医学专题—细菌内毒素检测标准操作28524.docx

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1、细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱 除外源性内毒素用，温度应能达到180。二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（371）。三、水银温度计，精度在1以下，量程不小于50。四、旋涡混合器。五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。七、细菌内毒素工作品。八、凝胶法细菌内毒素检查用水。九、实验用具无热原吸头（1000l、200l）、带铝盖的凝集管（10mm75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。所用玻璃器皿使用前

2、须经250干烤至少1小时或180干烤至少4小时。操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4存放（可存放多长时间）。2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4存放。（可存放多长时间）。3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验

3、。（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0、0.5、0.25（为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。2、待复核鲎试剂的准备取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉

4、末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。3、加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2、0.5和0.25的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。4、加样结束后，将鲎试剂用封口

5、膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入371水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温602分钟。5、观察并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）。（二） 实验结果计算如最大浓度为2.0的4管均为阳性，最低浓度0.254管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（C）。C=lg-1(X/4)式中X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是系列浓度递

6、减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。（三）结果判断当C在0.5-2（包括0.5和2）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。三、干扰实验（一）实验目的干扰试验的目的是确定供试品内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化、鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。（二）实验操作1、制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素工作品，用细菌内毒素检查用水先稀释至2EU/ml，再稀释成4个浓度的标准溶液即2.0、0.5、0.25。2、制备含内毒

7、素的供试品溶液用供试品溶液将1、中的2EU/ml细菌内毒素工作品溶液稀释成4个浓度即2.0、1.0、0.5、0.25的含内毒素的供试品溶液。3、鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。4、加样将准备好的鲎试剂18支放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素标准对照液，另一列2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照。将另外18支鲎试剂

8、放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素的含供试品溶液；另一列2支加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，两同试管架放入371水浴或适宜恒温器中，保温602分钟后，观察并记录结果。（三）实验结果计算如两组最大浓度2.0均为阳性，最低浓度0.25均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均（Et）。ES=lg-1(XS/4)Et=l

9、g-1(Xt/4)式中 XS、Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。（四）结果判断当ES在0.5-2.0（包括0.5和2.0）时，且Et在0.5 ES2.0 ES（包括0.5 ES和2.0 ES）时，则认为供试品不干扰试验，可用此方法对此供试品进行细菌内毒素检查。当ES不在0.5-2.0（包括0.5和2.0）时，则认为供试品干扰实验。应使用适宜的方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数稀释等。四、供试品细菌内毒素检查凝胶限度试验在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。（一）

10、操作方法1、供试品溶液的制备根据合格标准和鲎试剂灵敏度将供试品进行稀释（如CIK细胞合格标准为低于2 EU/ml，鲎试剂灵敏度为0.25 EU/ml，则8倍稀释）。2、阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2浓度的内毒素标准液。3、供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液8倍稀释液将内毒素标准品制成2浓度的内毒素溶液。4、阴性对照液即细菌内毒素检查用水5、鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解、轻轻转动瓶壁，使内溶物充分溶解，避免产生气泡。6、

11、加样 取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液8倍稀释液作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管，（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。7、将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入371水浴或适宜恒温器中，保温602分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。（二）结果判断当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方为有效。若供试品管2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性，应认为不符合规定；如2管中1管为

12、阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。注意事项1 实验前，须用肥皂洗手，用75%酒精棉球消毒。2 操作时37保温前应尽量保持无风状态，人员行动要轻缓，以防止空气体的内毒素进入供试液。3 溶解鲎试剂及混匀供试品的鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。4 由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。5 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行。6 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。7 实验操作应在清洁环境中进行，过程中应防止微生物的污染。（具体到各实验室，应在实验室的那个部位进行操作）使用过的玻璃器皿如何处理？内容总结（1）细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量（2）3、加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）（3）4、加样将准备好的鲎试剂18支放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支 8 / 8