薄层色谱和柱层析知识分享.ppt

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1、薄层色谱和柱层析叶绿素叶绿素 叶绿素叶绿素叶黄素叶黄素，叶黄素叶黄素 叶绿素的石油醚溶液流经叶绿素的石油醚溶液流经装有装有CaCO3的柱子，然后的柱子，然后用石油醚淋洗用石油醚淋洗.CaCO3对叶绿素各成分吸对叶绿素各成分吸附能力不同，而分离成为附能力不同，而分离成为色带色带.茨维特色谱图茨维特色谱图（1906）色谱法的分类色谱法的分类1)根据流动相分类根据流动相分类:气相色谱气相色谱以气体作流动相液相色谱液相色谱以液体作流动相超临界色谱超临界色谱流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体2)根据固定相的附着方式分类根据固定相的附着方式分类固定相装在圆柱管中固定相装在圆柱管中柱色谱柱色谱固定

2、相涂敷在玻璃或金属板上固定相涂敷在玻璃或金属板上薄层色谱薄层色谱液体固定相涂在纸上液体固定相涂在纸上纸色谱纸色谱3)根据分离机理分类根据分离机理分类分配色谱分配色谱样品组分的分配系数不同样品组分的分配系数不同吸附色谱吸附色谱 样品组分对固定相表面吸样品组分对固定相表面吸 附力不同附力不同体积排阻色谱体积排阻色谱利用固定相孔径不同，利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小把样品组分按分子大小 分开分开离子交换色谱离子交换色谱不同离子与固定相相不同离子与固定相相 反电荷间的作用力大反电荷间的作用力大 小不同小不同 最常用的薄层色谱也属于液-固吸附色谱。同柱色谱不同的是吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄

3、薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。与柱色谱过程相同，经过在吸附剂和展开剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。薄层色谱法薄层色谱法(Thin Layer Chromatography)薄薄层层板板玻璃板玻璃板上涂吸附剂层上涂吸附剂层SiO2Al2O3上行法上行法薄层板薄层板层层析析缸缸展开剂展开剂层层析析缸缸展开剂展开剂滤纸条滤纸条下行法下行法薄层板薄层板薄层色谱法点样及展开过程薄层色谱法点样及展开过程特特 点点 :1.分离能力强，斑点集中；2.灵敏度高；3.展开时

4、间短；4.试样预处理简单；5.上样量大；6.仪器简单操作方便。Rf值测量示意图值测量示意图 Rf与与组组分分性性质质、流流动动相相及及溶溶解解度度有关有关 极极性性组组分分易易保保留，留，Rf 小小 非非极极性性组组分分易易流出流出,Rf大大薄层固定相薄层固定相 按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如硅胶薄层板、聚酰胺薄层板）、反相薄层板（如C18键合相薄层板）等。硅胶薄层板是目前使用最广的薄层板，有硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板和硅胶HF254板等规格。高效薄层板（HPTLC，High Performance TLC）所使用的固定相较普通薄层板平均粒度小，颗粒分布范围窄，因此在相

5、对短的展开距离中可以达到更好的分离效果。薄层点样薄层点样以使用的器具不同，点样可分为手动和自动点样。手动点样主要使用的器具有微升毛细管、微量注射器或配合与之相应的手动点样仪等。自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。以点样方式的不同可分为接触式点样和喷雾点样两种。接触式点样：多采用定量毛细管、微量注射器手动点样，有的仪器也可进行自动接触式点样。接触式点样应注意：正确选择溶解样品的溶剂原点直径一般以3mm为宜防止点样毛细管损伤薄层表面尽量避免多次点样防止点样环形色谱效应点样环形色谱效应：在点样的同时，样品在原点呈环状展开，如果样品在溶剂中的溶解度很大，原点将变成空心环，称为“

6、点样环形色谱效应”。它会对展开造成不良影响。应选择样品组分溶解度相对较小的溶剂以避免此现象的产生。供试液的溶剂在原点的残留，也会改变展开的选择性。极性与展开剂极性相差较大时更为明显；亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分（特别在高湿度环境）对色谱质量的影响也不可低估。因此点样时，应注意选择适宜的溶剂；同步干燥或上样后继后干燥以除去原点残存的溶剂。尽可能避免高温加热，以免遇热不稳定的成分的破坏导致样品中某些成分的变性；在板的一端划一条线，作为起点线。点样后的斑点直径一般不超过0.5cm。5 cm15-18 cm0.5 cm2 cm薄层板示意图展开剂浸入高度起跑线前沿线展展 开开 选择大小适合的展开

7、容器，将点有样品的薄层板放入容器内的展开剂中，浸入深度以展开剂液面距点样基线5mm为宜，密闭，展开。一般上行展开8-15cm，高效薄层板上行展开5-8cm。在溶剂前沿达到预定展距后，取出薄层板，晾干，待检测。展开方式主要有上行展开、下行展开、双向展开、水平展开、环形展开等。目前多采用上行展开。边缘效应：薄层展开后，位于薄层板边缘的样品斑点比移值较处于中间的斑点大的现象。边缘效应会使斑点扩散变形，从而影响样品定性结果的判断。薄层扫描定量时，斑点的形状直接影响到扫描后的峰高和峰宽，从而影响定量结果的准确性。边缘效应示意图预饱和是减少边缘效应预饱和是减少边缘效应的有效办法！的有效办法！预饱和：可在加

8、入展开剂后使展开容器密闭，放置15-30分钟，待溶剂蒸汽平衡后，迅速放入点有样品的薄层板，立即密闭，展开。必要时可放置适当大小的滤纸促使展开缸内蒸汽达到饱和。1530min展 开1530min倾 倒展 开常用展开剂 对展开剂的要求对被测组分有良好的溶解性；有良好的分离效果；斑点圆整不拖尾；Rf值最好在0.3-0.5，组分较多最好在0.25-0.75；展开剂不能和被测组分发生反应；沸点适中，粘度较小。用单一溶剂为展开剂时，由于溶剂组分简单，分离重现性好，对于难分离的化合物经常要用二元、三元甚至多元溶剂组成的展开剂。在混合展开剂中占比例大的主要溶剂起溶解物质和基本分离的作用，比例较小的溶剂起调整改

9、善分离物质的Rf值及对某些物质的选择作用。一般主要溶剂选用不易形成氢键的溶剂，或极性比分离物质低的溶剂，否则将使被分离物质的Rf值太大或甚至跟随溶剂前缘移动。在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高分离度，用粘度太大的溶剂时，需要加入一种溶剂以降低展开剂的粘度、加快展开速度。例：环己烷丙酮二乙胺水（10:5:2:5）这个系统中，水是极性大的溶剂，环己烷是极性小的溶剂，后者的加入可以降低分离物质的Rf值，丙酮起着混合整个系统及降低展开剂粘度的作用，少量二乙胺的加入控制了展开剂的pH值以使分离后的斑点不致拖尾，分离清晰。显显 色色1.有色化合物直接定位2.无色紫外吸收紫外灯检出显色

10、剂定位喷雾显色（喷雾后加热显色）蒸气熏蒸显色显色剂：通用有碘、硫酸浸渍显色盛有显色剂的展开缸有荧光斑有暗斑碘蒸气在浅黄色背景上，很多有机化合物吸附碘，可逆地产生棕色到黄色斑点，不少化合物的检测灵敏度可达0.51g。10%硫酸乙醇液，喷雾后于105加热1015min，日光或紫外光下观察。大多数有机物呈有色斑点，如红色、棕色和紫色等，在炭化以前，不同的化合物将出现一系列颜色的改变，被炭化的化合物常出现荧光。高锰酸钾硫酸液，结果为粉底本色上产生白色斑点。25%高氯酸水液，喷雾后加热至150 观察。1020五氯化锑的四氯化碳液，或三氯化锑的乙醇饱和溶液。喷雾后，在100120 加热，日光下和紫外光下观

11、察，这也是有机化合物的通用试剂，和很多有机化合物产生不同的颜色。还有很多专属性显色剂，种类繁多，如有需要可参阅有关书籍。定性和定量分析（一）定性1.利用Rf值定性（或相对比移值Rr）2.Rf值斑点颜色特征（原位化学反应）3.多种展开剂体系展开进行验证4.与其他技术联用展展开开后后的的薄薄层层板板（二）定（二）定 量量 1.目视比较法目视比较法 将不同量的标准品作为系列，同样样品分别点在同一薄层上展开，显色后，目测比较斑点颜色的深浅和面积大小，求出未知物含量的近似值，作为半定量法，精密度为10%。例：硫酸长春碱的纯度检查（中国药典方法）色谱条件：硅胶GF254制成的薄层板，展开剂为石油醚（305

12、0）氯仿丙酮二乙胺（12:6:1:1）,根据硫酸长春碱结构在紫外灯（254nm）下检测。2.洗脱法洗脱法 样品经色谱分离后，用适当方法定出色点或色带位置，然后将色点部位的吸附剂取下，用溶剂将化合物洗脱萃取后进行测定。3.薄层扫描法薄层扫描法 用仪器来测定每个斑点或谱带的含量，则更方便和客观，误差在5以下。类别薄层展开剂显色剂生物碱氧化铝硅胶1）氯仿+5-15%甲醇2）苯+1-10%乙醇等1）改良的碘化铋钾试剂2）碘蒸气甾体氧化铝硅胶1）环己烷：乙酸乙酯=7：32）氯仿：丙酮=9：13）甲酸：乙酸：水=5：5：11）5%磷钼酸2）三氯化锑-氯仿溶液氨基酸氧化铝硅胶1）正丁醇+50%乙醇2）甲醇：

13、乙酸=97：3水合茚三酮溶液酚类硅胶1）苯2）环己烷：氯仿：二乙胺=5：5：15%三氯化铁溶液纤维素1）丁醇：醋酸：水=4：1：52）苯：醋酸：水=2：2：1或1：1：2醛类硅胶1）苯：石油醚=1：12）苯+5%乙酸乙酯邻联茴香胺乙酸溶液黄酮类及其单糖甙类纤维素1）70%醋酸2）30%醋酸3）丁醇：醋酸：水=4：1：51%三氯化铝的乙醇溶液 几类化合物的薄层色谱柱色谱法柱色谱法 (Column Chromatograph)柱色谱是较经典的有机物分离技术，原理和薄层色谱相同，但装置有所不同，主要由一个均匀玻璃柱和填充填料组成，填料是决定柱效的主要因素，填料必须满足具有不溶于所使用流动相、不使欲分

14、离的样品破坏或分解、惰性大、可逆性强和吸附容量大。同时，填料颗粒直径要均匀。最常见的柱色谱是硅胶色谱、氧化铝色谱、离子交换柱色谱、聚酰胺柱色谱和凝胶柱色谱。慢慢中等中等快快柱柱柱柱分离分离分离分离淋洗液淋洗液一、分配柱色谱一、分配柱色谱 分配柱色谱是利用混合物中各组分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同，而得到分离的方法，分为正相和反相分配色谱两种类型：正相分配色谱：以水或亲水性溶剂为固定（液）相，以水不相混溶的有机溶剂作移动相的分配色谱称为正相分配色谱。一般而言，分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物，常用正相分配色谱。反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定（液）相

15、，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为反相分配色谱。当分离脂溶性或极性较小的成分，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反相分配色谱。实践中有70%以上的分配色谱都采用反相色谱。分配柱色谱的应用分配柱色谱的应用分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸、酚类及氨基酸的衍生物；对某些非极性化合物，如油脂、甾体等物质，可采用反相分配柱色谱法。应用实例：狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离应用实例：狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离支持剂：国产层析硅胶80100目，加2/3量的水（以乙酸乙酯饱和），调匀，再以乙酸乙酯（水饱和）浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度

16、比 1:2 以上。实验方法：取样品与1 2倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙酯（含0.5%甲醇）洗脱，分部收集，各流分均作纸色谱及薄层色谱检查，比移值相同的流分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得到洋地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷三种单体。二、吸附柱色谱二、吸附柱色谱 吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有吸附剂的柱子中，再加适当的溶剂（洗脱剂）冲洗，由于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。柱色谱装置如图示。混合物中含A、B两个组分，溶解后加至色谱柱中。开始A和B都被吸附在柱的上

17、端，形成原始谱带。当加入洗脱剂冲洗时，A和B将随着向下流动而从吸附剂上洗脱，接着又遇到吸附剂又被吸附，又随着向下流动的洗脱剂冲洗而被洗脱，如此连续不断地被再吸附、再洗脱，经过一段时间的冲洗后，由于A、B的极性不同，在该吸附剂和洗脱剂上被吸附和被洗脱的性能也不同，最终出现A、B两个色谱带。由于A的吸附力小于B，故A 移行较快，在色谱柱下段，而B移行较慢，在柱的上段。继续用溶剂冲洗，A、B将先后被洗脱出来。分别定量收集洗脱液，用TLC跟踪检验，斑点相同的流分A、B两个纯品化合物。1、硅胶柱色谱硅胶柱色谱 层析硅胶为一多孔物质，可用通式SiO2.xH2O表示，它具有多孔性硅氧烷交联结构，由于其骨架表

18、面具有很多游离和键合活性状态硅醇基团，硅胶能通过氢键与极性或不饱和分子相互作用。硅胶的吸附能力与硅羟基数量有关。另外，硅胶随着含水量的增加活性降低，若硅胶游离水高达17，其吸附能力极低。色谱用硅胶应该是中性无色颗粒，但是由于制造过程常接触强酸，故在实验前一般要检查酸性，不低于pH=5才可使用，而且使用前一般经120C烘24h活化。硅胶柱色谱适用范围广，能适用于非极性混合物，也能用于极性混合物，如芳香烃、萜类、甾体、生物碱、蒽醌、酚类、磷脂类、脂肪酸和氨基酸等有机物分离。2、氧化铝柱色谱氧化铝柱色谱 氧化铝柱色谱是另一种最常用色谱方法。氧化铝是由Al(OH)3直接在高温下（约600C）脱水制得，

19、主要形成-Al2O3。现在用于柱色谱的氧化铝商品分为中性、碱性和酸性三种。中性氧化铝适用于分离醛酮、萜类以及对酸碱不稳定的酯和内酯有机物；酸性氧化铝适用于有机酸、酸性氨基酸和酚类物质的分离，而碱性氧化铝对于分离植物中碱性成分如生物碱颇为理想，也适用于萜类、甾体、强心苷等化合物的分离。和硅胶一样，氧化铝的活性与含水量关系极大，在一定温度下除去水分，就可以使氧化铝活化，加入一定量水即可使活性改变。氧化铝的活化比硅胶所需的温度要高得多，因而需要在高温炉中进行，常规的烘箱不能完成对氧化铝的活化。硅胶和氧化铝均为极性吸附剂，有以下特性：a)对极性物质具有较强的亲和能力。同为溶质，极性强者优先被吸附。b)

20、溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力随之减弱。c)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂，又被后者置换洗脱下来。3、活性炭柱色谱活性炭柱色谱 其吸附作用与硅胶和氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和力，水溶液中吸附最强，有机溶剂中较弱。一定条件下，对芳香化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子量化合物的吸附力大于小分子量化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。4、聚酰胺柱色谱聚酰胺柱色谱 聚酰胺是通过酰氨基聚合而成的一类高分子化合物，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物

21、等形成氢键结合而被吸附，而使这些有机物与不能形成氢键的化合物分离。聚酰胺柱色谱法主要用于酚类黄酮体、蒽醌等有机物的分离。三、离子交换柱色谱三、离子交换柱色谱离子交换柱色谱是用离子交换树脂代替硅胶和氧化铝作为填料的一种柱色谱方法。离子交换树脂是一种多功能基高分子化合物。每个树脂颗粒都由交联的具有三维空间立体结构的网络骨架组成，在骨架上连接许多可以活动的功能基，这种功能基能离解出离子，可以与周围的外来离子相互交换，而且这种交换是可逆的。根据所交换离子性质的不同，离子交换树脂分为阳离子和阴离子交换树脂。每类树脂根据它的离解性能大小，又分为强、中、弱型。离子交换柱色谱方法在工业上用途很广，可用于氨基酸

22、、肽类、生物碱、有机酸、酚类等天然有机物的分离。四、凝胶柱色谱四、凝胶柱色谱 凝胶柱色谱是利用凝胶微孔的分子筛作用对分子大小不同的物质进行分离的一种柱色谱法。当被分离有机物质的分子大小不同时，它们能够进入凝胶内部的能力出现差异。各组分在凝胶柱色谱中被洗脱出柱的先后顺序基本上是按分子大小排列的，即按分子由大到小流出，从而得到分离。这种在凝胶柱色谱中分离多种成分时，组分按分子量递减的顺序先后从柱中流出的现象，称凝胶柱色谱的洗脱规律。影响柱色谱分离效果的主要因素及柱色谱的操作技术影响柱色谱分离效果的主要因素及柱色谱的操作技术一、影响柱色谱分离效果的主要因素固定相的选择洗脱剂的选择在柱色谱中，用于冲洗

23、加有样品柱子的溶剂（单一溶剂或混合溶剂），习惯上称洗脱剂。洗脱剂的选择，对组分分离关系极大。溶剂的洗脱能力，主要取决于溶剂的极性，可根据溶剂的介电常数作大致判断。在柱色谱中，洗脱剂的洗脱能力还与被分离物质的极性和所选用的固定相性质有密切关系。溶剂的介电常数大小顺序是：水 甲醇 乙醇 丙酮 乙酸乙酯 乙醚 三氯甲烷 二氯甲烷 苯 四氯化碳 环己烷 正庚烷 正己烷（石油醚）。为了寻找合适的洗脱剂，应先作薄层或纸色谱试验，找到合适的溶剂系统后再应用到柱色谱中去。如单一溶剂洗脱效果不好，可用混合溶剂，对成分复杂的混合物可用梯度洗脱。洗脱溶剂的选择应结合被分离物质与固定相的性质来考虑。吸附剂洗脱剂的洗脱

24、能力氧化铝、硅胶石油醚 已烷 苯 甲苯 乙醚 氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 甲醇 水聚酰胺二甲基甲酰胺 稀NaOH水溶液或稀氨水液 丙酮 95%乙醇 30%乙醇 水活性炭水 10%乙醇 30%乙醇 95%乙醇 常用溶剂的介电常数()及其极性排列溶剂水溶度(g/100g)极性己烷1.880.007弱苯2.290.06乙醚（无水）4.471.3氯仿5.200.1乙酸乙酯6.113.0乙醇26甲醇31.2水81.0强被分离物质的性质被分离物质与固定相、洗脱剂共同构成柱色谱中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的固定相与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况直接与被分离物质的结构与性质有关。首先要考虑被分离物质

25、的极性。常见官能团极性强弱顺序是：RCOOH ArOH HOH ROH RNH2 RSH RCHO RCOR RCOOR RN(CH3)2 RNO2 ROCH3 CH=CH CH2CH2。有机化合物极性强弱的大致判断：例如葡萄糖，因分子中含有许多-OH，故为极性化合物。又如氨基酸，因分子结构中既有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸，如硬脂酸C17H35COOH，虽也含有羟基这样的强极性官能团，但分子的主体由长链烃基所组成，故极性依然很弱。在选择柱色谱分离条件时，要根据被分离物质的性质、固定相及洗脱剂的性质这三者的相互关系来考虑。欲分离中等极性的物质，需选用中等极性的洗脱剂和中等活性

26、的吸附剂。同理，欲分离极性较强的物质，需选用极性较强的洗脱剂和极性较弱的吸附剂。如被分离物质的极性较小，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。二、柱色谱的操作技术任何柱色谱操作都存在装柱、上样和洗脱三个步骤：l装柱好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。主要问题是要保证固定相在柱中均匀紧凑，不能有气泡或裂痕出现。一般柱子的直径与长度比为1:1050。硅胶量是样品量的3040倍，具体的选择要具体分析。关闭层析柱出水口，装入1/3柱高的缓冲液，将吸附剂缓慢地倒入柱中。打开出水口，控制适当流速，使吸附剂均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品

27、的多少而定）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有23cm高的缓冲液，同时关闭出水口。l上样过程一般要迅速，样品最好用洗脱剂相同的溶剂溶解，而且必须将上样时可能粘附在柱上层的样品洗到固定相中才能再加洗脱剂进行淋洗。加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。上样的方法有干法和湿法两种。湿法一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，溶剂越少越好。干法上柱中硅胶量根据样品而定，应保证在旋干后，看不到明显的样品存在。最好在柱中不超过23cm，以确保分离效率。l洗脱的过程关键是选择合适的洗脱溶剂，洗脱剂的选择一般先用薄

28、层板试验多次后确定。洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度

29、、极性、离子强度或pH值等。l最后一个重要的问题是柱色谱分离组分的收集。在收集之前要对不同分离组分进行检测。u一般的检测方法是用荧光薄层板随时接一滴流出液，吹干溶剂后在紫外灯下看是否有斑点，若有斑点就应作为组分收集，直至斑点消失。同样方法操作直至收集全部组分。u也可采用等体积收集流出的全部洗脱液，即用收集瓶以10ml 或20ml等体积收集从柱中流出的全部洗脱液，待整个柱层析完成后，用测定液体折射率和薄层板显色等方法确定收集的洗脱液是否含有组分，然后合并含有相同组分的洗脱液。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢