体外PCR扩增和体内DNA复制.ppt

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1、体外PCR 扩增和体内DNA 复制 byby汪汪欢欢，汪晨夕，汪晨夕&张泽张泽彧彧 体外PCR 扩增和体内DNA 复制是获得复制DNA 的2 种途径，它们都依据半保留复制的原理，但因其操作的环境不同，所要求的条件和具体的过程又有所不同。PCR 扩增和DNA 复制条件的比条件的比较 模板模板模板模板 两者都以两者都以两者都以两者都以DNADNADNADNA单链为单链为模板。模板。模板。模板。PCR PCR PCR PCR 以一段目的以一段目的以一段目的以一段目的DNA DNA DNA DNA 片段片段片段片段作模板，体内作模板，体内作模板，体内作模板，体内DNA DNA DNA DNA 复制以整

2、个复制以整个复制以整个复制以整个DNA DNA DNA DNA 分子作模板。分子作模板。分子作模板。分子作模板。酶酶 体内体内DNA DNA 复制是复制是边边解旋解旋边边复制，需要复制，需要DNA DNA 解旋解旋酶酶；延伸；延伸需要需要DNA DNA 聚合聚合酶酶；冈冈崎片段的崎片段的连连接需要接需要DNA DNA 连连接接酶酶；引物引物的合成需要的合成需要RNA RNA 聚合聚合酶酶。而。而PCR PCR 扩扩增引物是体外合成，不需增引物是体外合成，不需要要RNARNA聚合聚合酶酶；双双链链DNA DNA 利用高温利用高温变变性解性解为为两条两条单链单链，不需，不需要要DNA DNA 解旋

3、解旋酶酶；在；在扩扩增增过过程中没有出程中没有出现冈现冈崎片段，也就不需崎片段，也就不需DNA DNA 连连接接酶酶，只需要，只需要Taq Taq 酶酶（一种（一种热稳热稳定的定的DNA DNA 聚合聚合酶酶）。）。PCR 扩增和DNA 复制条件的比条件的比较 原料原料原料原料 都以都以4 4 种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸为为原料。原料。能量能量能量能量 体内体内DNA DNA 的复制的复制过过程中，解旋程中，解旋酶酶将将DNA DNA 双双链链解成解成单单链链需要需要ATP ATP 提供能量。而体外提供能量。而体外DNA DNA 的的扩扩增是通增是通过过提高温度提高温度使双使双链链解成解成单链单

4、链，不需要，不需要ATP ATP 提供。提供。引物引物引物引物 PCR PCR 扩扩增需要在体外根据需要增需要在体外根据需要扩扩增的目的增的目的DNA DNA 各各设设计计一条一条单链单链DNA DNA 片段作上游和下游引物；片段作上游和下游引物；而体内而体内DNADNA复制复制却有所不同，由却有所不同，由RNA RNA 聚合聚合酶酶在在DNA DNA 的模板上合成一段的模板上合成一段RNA RNA 引物。引物。PCR 扩增和DNA 复制过程程的比的比较1.两者都遵循碱基互补配对原则 PCR 扩增和DNA 复制过程程的比的比较2.两者都遵循半保留复制PCR 扩增和DNA 复制过程程的比的比较3

5、.3.模板模板DNA DNA 经加热至经加热至90909595左右一定时间后，左右一定时间后，使模板使模板DNA DNA 双链成为单链。而体双链成为单链。而体内内DNADNA复制的复制的解链需要单链解链需要单链DNADNA结合蛋白（结合蛋白（ssbDNAssbDNA蛋白）、蛋白）、DNADNA解链酶（解链酶（DNA helicaseDNA helicase）等的参与。）等的参与。4.4.体内体内DNA DNA 的复制是的复制是边解旋边复制边解旋边复制，且是，且是半不连半不连半不连半不连续复制续复制续复制续复制：由于：由于DNADNA聚合酶只能以聚合酶只能以5 53 3方向聚合方向聚合子代子代D

6、NADNA链，因此两条亲代链，因此两条亲代DNADNA链作为模板聚合链作为模板聚合子代子代DNADNA链时的方式是不同的。以链时的方式是不同的。以3 35 5方向的方向的亲代亲代DNADNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的，这一条链被称为前导链（续进行的，这一条链被称为前导链（leading leading strand)strand)。而以。而以5 53 3方向的亲代方向的亲代DNADNA链为模板的链为模板的子代链在聚合时则是不连续的，这条链被称为随子代链在聚合时则是不连续的，这条链被称为随从链（从链（lagging strand)lagging strand)。DNADNA在复制时，由随从在复制时，由随从链所形成的一些子代链所形成的一些子代DNADNA短链称为冈崎片段短链称为冈崎片段（Okazaki fragment)Okazaki fragment)。由。由DNADNA连接酶将冈崎片段连接酶将冈崎片段连起来。连起来。PCR PCR 扩增中扩增中2 2 条单链完全解开，分别同条单链完全解开，分别同时以时以5 53 3方向连续合成。方向连续合成。