体内药物分析分析方法.pptx

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1、 第二篇第二篇 分析方法分析方法 第五章第五章 光谱分析法光谱分析法 第一节第一节 比色法比色法 1 1）定义）定义 紫外紫外-可见光通过某种物质时可见光通过某种物质时，一部分光被吸收，从一部分光被吸收，从而引起该物质分子的外层电子能级跃迁。利用被测物质在特而引起该物质分子的外层电子能级跃迁。利用被测物质在特定波长或一定波长范围内的吸收度来测定药物的含量。又称定波长或一定波长范围内的吸收度来测定药物的含量。又称吸收光度法。吸收光度法。2 2）定量方法）定量方法 A:A:范围范围400-760nm400-760nm可见。定量依据可见。定量依据 A=EA=EC CL L B:B:是用于待测物本身有

2、颜色或能与显色剂作用显色的被测组是用于待测物本身有颜色或能与显色剂作用显色的被测组分，体内药物分析易受内源性杂质干扰。分，体内药物分析易受内源性杂质干扰。C:C:生物样品采用标准曲线法生物样品采用标准曲线法 D:D:检测灵敏度低，大于检测灵敏度低，大于1 1 g/mlg/ml的生物样本；选择性差，代谢的生物样本；选择性差，代谢 物和内源性物质干扰测定物和内源性物质干扰测定 第二节第二节 紫外分光光度法紫外分光光度法 一一.概述概述 A:A:范围范围200-400nm200-400nm可见。定量依据可见。定量依据 A=EA=EC CL L B:B:是用于有紫外吸收的药物，灵敏度略高于比色法是用于

3、有紫外吸收的药物，灵敏度略高于比色法 C:C:需经样品的萃取、纯化才能得到好的分析效果需经样品的萃取、纯化才能得到好的分析效果 二二.方法与应用方法与应用 1.1.直接紫外分光光度法直接紫外分光光度法 A:A:样品中的杂质在测定样品中的杂质在测定处无干扰处无干扰 B:B:生物样品中待测物的浓度较高，达到检测限生物样品中待测物的浓度较高，达到检测限 2.2.差示分光光度法差示分光光度法 1 1）基本原理）基本原理 简称简称A A法法 在两种不同的环境中，待测物以不同的分子形式存在，其吸在两种不同的环境中，待测物以不同的分子形式存在，其吸收光谱有明显的区别。而收光谱有明显的区别。而共存的物质共存的

4、物质不受这种环境变化影响，不受这种环境变化影响，吸收光谱无变化。吸收光谱无变化。2 2）测定方法）测定方法 A:A:两份相同的共试品溶液，经过不同的处理后，一份置于样品两份相同的共试品溶液，经过不同的处理后，一份置于样品池中，一份置于参比池中测其差值（池中，一份置于参比池中测其差值（A A）B:B:波长波长的选择，差示法的选择，差示法 C:C:数学依据数学依据 D:D:必须通过试验证明生物样本中的干扰物被消除，必须通过试验证明生物样本中的干扰物被消除，A A杂质杂质=0=0 3.3.双波长分光光度法双波长分光光度法 1 1）基本原理）基本原理 吸收光谱部分重叠的吸收光谱部分重叠的a a、b b

5、两组分混合物中，若消除两组分混合物中，若消除b b的干扰的干扰 测定测定a a，可从，可从b b的吸收光谱上选择两个吸收度相等的波长的吸收光谱上选择两个吸收度相等的波长1 1 和和2 2。测定混合物在两波长处吸收度的差。测定混合物在两波长处吸收度的差。2 2）测定波长和参比波长的选择）测定波长和参比波长的选择 A:A:选择方法选择方法 B:B:数学依据数学依据 C:C:干扰组分在两个波长处有相同的吸收度干扰组分在两个波长处有相同的吸收度A Ab b=A Ab b1 1-A Ab b2 2=0=0 D:D:待测物在两个波长处的吸收度差值待测物在两个波长处的吸收度差值A Aa a足够大足够大 第三

6、节第三节 荧光分析法荧光分析法 一一.概述概述 A:A:是利用物质发射荧光的特性进行分析的光学分析法。是利用物质发射荧光的特性进行分析的光学分析法。B:B:荧光分析的特点荧光分析的特点 灵敏度高；选择性好灵敏度高；选择性好 二二.基本原理基本原理 1.1.荧光的发生荧光的发生 2.2.分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系 能够发射荧光的物质具备：必须有强的紫外能够发射荧光的物质具备：必须有强的紫外-可见光吸收；可见光吸收；一定的荧光效率一定的荧光效率 1 1）荧光效率（）荧光效率（f f）表示物质发射荧光能力大小表示物质发射荧光能力大小 2 2）分子结构与荧光特性）分子结构与荧光特性 A:

7、A:共轭结构共轭结构 B:B:分子的取代基分子的取代基 -OH-OH、-OR-OR、-NH-NH2 2、-CN-CN等荧光增强；等荧光增强；-COOH-COOH、NONO2 2、-C=O-C=O、-NO-NO等荧光减弱；等荧光减弱；-R-R、-SO-SO3 3H H等荧光不变。等荧光不变。3.3.激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱 1 1）激发光谱）激发光谱 是指激发光的波长与发射荧光强度的关系曲线是指激发光的波长与发射荧光强度的关系曲线 2 2）荧光光谱）荧光光谱 是指荧光波长与发射光强度的关系曲线是指荧光波长与发射光强度的关系曲线 4 4.激发波长激发波长exex和荧光波长和荧光波长em

8、em选择选择 1 1）根据激发光谱和荧光光谱）根据激发光谱和荧光光谱选择选择exex和和emem 2 2）exex和和emem的距离的距离2020-30-30，理想的为，理想的为5050 3 3）若激发波长有几个强度适宜的峰，选择波长最长峰）若激发波长有几个强度适宜的峰，选择波长最长峰 5.5.荧光强度与物质浓度的关系荧光强度与物质浓度的关系 A:A:物质发射荧光的强度物质发射荧光的强度 F=2.3kF=2.3kf fI I0 0ECLECL B:F=KC B:F=KC 前提是前提是ECL0.05ECL0.05，故荧光分析法为稀溶液分析法，故荧光分析法为稀溶液分析法 6.6.定量分析方法定量分

9、析方法 1 1）标准曲线法）标准曲线法 2 2）比例法）比例法 A:A:如标准曲线通过原点，可选择线性范围内，用比例法测定如标准曲线通过原点，可选择线性范围内，用比例法测定 B:B:方法方法 取已知量的标准品，配制一标准液（取已知量的标准品，配制一标准液（CsCs），），CsCs在线性在线性范围内。在相同条件下测定荧光强度（范围内。在相同条件下测定荧光强度（FsFs、FxFx），计算试样），计算试样浓度（浓度（CxCx）7 7.影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 温度；溶剂；温度；溶剂；pHpH；荧光淬灭剂荧光淬灭剂；激发光照射；散射光等；激发光照射；散射光等 三三.方法与应用方法与应用 1

10、.1.常规方法常规方法 1 1）直接测定法）直接测定法 用于自身能产生荧光物质用于自身能产生荧光物质 2 2）间接法）间接法 无荧光或荧光弱的药物，与荧光试剂反应产生荧光无荧光或荧光弱的药物，与荧光试剂反应产生荧光 2.2.胶束增溶增敏荧光分析法胶束增溶增敏荧光分析法 1 1）胶束溶液胶束溶液为一定浓度的表面活性剂，有一个亲水基团和一个为一定浓度的表面活性剂，有一个亲水基团和一个疏水基团，极性溶液中几十个分子聚集成团，内疏水，外亲水疏水基团，极性溶液中几十个分子聚集成团，内疏水，外亲水 2 2）一定浓度下（临界浓度）形成胶束，直径为）一定浓度下（临界浓度）形成胶束，直径为3-6nm3-6nm

11、3 3）极性小的难溶溶水的荧光物在胶束液中溶解度显著增加）极性小的难溶溶水的荧光物在胶束液中溶解度显著增加 温度；溶剂；温度；溶剂；pHpH；荧光淬灭剂；激发光照射；散射光等；荧光淬灭剂；激发光照射；散射光等 4 4）胶束溶液对荧光物质有增溶、增稳、增敏等特点）胶束溶液对荧光物质有增溶、增稳、增敏等特点 3.3.荧光探针法荧光探针法 1 1）基本原理）基本原理 许多药物本身无荧光，从无荧光到有许多药物本身无荧光，从无荧光到有荧光需要使用荧光探针荧光需要使用荧光探针 2 2）荧光探针的优点）荧光探针的优点 A:A:经衍生化后增加响应值，提高灵敏度和选择性经衍生化后增加响应值，提高灵敏度和选择性

12、B:B:有稳定分析物的作用，活泼、挥发性药物有稳定分析物的作用，活泼、挥发性药物 C:C:有助于化学基团的确定有助于化学基团的确定 4.4.荧光淬灭法荧光淬灭法 第四节第四节 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 原子吸收光谱法是基于蒸汽相中被测元素的基态原子对其原子原子吸收光谱法是基于蒸汽相中被测元素的基态原子对其原子共振辐射的吸收来测定样品中该元素含量的一种方法共振辐射的吸收来测定样品中该元素含量的一种方法 一一.原子吸收光谱法的特点原子吸收光谱法的特点 1.1.优点优点 灵敏度高；精密度好；选择性强；应用范围广；易于灵敏度高；精密度好；选择性强；应用范围广；易于自动化自动化 2.2.缺点

13、缺点 标准曲线的工作范围窄，一个数量级。标准曲线的工作范围窄，一个数量级。二二.原子吸收分光光度计原子吸收分光光度计 1.1.光源光源 作用是发射被测元素基态原子所吸收的特征共振辐射作用是发射被测元素基态原子所吸收的特征共振辐射 1 1）对光源的要求）对光源的要求 A:A:发射辐射波长的半宽度要明显小于吸收线的半宽度发射辐射波长的半宽度要明显小于吸收线的半宽度 B:B:辐射强度要有足够大辐射强度要有足够大 C:C:稳定性能好稳定性能好 D:D:使用寿命长使用寿命长 2 2）原子吸收最重要的光源为空心阴极灯，含有被测元素。）原子吸收最重要的光源为空心阴极灯，含有被测元素。2.2.原子化器原子化器

14、 1)1)功能在于将试样中待测元素转化为所需的基态元子蒸汽功能在于将试样中待测元素转化为所需的基态元子蒸汽 2)2)实现原子化法可分为两类实现原子化法可分为两类 A:A:火焰原子化法火焰原子化法 B:B:非火焰原子化法非火焰原子化法 3.3.单色器单色器 将所需的共振吸收线分离出来。将所需的共振吸收线分离出来。4.4.检测系统检测系统 由检测器、放大器、对数变换系统组成由检测器、放大器、对数变换系统组成 三三.定量分析方法定量分析方法 1.1.标准曲线法标准曲线法 2.2.标准加入法标准加入法 A:A:当样品基体影响较大，又没有纯净的当样品基体影响较大，又没有纯净的基体空白基体空白或纯净物中极

15、或纯净物中极微量原元素时应用此法微量原元素时应用此法 B:B:分取几份等量的被测样品，其中一份不加入被测元素，其余分取几份等量的被测样品，其中一份不加入被测元素，其余各份分别加入不同已知量的被测元素得各份分别加入不同已知量的被测元素得C C1 1、C C2 2、C C3 3C Cn n。绘制。绘制曲线，求待测样品微量元素浓度。曲线，求待测样品微量元素浓度。3.3.内标法内标法 往标准液和样品中加入一定量的，所有样品中均没有往标准液和样品中加入一定量的，所有样品中均没有的内标元素的内标元素 1)1)分别测定待测元素和内标的吸收度分别测定待测元素和内标的吸收度 2)2)吸收度的比标准曲线法定量吸收

16、度的比标准曲线法定量 第六章第六章.色谱分析法色谱分析法 是一种物理或物理化学的分析方法。其分离原理主要是利用物是一种物理或物理化学的分析方法。其分离原理主要是利用物质在流动相和固定相中的分配系数或吸附能力的差异达到分离质在流动相和固定相中的分配系数或吸附能力的差异达到分离 第一节第一节 薄层色谱法薄层色谱法 一一.概述概述 A:A:薄层色谱（薄层色谱（TLCTLC）是指将固定相均匀的涂在光洁的玻璃等表）是指将固定相均匀的涂在光洁的玻璃等表面形成薄膜，将待分离物点在薄层半的一端，于展开室中，展面形成薄膜，将待分离物点在薄层半的一端，于展开室中，展开剂借毛细作用从薄层点样的一端展开到另一端，使不

17、同的物开剂借毛细作用从薄层点样的一端展开到另一端，使不同的物质得到分离。质得到分离。B:B:根据机制不同分根据机制不同分 分配色谱；吸附色谱；离子交换色谱；凝分配色谱；吸附色谱；离子交换色谱；凝 胶色谱胶色谱 二二.薄层扫描法薄层扫描法 是指利用薄层扫描测定薄层色谱斑点含量的一种方法是指利用薄层扫描测定薄层色谱斑点含量的一种方法 1.1.实现操作的规范化和自动化实现操作的规范化和自动化 1 1）光谱测定）光谱测定 用于物质的定性鉴别用于物质的定性鉴别 2 2）色谱测定）色谱测定 用于体内药物的定量分析用于体内药物的定量分析 2.2.薄层色谱的优化法薄层色谱的优化法 1 1）薄层色谱分离条件的依

18、据）薄层色谱分离条件的依据 A:A:被分离物的性质被分离物的性质 B:B:吸附剂的活性吸附剂的活性 C:C:展开剂的活性展开剂的活性 展开剂千变万化，找到与被测药物、吸附剂展开剂千变万化，找到与被测药物、吸附剂相匹配的展开剂是获得好的分离效果的关键。相匹配的展开剂是获得好的分离效果的关键。D:D:理想的分离理想的分离R Rf f间，清晰集中、分离度佳的一组斑点间，清晰集中、分离度佳的一组斑点 E:E:展开剂的确定方法展开剂的确定方法 三三.定量分析定量分析 1.1.外标一点法外标一点法 用一种已知对照品与样品溶液测定用一种已知对照品与样品溶液测定 1 1）计算）计算 m m样样/m/m对对=A

19、=A样样/A/A对对 2 2）要求）要求 对照品和样品多点几个平行样对照品和样品多点几个平行样A A平均值计算；平均值计算；A A样样与与A A对对 要接近；点样要准确要接近；点样要准确 2.2.外标两点法外标两点法 是指用两种浓度的标准液与样品液对比的定量法是指用两种浓度的标准液与样品液对比的定量法 A:A:在点样量与在点样量与A A处于直线范围内时未知样的含量处于直线范围内时未知样的含量m m样样=a+bA=a+bA样样 B:B:对照品和样品多点几个平行样对照品和样品多点几个平行样A A平均值计算平均值计算 3.3.标准曲线法标准曲线法 4.4.内标法内标法 第三节第三节 气相色谱气相色谱

20、 一一.概述概述 1.1.优点优点 选择性好；灵敏度高；用样量少；分析速度快选择性好；灵敏度高；用样量少；分析速度快 2.2.缺点缺点 挥发性；热稳定挥发性；热稳定 二二.仪器简介仪器简介 1.1.载气载气 1 1）载气由高压气瓶共给，经压力调节器、净化气、稳压调节）载气由高压气瓶共给，经压力调节器、净化气、稳压调节后进入色谱，流量、温度、基线稳定后进样。后进入色谱，流量、温度、基线稳定后进样。2 2）载气携带样品进入色谱柱分离）载气携带样品进入色谱柱分离 3 3）常用的载气）常用的载气 2.2.进样进样 1 1）气体样品）气体样品 微量注射器和气体自动进样阀，量微量注射器和气体自动进样阀，量

21、0.1-1ml0.1-1ml 2 2）液体进样）液体进样 微量注射器和液体自动进样阀，量微量注射器和液体自动进样阀，量0.1-10.1-1 l l。3.3.色谱柱色谱柱 1 1）由）由柱管柱管和和固定相固定相组成，分离作用。有两种组成，分离作用。有两种 2 2）填充柱）填充柱 内径内径4-6mm4-6mm，长，长1.5-4m1.5-4m，键合苯基，甲基聚硅氧烷，键合苯基，甲基聚硅氧烷 3 3）毛细管柱）毛细管柱 弹性石英，内径，长数十米弹性石英，内径，长数十米-数百米数百米 4.4.检测器检测器 1 1）氢焰离子化检测器（）氢焰离子化检测器（FIDFID）A:A:凡是氢凡是氢-火焰中能电离的药

22、物都可被检测火焰中能电离的药物都可被检测 B:B:无机药物和惰性气体无机药物和惰性气体 C:C:药物萃取、浓集的残渣用药物萃取、浓集的残渣用CSCS2 2溶解进样溶解进样 D:D:最小检测浓度最小检测浓度100ng/ml100ng/ml，最小检测量，最小检测量1ng1ng 2 2）氮氮-磷检测器（磷检测器（NPDNPD）是利用有机药物分子通过氢）是利用有机药物分子通过氢-空气火焰空气火焰产生热电离测定产生热电离测定 A:A:检测器火焰处设有加热的检测器火焰处设有加热的碱金属盐碱金属盐，对氮、硫、磷敏感。灵，对氮、硫、磷敏感。灵敏度敏度1010-9-9g/mlg/ml B:B:可检测分子中含有氮

23、、硫、磷的药物可检测分子中含有氮、硫、磷的药物 C:C:氮杂环类药物，氮在母核中，氮杂环类药物，氮在母核中，NPDNPD同时检测原形药和代谢物同时检测原形药和代谢物 D:D:氮在药物的侧链，氮在药物的侧链，NPDNPD只能检测原形药只能检测原形药 3 3）电子捕获检测器（）电子捕获检测器（ECDECD）是一种有选择性的高灵敏度检测器）是一种有选择性的高灵敏度检测器 A:A:对含有对含有电负性原子或官能团的有机和无机物电负性原子或官能团的有机和无机物检测敏感检测敏感 B:B:需要高纯度的氮气需要高纯度的氮气 C:C:体内分析中用于具有吸电子基团的有机药物，其原理为：体内分析中用于具有吸电子基团的

24、有机药物，其原理为：4 4）质谱检测器）质谱检测器 GC-MSGC-MS可获得被测药物的质谱图可获得被测药物的质谱图 三三.定量分析定量分析 1.1.系统适应性试验系统适应性试验 用规定的对照品进行试验和调整，应达到用规定的对照品进行试验和调整，应达到规定的要求规定的要求 1 1）色谱柱的理论塔板数（）色谱柱的理论塔板数（n n）A:A:选定的条件下，供试品、内标等进样，计算选定的条件下，供试品、内标等进样，计算(n)(n)B:n=5.54(t B:n=5.54(tR R/W/W1/21/2)2 2 C:C:如理论塔板数不符合要求，重新建立方法如理论塔板数不符合要求，重新建立方法 2 2）分离

25、度（）分离度（R R）定量分析时，提高准确度定量分析时，提高准确度 A:A:定量分析时，提高准确度定量分析时，提高准确度 B:R=2(tB:R=2(tR2R2-t-tR1R1)/(W)/(W1 1+W+W2 2)3 3）重复性）重复性 取该项下的对照品溶液，连续进样取该项下的对照品溶液，连续进样5 5次，其峰面积的次，其峰面积的 值值RSD2.0%RSD2.0%4 4）脱尾因子（）脱尾因子（T T）A:A:保证精密度、准确度，特别是峰高定量保证精密度、准确度，特别是峰高定量 B:T=WB:T=W0.05h0.05h/2d/2d1 1 2.2.内标法内标法 1 1）内标法的基本原理）内标法的基本

26、原理 将一个已知量，样品中不含有的纯物质加样品中，将一个已知量，样品中不含有的纯物质加样品中，GCGC分析。分析。2)2)内标物的选用原则内标物的选用原则 A:A:内标和被测物只差一个元素内标和被测物只差一个元素 B:B:内标和被测物为同系物内标和被测物为同系物 C:C:内标物与被测物结构相似内标物与被测物结构相似 3 3）内标物的应用）内标物的应用 内标物应在样本与处理之前加入，与样本在内标物应在样本与处理之前加入，与样本在相同的条件下进样分析，色图谱得待测物和内标物的峰面积和相同的条件下进样分析，色图谱得待测物和内标物的峰面积和峰高。以两者比回归得工作曲线峰高。以两者比回归得工作曲线 4

27、4）多内标的应用）多内标的应用 A:A:同时测定多种药物，且被测药物的理化性质差异大同时测定多种药物，且被测药物的理化性质差异大 3.3.外标法外标法 1 1）工作曲线法）工作曲线法 2 2）外标一点法）外标一点法 当工作曲线截距为零，当工作曲线截距为零，m mi i=A=Ai i/A/As smms s 第三节第三节 高效液相色谱法高效液相色谱法 一一.概述概述 分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高、应用广分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高、应用广 二二.仪器简介仪器简介 A:HPLCA:HPLC的基本示意图的基本示意图 B:HPLCB:HPLC的基本部件的基本部件 1.1.输液泵输液泵

28、作用是产生高压，输送流动相。栓塞往复泵，栓向作用是产生高压，输送流动相。栓塞往复泵，栓向前运动流动相流向柱，栓向后运动流动相从贮液瓶吸出前运动流动相流向柱，栓向后运动流动相从贮液瓶吸出 2.2.进样器进样器 1 1）手动进样器）手动进样器 2 2）自动进样器）自动进样器 自动进样、取样、清洗。进样体积准确度高、自动进样、取样、清洗。进样体积准确度高、精密度高、重现性好精密度高、重现性好 3.3.色谱柱色谱柱 1 1）柱管与填料）柱管与填料 A:A:柱有柱管和填料。柱分为分析型（柱有柱管和填料。柱分为分析型（10-30cm10-30cm，22-6mm-6mm）和）和 制备型（制备型（25-100

29、cm25-100cm，2020-40mm-40mm）B:B:色谱的填料不同分色谱的填料不同分 液液-固吸附色谱柱；液固吸附色谱柱；液-液分配色谱柱液分配色谱柱 C:C:药物分析常采用硅氧烷型键合固定相药物分析常采用硅氧烷型键合固定相 分极性（氨基、氰基分极性（氨基、氰基 键合）、中性（醚键合）、非极性（十八烷基键合）键合）、中性（醚键合）、非极性（十八烷基键合）2 2）预柱与保护柱）预柱与保护柱 保护分析柱，延长寿命保护分析柱，延长寿命.填料与分析柱同填料与分析柱同 4.4.检测器检测器 评价指标：灵敏度、噪声、漂移、线性范围、分离能力评价指标：灵敏度、噪声、漂移、线性范围、分离能力 1 1）

30、紫外检测器（）紫外检测器（UVUV）单波长；可调波长；二极管阵列）单波长；可调波长；二极管阵列 B:B:二极管阵列检测器二极管阵列检测器 1 1秒内完成秒内完成200-800nm200-800nm波长范围内的连续波长范围内的连续扫描，可进行定性分析、纯度分析和任何波长的响应值扫描，可进行定性分析、纯度分析和任何波长的响应值 2 2）荧光检测器（）荧光检测器（FDFD）A:A:比紫外灵敏度高、选择性好比紫外灵敏度高、选择性好 B:B:可检测能产生荧光的或衍生后产生荧光的物质可检测能产生荧光的或衍生后产生荧光的物质 3 3）电化学检测器）电化学检测器 A:A:能进行氧化反应的物质，测痕迹量的电活动

31、能进行氧化反应的物质，测痕迹量的电活动 B:B:检测限低、专属性好、线性范围宽检测限低、专属性好、线性范围宽 4 4）蒸发光检测器）蒸发光检测器 A:A:能测定所有的化合物，与待测药物的理化性质无关能测定所有的化合物，与待测药物的理化性质无关 B:B:工作原理工作原理 C:C:挥发性低于流动相的药物测定。灵敏度低，流动相不加盐挥发性低于流动相的药物测定。灵敏度低，流动相不加盐 三三.常用色谱分离及应用常用色谱分离及应用 1.1.液液-固吸附色谱固吸附色谱 A:A:流动相为液体，固定相为固体吸附的色谱法流动相为液体，固定相为固体吸附的色谱法 B:B:固定相为具有吸附能力的吸附剂固定相为具有吸附能

32、力的吸附剂 C:C:色谱分离是靠被分离组分与流动相争夺固定相填料活性中心色谱分离是靠被分离组分与流动相争夺固定相填料活性中心 实现的实现的 D:D:流动相是极性的与填料表面稳定结合，弱极性的样品组分很流动相是极性的与填料表面稳定结合，弱极性的样品组分很 快流出。流动相极性弱，则样品与填料稳定结合，流出慢快流出。流动相极性弱，则样品与填料稳定结合，流出慢 2.2.液液-液分配色谱法液分配色谱法 A:A:流动相与固定相均为液体流动相与固定相均为液体 B:B:是根据样品组分在两种液体中的分配系数不同得到分离是根据样品组分在两种液体中的分配系数不同得到分离 C:C:正相色谱；反相色谱正相色谱；反相色谱

33、 D:D:极性药物在极性固定相、非极性药物在非极性固定相分离极性药物在极性固定相、非极性药物在非极性固定相分离 E:E:最常用的是液最常用的是液-液反相色谱法，该法为了控制样本组分在分液反相色谱法，该法为了控制样本组分在分离过程中的解离，流动相中需加入缓冲盐控制离过程中的解离，流动相中需加入缓冲盐控制pHpH F:F:流动相的流动相的pHpH为为 3.3.离子交换色谱法离子交换色谱法 A:A:填料含有极性基团，且可离子化，在合适的填料含有极性基团，且可离子化，在合适的pHpH下极性基团可下极性基团可 解离，吸引相反电荷的物质解离，吸引相反电荷的物质 B:B:流动相多采用缓冲盐，如样品组分电离度

34、低，减少了与填料流动相多采用缓冲盐，如样品组分电离度低，减少了与填料的反应，可先从柱中流出。流动相极性强，使样品组分与填料的反应，可先从柱中流出。流动相极性强，使样品组分与填料反应减弱，样品组分较快从柱流出。反应减弱，样品组分较快从柱流出。4.4.凝胶排阻色谱法凝胶排阻色谱法 A:A:基于被分离样品的分子量大小不同而对样品进行分离的方法基于被分离样品的分子量大小不同而对样品进行分离的方法 B:B:固定相为有一定孔径的多孔性填料，大分子药物很快流出固定相为有一定孔径的多孔性填料，大分子药物很快流出 5.5.色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择 A:RP-HPLCA:RP-HPLC最常用最常用 B

35、:B:某些解离型药物和代谢产物，可用离子交换色谱法分析，也某些解离型药物和代谢产物，可用离子交换色谱法分析，也可用可用RP-HPLCRP-HPLC 四四.反相液反相液-液分配色谱液分配色谱 A:A:是以极性低或非极性的十八烷等键合作为色谱填料，以及性是以极性低或非极性的十八烷等键合作为色谱填料，以及性较大的水较大的水-甲醇或水甲醇或水-乙腈为流动性相进行分离的方法乙腈为流动性相进行分离的方法 B:B:由于由于RP-HPLCRP-HPLC能使样品前处理操作简单化，流动相价廉易得，能使样品前处理操作简单化，流动相价廉易得，在体内药物分析中得到广泛应用。在体内药物分析中得到广泛应用。C:RP-HPL

36、CC:RP-HPLC的优点的优点 多数药物极性小于内源性杂质，易分离；极多数药物极性小于内源性杂质，易分离；极性杂不易被柱保留，内源性杂质比亲脂性药物先流出；可选的性杂不易被柱保留，内源性杂质比亲脂性药物先流出；可选的 柱多；柱多；RP-HPLCRP-HPLC法加离子对色谱技术，可同时分离极性的离子法加离子对色谱技术，可同时分离极性的离子和无极性的非离子药物。和无极性的非离子药物。五五.制备高效液相色谱法制备高效液相色谱法 1.1.分离条件的选择分离条件的选择 A:A:首先用分析型的首先用分析型的HPLCHPLC进行预试进行预试 B:B:正式试验时柱的填料与预试柱的填料相同正式试验时柱的填料与

37、预试柱的填料相同 C:C:制备柱（制备柱（20-40mm20-40mm，10-30cm10-30cm，20-4020-40mm）D:D:流动相与预试等溶剂强度洗脱，溶剂纯度要高，易挥发，流流动相与预试等溶剂强度洗脱，溶剂纯度要高，易挥发，流 速提高，原则是流速比为内经比的平方速提高，原则是流速比为内经比的平方 2.2.上样量上样量 A:A:上样量过大上样量过大质量超载质量超载，会出现脱尾峰，保留时间变化，会出现脱尾峰，保留时间变化 B:B:样品浓度稀，上样体积过大，但质量不超载，平头峰样品浓度稀，上样体积过大，但质量不超载，平头峰 C:C:样品体积和质量都超载，产生上述综合效应样品体积和质量都

38、超载，产生上述综合效应 D:D:被分离组分完全溶于流动相，样本不易过浓，不能溶于比流被分离组分完全溶于流动相，样本不易过浓，不能溶于比流 动相强的溶剂中。动相强的溶剂中。3.3.检测器的选择检测器的选择 A:A:灵敏度要求不高，低灵敏度即可灵敏度要求不高，低灵敏度即可 B:B:检测器的线性范围要宽检测器的线性范围要宽 C:C:被检测的物质应是非破坏性的被检测的物质应是非破坏性的 4.4.分离样品的收集分离样品的收集 手动收集和自动流分收集器手动收集和自动流分收集器 A:A:自动流分收集器有定时和定体积两种自动流分收集器有定时和定体积两种 B:B:被分离样品超载，相邻两峰部分重叠，不能收集重叠部

39、分，被分离样品超载，相邻两峰部分重叠，不能收集重叠部分，应进入再循环，不超应进入再循环，不超4-54-5次次 C:C:分离度低的组分均可进入再循环，增加分离度，再收集分离度低的组分均可进入再循环，增加分离度，再收集 六六.直接进样分析直接进样分析 直接近样与沉淀蛋白进样直接近样与沉淀蛋白进样 A:A:条件条件 不经浓缩能达到检测限；杂质不影响色谱系统和测定不经浓缩能达到检测限；杂质不影响色谱系统和测定 B:B:体液中尿液最适合直接进样体液中尿液最适合直接进样 C:C:血浆等必须经脱蛋白处理血浆等必须经脱蛋白处理 D:D:被测组分极性较大，难于萃取，适合沉蛋白，进样被测组分极性较大，难于萃取，适

40、合沉蛋白，进样 七七.定量分析方法定量分析方法 1.1.系统适应性试验系统适应性试验 2.2.标准曲线法标准曲线法 内标法内标法 外标法外标法 第七章第七章 免疫分析法免疫分析法 第一节第一节 概述概述 免疫分析法（免疫分析法（IAIA）是指以特异性抗原）是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析抗体反应为基础的分析方法。可测定蛋白质、酶等大分子，还可测定小分子物质方法。可测定蛋白质、酶等大分子，还可测定小分子物质一一.基本原理基本原理 1.1.竞争抑制原理竞争抑制原理 抗原抗原-抗体竞争结合反应抗体竞争结合反应 A:A:抗原抗原-抗体反应时抗体反应时必须满足的条件必须满足的条件 B:AgAgB:

41、AgAgAgAg*C:C:标记抗原标记抗原-抗体结合率（抗体结合率（B%B%）随着未标记的抗原（待测物）随着未标记的抗原（待测物）的增加而竞争性减少，呈负相关的增加而竞争性减少，呈负相关 2.2.竞争抑制曲线（剂量反应曲线）竞争抑制曲线（剂量反应曲线）A:A:样品测定，先配制系列已知浓度的标准曲线，再加入一定样品测定，先配制系列已知浓度的标准曲线，再加入一定 量的标记抗原和抗体，待反应达平衡后，测定量的标记抗原和抗体，待反应达平衡后，测定AgAg*-Ab-Ab的结合率的结合率 B:B:结合率（结合率（B%B%）B%=B/B%=B/（B+FB+F）100%=B/T100%100%=B/T100%

42、C:C:以标准抗原以标准抗原AgAg的浓度为横坐标，以结合率（的浓度为横坐标，以结合率（B%B%）为纵坐标绘）为纵坐标绘标竞争曲线。四种图示。标竞争曲线。四种图示。3.3.抗原抗原-抗体反应的特点抗体反应的特点 1 1）特异性）特异性 一种抗原只能与其刺激产生的一种抗体反应一种抗原只能与其刺激产生的一种抗体反应 2 2）可逆性）可逆性 靠两者分子的立体结构相吻合，发生在分子的表面靠两者分子的立体结构相吻合，发生在分子的表面的静电力、氢键、范德华引力等。结合相对稳定，有可逆性。的静电力、氢键、范德华引力等。结合相对稳定，有可逆性。3 3）最适比例）最适比例 只有抗原抗体比例合适时才能发生最强反应

43、只有抗原抗体比例合适时才能发生最强反应 二二.基本条件基本条件 未标记抗原、标记抗原、特异抗体未标记抗原、标记抗原、特异抗体 1.1.抗原及其制备抗原及其制备 1 1）全抗原与半抗原）全抗原与半抗原 A:A:抗原是指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。同时抗原是指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。同时具有免疫原性和抗原特异性的物质才可称为全抗原具有免疫原性和抗原特异性的物质才可称为全抗原 B:B:全抗原分子量全抗原分子量10001000，化学结构复杂，化学结构复杂 C:C:与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质称为半抗原与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质称为半抗原 D:D:小

44、分子半抗原（药物）和大分子载体物结合形成的全抗原称小分子半抗原（药物）和大分子载体物结合形成的全抗原称为为人工抗原人工抗原。直接免疫动物可产生抗体。直接免疫动物可产生抗体。2 2）人工抗原的制备）人工抗原的制备 A:A:载体的选择载体的选择 免疫活性高；溶解度大；变性作用小等免疫活性高；溶解度大；变性作用小等 B:B:半抗原的选择半抗原的选择 半抗原（药物）有活性基团半抗原（药物）有活性基团 C:C:载体与半抗原的结合载体与半抗原的结合 是以配位键或共价键的方式连接的是以配位键或共价键的方式连接的 3 3）人工抗原的鉴定）人工抗原的鉴定 制备的人工抗原不纯净，含有过剩的药物等制备的人工抗原不纯

45、净，含有过剩的药物等 可通过透析法，凝胶柱层析法、电泳法除去。可通过透析法，凝胶柱层析法、电泳法除去。A:A:光谱分析法光谱分析法 紫外紫外-可见测药物和蛋白质含量，计分子结合比可见测药物和蛋白质含量，计分子结合比 B:B:化学分析法化学分析法 三硝基苯磺酸钠或二硝基酚测定蛋白质与半抗三硝基苯磺酸钠或二硝基酚测定蛋白质与半抗原结合和原结合和前后前后游离游离氨基数氨基数差别，计算结合药物的含量差别，计算结合药物的含量 4 4）标准抗原）标准抗原 是指在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记是指在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品。抗原用的药物标准品。2.2.特异性抗体的制备和鉴

46、定特异性抗体的制备和鉴定 1 1）特异抗体）特异抗体 指抗原作用于机体产生免疫反应，在血清中的能指抗原作用于机体产生免疫反应，在血清中的能与该抗原特异结合的免疫球蛋白与该抗原特异结合的免疫球蛋白 2 2）抗体的制备）抗体的制备 单克隆抗体和多克隆抗体单克隆抗体和多克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体 将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞，经细胞融合技术的杂交细胞，复制后得结构相同的均质细胞，经细胞融合技术的杂交细胞，复制后得结构相同的均质抗体。抗体。多克隆抗体多克隆抗体 抗原直接免疫动物得到，是非均质的混合抗体抗原直接免疫动物得到，是非均质的混合抗

47、体 A:A:免疫原的制备免疫原的制备 免疫原是人工将抗原制成能刺激机体引起免疫免疫原是人工将抗原制成能刺激机体引起免疫反应的物质。免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂反应的物质。免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂 B:B:免疫接种动物免疫接种动物 常用兔、羊和豚鼠。多部位免疫。剂量为微量、常用兔、羊和豚鼠。多部位免疫。剂量为微量、常量和大量，兔免疫常量为抗原常量和大量，兔免疫常量为抗原1-10mg1-10mg，大量，大量50-100mg50-100mg。C:C:抗血清的获得抗血清的获得 免疫动物的血液内抗体达到一定含量后，可采免疫动物的血液内抗体达到一定含量后，可采血。采血时应无菌操

48、作，将血放入面积较大的无菌容器内，室血。采血时应无菌操作，将血放入面积较大的无菌容器内，室温凝固温凝固30min30min，再放入，再放入3030温箱温箱2h2h凝固，最后放入凝固，最后放入44冰箱过夜。冰箱过夜。吸血清，将血快用无菌玻璃棒拨开冰捣碎，在吸血清，将血快用无菌玻璃棒拨开冰捣碎，在4000-100004000-10000 r/min r/min离心，得抗血清。离心，得抗血清。3 3）抗体的鉴定）抗体的鉴定 A:A:滴度滴度 称效价和工作稀释度称效价和工作稀释度 B:B:活度活度 指抗体与相应抗原的亲和能力指抗体与相应抗原的亲和能力 C:C:特异性特异性 指抗原和抗体的结合能力与其他

49、结构类似的干扰物指抗原和抗体的结合能力与其他结构类似的干扰物的结合能力的比较的结合能力的比较 三三.方法分类方法分类 1.1.按标记物分类按标记物分类 1 1）放射免疫分析（）放射免疫分析（RIARIA）2 2）酶免疫分析（）酶免疫分析（EIAEIA）3 3）化学发光酶免疫分析（）化学发光酶免疫分析（CLEIACLEIA）4 4）荧光免疫分析（）荧光免疫分析（FIAFIA）荧光偏振、荧光淬灭、荧光增强、时）荧光偏振、荧光淬灭、荧光增强、时间分辨免疫分析间分辨免疫分析 2.2.按是否加入分离剂分按是否加入分离剂分 1 1）均相免疫分析）均相免疫分析 抗原抗原-抗体反应达到平衡后，结合的标记物抗体

50、反应达到平衡后，结合的标记物与游离的标记物中有一种不产生信号或信号消失，无须进行反与游离的标记物中有一种不产生信号或信号消失，无须进行反应液分作两相，即可测定。应液分作两相，即可测定。2 2）非均相免疫分析）非均相免疫分析 抗原抗原-反应达到平衡后只有在反应液中加反应达到平衡后只有在反应液中加入分离剂，将游离的标记物和结合的标记物分开后，测定各标入分离剂，将游离的标记物和结合的标记物分开后，测定各标记物的浓度。记物的浓度。C:C:特异性特异性 指抗原和抗体的结合能力与其他结构类似的干扰物指抗原和抗体的结合能力与其他结构类似的干扰物的结合能力的比较的结合能力的比较 第二节第二节 放射免疫分析放射