/1/2空空气排出出时的温温度/1/3空空气排出出时的温温度/空气全不不排出时时的温度度/MpaKg/ccm2Ib/iin20.0330.3555108

38、.81009490720.0770.70010115.6109105100900.100105515121.31151121091000.1441.40020126.21211181151090.1771.75525130.01261241211150.2112.10030134.6130128126121现在法定定压力单单位己不不用磅和和kg/cm22表示，而而是用PPa或barr表示，其其换算关关系为：1kgg/cmm2=9880666.5PPa；1Ibb/inn2=68894.76PPa.一般培养养基用00.1MMpa（相相当于115 IIb/iin2或1.005kgg/cmm2），12

39、21.55，155300minn可达到到彻底灭灭菌的目目的。灭灭菌的温温度及维维持的时时间随灭灭菌物品品的性质质和容量量等具体体情况而而有所改改变。例例如含糖糖培养基基用0.06MMpa（88Ib/in22或0.559kgg/cmm2）1122.6灭菌115miin，但为了了保证效效果，可可将其他他成分先先行1221.33oC, 灭灭菌200minn,然后以以无菌操操作手续续加入灭灭菌的糖糖溶液。又又如盛于于试管内内的培养养基以00.1MMpa，1121.5灭灭菌200minn即可，而而盛于大大瓶内的的培养基基最好以以0.11Mpaa，1222灭灭菌300minn。实验中常常用的非非自控高高压

40、蒸气气灭菌锅锅有卧式式和手提提式二种种，其结结构和工工作原理理相同，本本实验以以手提式式高压蒸蒸气灭菌菌锅为例例，介绍绍其使用用方法，有有关自控控高压蒸蒸气灭菌菌锅（aautooclaave）的的使用可可参照厂厂家说明明书。紫外线灭灭菌是用用紫外线线灯进行行的。波波长为22003000nm的的紫外线线都有杀杀菌能力力，其中中以2660nmm的杀菌菌力最强强。在波波长一定定的条件件下，紫紫外线的的杀菌效效率与强强度和时时间的乘乘积成正正比。紫紫外线杀杀菌机理理主要是是因为它它诱导了了胸腺嘧嘧啶二聚聚体的形形成和DDNA链链的交联联，从而而抑制了了DNAA的复制制。另一一方面，由由于辐射射能使空空

41、气中的的氧电离离成OO，再再使O2氧化生生成臭氧氧（O3）或使使水（HH2O）氧化化生成过过氧化氢氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀杀菌作用用。紫外外线穿透透力不大大，所以以，只适适用于无无菌室，接接种箱，手手术室内内的空气气及物体体表面的的灭菌。紫紫外线灯灯距照射射物以不不超过11.2mm为宜。此此外，为为了加强强紫外线线灭菌效效果，在在打开紫紫外灯以以前；可可在无菌菌室内(或接种种箱内)喷洒3%5%石炭炭酸溶液液，一方方面使空空气中附附着有微微生物的的尘埃降降落，另另一方面面也可以以杀死一一部分细细菌。无无菌室内内的桌面面、凳子子可用22%3%的来来苏尔擦擦洗，然然后再开开紫外灯灯照射，

42、即即可增强强杀菌效效果，达达到灭菌菌目的。实验器材材：1培养养基牛肉肉膏蛋白白胨培养养基。2溶液液或试剂剂 3%-5%石炭酸酸或2%-3%来苏尔尔溶液。3仪器器或其他他用具 培养养皿，试试管，吸吸管，电电烘箱，培培养皿(6套一一包)， 手手提式高高压蒸气气灭菌锅锅，紫外外线灯等等。实验内容容：一、干热热灭菌1装入入待灭菌菌物品将包好的的待灭菌菌物品（培培养皿、试试管，吸吸管等）放放入电烘烘箱内，关关好箱门门。物品不要要摆得太太挤，以以免妨碍碍空气流流通，灭灭菌物品品不要接接触电烘烘箱内壁壁的铁板板，以防防包装纸纸烤焦起起火。2升温温接通电源源，拨动动开关，打打开电烘烘箱排气气孔，旋旋动恒温温调

43、节器器至绿灯灯亮，让让温度逐逐渐上升升。当温温度升至至1000时，关关闭排气气孔。在在升温过过程中，如如果红灯灯熄灭，绿绿灯亮，表表示箱内内停止加加温，此此时如果果还未达达到所需需的16601700温度，则则需转动动调节器器使红灯灯再亮，如如此反复复调节，直直至达到到所需温温度。3恒温温当温度升升达到11601700时，恒恒温调节节器会自自动控制制调节温温度，保保持此温温度2hh。干热灭菌菌过程。严严防恒温温调节的的自动控控制失灵灵而造成成安全事事故。4降温温切断电源源、自然然降温。5开箱箱取物待电烘箱箱内温度度降到770以下后后，打开开箱门，取取出灭菌菌物品。电烘箱内内温度末末降到770，切

44、勿勿自行打打开箱门门以免骤骤然降温温导致玻玻璃器皿皿炸裂。二高压蒸蒸气灭菌菌1首先先将内层层锅取出出，再向向外层锅锅内加入入适量的的水，使使水面与与三角搁搁架相平平为宜。切勿忘记记加水，同同时水量量不可过过少，以以防灭菌菌锅烧干干而引起起炸裂事事故。2放回回内层锅锅，并装装入待灭灭菌物品品。注意意不要装装得太挤挤，以免免防碍蒸蒸气流通通而影响响灭菌效效果。三三角烧瓶瓶与试管管口端均均不要与与锅壁接接触，以以免冷凝凝水淋湿湿包口的的纸而透透入棉塞塞。3加盖盖，并将将盖上的的排气软软管插入入内层锅锅的排气气槽内。再再以两两两对称的的方式同同时旋紧紧相对的的两个螺螺栓，使使螺栓松松紧一致致，勿使使漏

45、气。4用电电炉或煤煤气加热热，并同同时打开开排气阀阀，使水水沸腾以以排除锅锅内的冷冷空气。待待冷空气气完全排排尽后，关关上排气气阀，让让锅内的的温度随随蒸气压压力增加加到逐渐渐上升。当当锅内压压力升到到所需压压力时，控控制热源源，维持持压力至至所需时时间。本本实验用用0.11Mpaa，1211.5，20mmin灭灭菌。灭菌的主主要因素素是温度度而不是是压力。因因此锅内内冷空气气必须完完全排尽尽后，才才能关上上排气阀阀，维持持所需压压力。5灭菌菌所需时时间到后后，切断断电源或或关闭煤煤气，让让灭菌锅锅内温度度自然下下降，当当压力表表的压力力降至“0”时，打打开排气气阀，旋旋松螺栓栓，打开开盖子，取取出灭菌菌物品。压力一定定要降到到“0”时，才才能打开开排气阀阀，开盖盖取物。否否则就会会因锅内内压力突突然下降降，使容容器内的的培养基基由于内内外压力力不平衡衡而冲出出烧瓶口口或试管管口，造造成棉塞塞沾染培培养基而而发生污污染，甚甚至灼伤伤操作者者。