齐鲁医学细胞培养1.pptx

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1、 郎朗郎朗E-mail:组织和细胞培养技术组织和细胞培养技术2021/7/27星期二1参考书目：参考书目：组织和细胞培养技术主编：章静波组织和细胞培养技术主编：章静波人肿瘤细胞培养主编人肿瘤细胞培养主编:R.R.弗雷纳弗雷纳 R.I.R.I.弗雷谢尼弗雷谢尼细胞培养细胞培养主编：司徒镇强主编：司徒镇强 吴军正吴军正2021/7/27星期二2第一章第一章 引引 论论一、组织培养的诞生与发展简史一、组织培养的诞生与发展简史18861886，His His 提出原始的胚胎神经元或成提出原始的胚胎神经元或成神经细胞的细胞质向外突起而形成轴突，不神经细胞的细胞质向外突起而形成轴突，不断延伸，直至其前端与

2、周围感觉器官或肌肉断延伸，直至其前端与周围感觉器官或肌肉纤维接触为止。纤维接触为止。18901890，Cajal Cajal 应用胚胎神经组织切片的银应用胚胎神经组织切片的银渍染色技术研究神经元的发生，结果支持了渍染色技术研究神经元的发生，结果支持了HisHis的学说。的学说。2021/7/27星期二3反对反对HisHis和和CajalCajal的学者的学者 坚持坚持“细胞链细胞链”的理论，的理论，从成神经细胞到某种受神经支配的周围组织之间从成神经细胞到某种受神经支配的周围组织之间有许多分散的细胞，这些连贯的链细胞融合便形有许多分散的细胞，这些连贯的链细胞融合便形成了轴突。成了轴突。19071

3、907，Harrison Harrison 悬滴培养法，取蛙胚一片悬滴培养法，取蛙胚一片组织，采用成洼淋巴做培养基，能存活一周。组织，采用成洼淋巴做培养基，能存活一周。19101910，Burrows Burrows 用鸡血浆作为鸡胚组织的用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心支持和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。脏组织及皮肤生长良好。2021/7/27星期二4BurrowsBurrows和和Carrel Carrel 成功培养了成年狗、猫、成功培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠以至恶性组织的外植物。此外，证明小鼠、豚鼠以至恶性组织的外植物。此外，

4、证明传代可延长细胞的寿命。同时，若把胚胎提取液传代可延长细胞的寿命。同时，若把胚胎提取液与血浆混合使用，存活的更好。与血浆混合使用，存活的更好。CarrelCarrel（外科大夫）（外科大夫）发明卡式培养瓶发明卡式培养瓶W.H.LewisW.H.Lewis和和M.R.Lewis M.R.Lewis 发展出许多合成培养基发展出许多合成培养基19291929，Fell Fell 组织培养组织培养我国始于我国始于2020世纪世纪3030年代年代2021/7/27星期二52021/7/27星期二6卵细胞的形成过程卵细胞的形成过程2021/7/27星期二72121三体综合征三体综合征先天愚型先天愚型 2

5、1-21-三体综合症的病因为染色体数目异常，患者比正常人多一条三体综合症的病因为染色体数目异常，患者比正常人多一条2121号染色体。其多余的染色体号染色体。其多余的染色体80%80%来自母亲，来自母亲，20%20%来自父亲。随着母来自父亲。随着母亲年龄升高，发病的风险增大。亲年龄升高，发病的风险增大。据估计我国目前大约有据估计我国目前大约有6060万以上的万以上的2121三体综合症患儿，按目前的三体综合症患儿，按目前的出生率我国平均出生率我国平均2020分钟就有一例分钟就有一例2121三体综合症患儿出生，全国每年三体综合症患儿出生，全国每年出生的唐氏综合症患儿将达出生的唐氏综合症患儿将达270

6、0027000例左右。例左右。苏联遗传学家达拉森科和鲁夏诺娃对一些科学家的意见作了归纳：苏联遗传学家达拉森科和鲁夏诺娃对一些科学家的意见作了归纳：一些人如斯特尔等认为，这是内分泌紊乱造成的，特别在一些年龄一些人如斯特尔等认为，这是内分泌紊乱造成的，特别在一些年龄偏大的妇女中；另一些人的假说认为，主发是药物、食物和饮水中偏大的妇女中；另一些人的假说认为，主发是药物、食物和饮水中的化学物质，引起了生殖细胞中染色体的异常。他们发现，在美国的化学物质，引起了生殖细胞中染色体的异常。他们发现，在美国中部中部2121三体综合症的发生率与水中氟的浓度有关。三体综合症的发生率与水中氟的浓度有关。2021/7/

7、27星期二8头颅小而圆，枕部平，脸圆，鼻扁平，头颅小而圆，枕部平，脸圆，鼻扁平，睑裂细且向外上倾斜，眼距过宽，内眦睑裂细且向外上倾斜，眼距过宽，内眦赘皮明显，睫毛短而稀疏，常有斜视。赘皮明显，睫毛短而稀疏，常有斜视。虹膜时有白斑，常有晶体混浊。嘴小唇虹膜时有白斑，常有晶体混浊。嘴小唇厚，舌大常外伸，耳小，低位耳，耳廓厚，舌大常外伸，耳小，低位耳，耳廓畸形。头发直而不卷曲。颈背部短而宽，畸形。头发直而不卷曲。颈背部短而宽，有过剩的皮肤。患者的平均寿命只有有过剩的皮肤。患者的平均寿命只有16.216.2岁。岁。5050的患儿在的患儿在5 5岁前即死亡。只岁前即死亡。只有有8 8的患者活过的患者活过

8、4040岁，岁，2.62.6活过活过5050岁。岁。患者的寿命通常取决于有无严重的先天患者的寿命通常取决于有无严重的先天性心脏病和消化管畸形以及抗感染能力性心脏病和消化管畸形以及抗感染能力的降低程度。的降低程度。2021/7/27星期二9二、组织培养常用术语二、组织培养常用术语1.1.Cell culture(Cell culture(细胞培养细胞培养):):单个细胞在体外条单个细胞在体外条件下的生长。件下的生长。2.Cell line(2.Cell line(细胞系细胞系):):原代培养物经首次传代成原代培养物经首次传代成功后即成。功后即成。3.3.Cell strain(Cell stra

9、in(细胞株细胞株):):具有某些特征与标志的具有某些特征与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特征或标细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特征或标志在尔后的培养中必须保持下去。志在尔后的培养中必须保持下去。4.4.Cell cycle(Cell cycle(细胞周期细胞周期):):细胞从前一次分裂结细胞从前一次分裂结束至本次分裂结束所经历的时相。束至本次分裂结束所经历的时相。2021/7/27星期二105.5.Clone(Clone(克隆克隆):):单个细胞通过有丝分裂形成单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。的细胞群体，他们的遗传特性相同。6.6.Contact inh

10、ibition(Contact inhibition(接触抑制接触抑制):):体外培体外培养的贴壁细胞，相互接触时，便停止了分裂养的贴壁细胞，相互接触时，便停止了分裂增殖。增殖。7.7.Primary culture(Primary culture(原代培养原代培养):):直接取自生直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。物体细胞、组织或器官开始的培养。8.8.Seeding efficiency(Seeding efficiency(贴壁率贴壁率):):在一定时在一定时间内，接种细胞贴附于培养皿表面的百分率。间内，接种细胞贴附于培养皿表面的百分率。2021/7/27星期二119.9.Sub

11、-culture(Sub-culture(传代培养传代培养):):在体外培养条件在体外培养条件下，将细胞从一个培养皿移至另一个培养皿。下，将细胞从一个培养皿移至另一个培养皿。10.10.Suspension culture(Suspension culture(悬浮培养悬浮培养):):细胞或细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式。培养方式。11.11.Tissue culture(Tissue culture(组织培养组织培养):):组织在体外组织在体外条件下保存或生长。条件下保存或生长。1212.Apoptosis(Apoptosis(细胞

12、凋亡细胞凋亡):):细胞内死亡程序的细胞内死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程，常称为程序性开启而导致细胞自杀的过程，常称为程序性细胞死亡。细胞死亡。2021/7/27星期二12第二章第二章 细胞培养的设备条件细胞培养的设备条件 一、细胞培养中常用的仪器设备一、细胞培养中常用的仪器设备1.1.无菌室：密闭性；通风透气良好；便于消无菌室：密闭性；通风透气良好；便于消毒；方便进出毒；方便进出2.2.超净工作台超净工作台:使无菌空气以微流使无菌空气以微流(0.32-0.48(0.32-0.48米米/秒秒)方式，从工作台内流向工作台外。方式，从工作台内流向工作台外。3.3.纯水器：纯水器：18.2M18

13、.2M,25,254.4.压力蒸气消毒器压力蒸气消毒器:玻璃器皿玻璃器皿(121(121,30min),30min),塑料（塑料（115115,15min),15min)2021/7/27星期二135.5.电热恒温干燥箱电热恒温干燥箱:平衡培养的器材、试剂的平衡培养的器材、试剂的温度。温度。6.6.COCO2 2培养箱：培养箱：5%CO5%CO2 2,37,37,70%,70%酒精消毒内腔，酒精消毒内腔，加入无菌水，保证湿度，加入加入无菌水，保证湿度，加入CuSOCuSO4 4,预防霉菌。预防霉菌。7.7.恒温水浴锅：与细胞接触的液体要求保存与恒温水浴锅：与细胞接触的液体要求保存与于于4 4或

14、或-20-20，使用时，须预热。，使用时，须预热。8.8.液氮罐：常用液氮罐：常用3535和和5050立升两种，一般一周充立升两种，一般一周充一次，液氮温度达一次，液氮温度达-196-196。2021/7/27星期二149.9.倒置显微镜：观察细胞生长状态倒置显微镜：观察细胞生长状态10.10.离心机：在分离、传代和处理培养的细胞时，离心机：在分离、传代和处理培养的细胞时，常用离心的方法收集细胞。常用离心的方法收集细胞。11.11.无菌过滤器：无菌过滤器：ZeissZeiss滤器滤器(不锈钢不锈钢)，玻璃滤器，玻璃滤器及微孔滤膜滤器。及微孔滤膜滤器。12.12.洗刷装置洗刷装置13.13.细胞

15、计数板和电子细胞计数仪细胞计数板和电子细胞计数仪2021/7/27星期二15nCO2CO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37 37，5 5COCO2 2 。n使用使用CO2CO2培养箱培养细胞时应注培养箱培养细胞时应注意的问题：意的问题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。将瓶盖微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定保持培养箱内空气干净。定期消毒期消毒n箱内灭菌蒸馏水箱内灭菌蒸馏水30003000毫升蒸馏毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。养液蒸发。CO2CO2培养箱培养箱2021/7/27星期二16干

16、燥箱干燥箱水浴锅水浴锅2021/7/27星期二17滤器滤器纯水仪纯水仪2021/7/27星期二182021/7/27星期二19液氮罐液氮罐离心机离心机2021/7/27星期二20酶标仪酶标仪 微孔板震荡器微孔板震荡器2021/7/27星期二212021/7/27星期二22二、细胞培养的无菌环境二、细胞培养的无菌环境1.1.无菌室：相对的密闭、防尘、防菌无菌室：相对的密闭、防尘、防菌1.1 1.1 无菌室的结构无菌室的结构1.2 1.2 无菌室的消毒和防污染：每日使用前紫外线无菌室的消毒和防污染：每日使用前紫外线照射照射(1-2h),(1-2h),每周甲醛、乳酸或过氧乙酸熏蒸每周甲醛、乳酸或过氧

17、乙酸熏蒸(2h),(2h),每月新洁儿灭擦拭地面和墙壁。每月新洁儿灭擦拭地面和墙壁。2.2.超净工作台超净工作台2.1 2.1 原理原理2.2 2.2 使用和保养：使用前开启紫外灯照射使用和保养：使用前开启紫外灯照射10-10-30min30min。然后让超净工作台预工作。然后让超净工作台预工作10-15min10-15min，以去，以去除臭氧和使台面空间呈净化状态，使用完毕，用除臭氧和使台面空间呈净化状态，使用完毕，用70%70%酒精擦拭干净。酒精擦拭干净。2021/7/27星期二232021/7/27星期二24n超净工作台的工作原理是超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高利用鼓风机

18、驱动空气通过高效滤器除去空气中的微生物，效滤器除去空气中的微生物，使空气得到净化，并使无菌使空气得到净化，并使无菌空气以微流（空气以微流（0.32-0.480.32-0.48米米/秒）方式，从工作台的工作秒）方式，从工作台的工作空间流向工作空间以外，保空间流向工作空间以外，保证工作空间的绝对证工作空间的绝对“无菌无菌”。超净工作台超净工作台2021/7/27星期二25三、常用的培养器皿三、常用的培养器皿1.1.玻璃器皿：玻璃器皿：玻璃瓶玻璃瓶培养瓶培养瓶2021/7/27星期二26培养皿培养皿移液管移液管离心管离心管2021/7/27星期二272.2.塑料器皿塑料器皿培养瓶培养瓶2021/7/

19、27星期二28培培 养养 板板2021/7/27星期二29一次性滤头一次性滤头滤头滤头2021/7/27星期二30微量离心管（微量离心管（EppendorfEppendorf管）管）2021/7/27星期二31四、培养器皿的清洗与消毒四、培养器皿的清洗与消毒1.1.玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗1.1 1.1 浸泡浸泡1.2 1.2 刷洗刷洗1.3 1.3 浸酸浸酸1.4 1.4 冲洗冲洗成分成分 弱清洁液弱清洁液 次强酸清洁液次强酸清洁液 强酸清洁液强酸清洁液重铬酸钾重铬酸钾(g)100 120 63(g)100 120 63硫酸硫酸(ml)100 200 1000(ml)100 200 10

20、00蒸馏水蒸馏水(ml)1000 1000 200(ml)1000 1000 2002021/7/27星期二322.2.橡胶制品的清洗橡胶制品的清洗新购置的橡胶制品（胶塞，胶管、橡皮乳头）新购置的橡胶制品（胶塞，胶管、橡皮乳头）的洗涤方法：的洗涤方法：0.50.5mol/L NaOHmol/L NaOH煮沸煮沸1515分钟分钟 0.5 0.5mol/Lmol/L HClHCl煮沸煮沸1515分钟分钟 流水冲洗流水冲洗 自来水煮沸自来水煮沸2 2次次 蒸馏水煮沸蒸馏水煮沸2020分钟分钟 50 50烤干备用烤干备用用过的胶塞：用过的胶塞：基本同玻璃器皿，但洗刷的重点是使用面，应基本同玻璃器皿，但

21、洗刷的重点是使用面，应逐个刷洗，单蒸、双蒸冲洗后，用双蒸煮沸逐个刷洗，单蒸、双蒸冲洗后，用双蒸煮沸3030分钟。分钟。2021/7/27星期二333.3.塑料制品的清洗塑料制品的清洗塑料制品的特点：质地软、易出现划痕；耐腐塑料制品的特点：质地软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。蚀能力强、但不耐热。清洗程序：流水冲洗，浸泡，纱布或棉签刷洗，清洗程序：流水冲洗，浸泡，纱布或棉签刷洗，冲洗，晾干，浸于清洁液中冲洗，晾干，浸于清洁液中15min15min，冲洗，凉干，冲洗，凉干备用。备用。4.4.包装包装常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金

22、属的消毒筒。饭盒、玻璃或金属的消毒筒。2021/7/27星期二344.4.消毒和灭菌消毒和灭菌4.1 4.1 紫外线消毒紫外线消毒紫外线是一种低能量的电磁辐射，革兰阴性菌最紫外线是一种低能量的电磁辐射，革兰阴性菌最为敏感，其次是革兰阳性菌，再次为芽孢。为敏感，其次是革兰阳性菌，再次为芽孢。直接作用机制：破坏微生物的核酸及蛋白质等而直接作用机制：破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活使其灭活间接作用机制：紫外线照射产生的臭氧杀死微生间接作用机制：紫外线照射产生的臭氧杀死微生物物4.2 4.2 电离辐射灭菌：是以放射性核素产生的电离辐射灭菌：是以放射性核素产生的射射线或电子加速器产生的加速离子辐照物

23、品以杀死线或电子加速器产生的加速离子辐照物品以杀死微生物的方法。微生物的方法。2021/7/27星期二354.3 4.3 高温湿热灭菌：高温湿热灭菌：压力蒸汽灭菌，造成蛋白质变性凝固使微生物死压力蒸汽灭菌，造成蛋白质变性凝固使微生物死亡。玻璃类灭菌（亡。玻璃类灭菌（121121，3030分钟）；橡胶、塑分钟）；橡胶、塑料类（料类（115115，1515分钟）消毒好的物品，应立即分钟）消毒好的物品，应立即放到放到60-7060-70烤箱内烘干备用烤箱内烘干备用煮沸消毒也是常用的方法煮沸消毒也是常用的方法4.4 4.4 高温干热灭菌：电烤箱的物品加热到高温干热灭菌：电烤箱的物品加热到160160以

24、上，并保持以上，并保持90-12090-120分钟，达到灭菌目的。分钟，达到灭菌目的。灼烧也是干热灭菌的方法之一。灼烧也是干热灭菌的方法之一。4.5 4.5 过滤除菌：微孔膜过滤过滤除菌：微孔膜过滤2021/7/27星期二364.6 4.6 甲醛：其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及甲醛：其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用，用于无菌室的空气真菌等微生物均有杀灭作用，用于无菌室的空气和物体表面的灭菌。和物体表面的灭菌。(1)(1)多聚甲醛加热法：多聚甲醛加热法：10-20g/m10-20g/m2 2,作用作用12-24h12-24h(2)(2)甲醛水溶液蒸发法甲醛水溶液蒸发法:

25、25ml/m:25ml/m2 2 ，时间同，时间同(3)(3)氧化法氧化法:福尔马林福尔马林40ml/m40ml/m2 2,高锰酸钾高锰酸钾30g/m30g/m2 2 (漂白粉漂白粉20g/m20g/m2 2)。4.7 4.7 环氧乙烷：消毒塑料用品、不耐高热高压以环氧乙烷：消毒塑料用品、不耐高热高压以及不能受潮湿的物品，环氧乙烷易燃易爆，且气及不能受潮湿的物品，环氧乙烷易燃易爆，且气体有毒，不可用于空气消毒。体有毒，不可用于空气消毒。2021/7/27星期二374.8 4.8 乙醇：对其他灭菌剂有增效或协同作用，乙醇：对其他灭菌剂有增效或协同作用，如：戊二醛、碘伏、氯已定（洗必泰）。消毒如：

26、戊二醛、碘伏、氯已定（洗必泰）。消毒浓度为浓度为70%-75%70%-75%的乙醇水溶液。的乙醇水溶液。4.9 4.9 氯乙定：主要用于皮肤及创面消毒。用氯乙定：主要用于皮肤及创面消毒。用0.02%0.02%洗必泰和洗必泰和0.5%0.5%洗必泰乙醇溶液洗必泰乙醇溶液(70%(70%乙醇乙醇配制配制)消毒手及动物创面的洗涤消毒。消毒手及动物创面的洗涤消毒。4.10 4.10 戊二醛戊二醛:现将戊二醛原液稀释成现将戊二醛原液稀释成2%2%水溶液，水溶液，再加入再加入0.3%0.3%NaHCONaHCO3 3,将溶液调至将溶液调至Ph7.5-8.5Ph7.5-8.5，另另加入加入0.5%0.5%亚

27、硝酸钠可防锈和增效。亚硝酸钠可防锈和增效。2021/7/27星期二384.11 4.11 新洁而灭：新洁而灭：0.1%0.1%水溶液可对器械、皮肤、水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。操作表面进行擦拭和浸泡消毒。4.12 4.12 碘伏和碘酊：医用碘伏是聚烯吡咯烷酮碘伏和碘酊：医用碘伏是聚烯吡咯烷酮-碘，可用于手消毒和手术野的皮肤消毒。也可碘，可用于手消毒和手术野的皮肤消毒。也可将将1%1%碘伏用于地面、台面及物品表面等的擦拭碘伏用于地面、台面及物品表面等的擦拭或喷雾消毒。或喷雾消毒。碘酊又名碘酒，主要用于皮肤消毒，皮肤经碘碘酊又名碘酒，主要用于皮肤消毒，皮肤经碘酒涂抹酒涂抹2-

28、32-3次后，须用次后，须用70%70%乙醇脱碘。乙醇脱碘。2021/7/27星期二39第三章第三章 组织培养基组织培养基一、培养基的基本要求一、培养基的基本要求1.1.营养成分：氨基酸、单糖、维生素营养成分：氨基酸、单糖、维生素 、无机、无机离子和微量元素离子和微量元素2.2.促生长因子及激素：各种激素、生长调节因促生长因子及激素：各种激素、生长调节因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化的或未分化的）具有十分重要的作用。（分化的或未分化的）具有十分重要的作用。3.3.渗透压：人血浆渗透压约渗透压：人血浆渗透压约290290mOsm/kgmOsm/kg

29、，是培是培养人体细胞的理想渗透压。大多数哺乳类动养人体细胞的理想渗透压。大多数哺乳类动物细胞，渗透压在物细胞，渗透压在260-320 260-320 mOsm/kgmOsm/kg的范围的范围内都适宜。内都适宜。2021/7/27星期二404.4.pH:pH:适宜适宜pHpH为为7.2-7.47.2-7.4，合成培养基中使用了，合成培养基中使用了NaHCONaHCO3 3-CO-CO2 2缓冲系统，并采用开放式培养的方式，缓冲系统，并采用开放式培养的方式，使细胞代谢产生的使细胞代谢产生的COCO2 2及时逸出培养皿，再通过及时逸出培养皿，再通过稳定调节温箱中稳定调节温箱中COCO2 2气体的浓度

30、（气体的浓度（5%5%），使之与），使之与培养基中的培养基中的NaHCONaHCO3 3处于平衡状态。处于平衡状态。NaHCONaHCO3 3+H+H2 2O NaO Na+HO+HO-+H+H2 2O+COO+CO2 25.5.无毒、无污染：培养基应达到无化学物质污无毒、无污染：培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染、无其他对细胞产生损伤作染、无微生物污染、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染。用的生物活性物质污染。2021/7/27星期二41二、天然培养基二、天然培养基1.1.血清血清1.1 1.1 血清的种类：主要是牛血清，分为：小牛血血清的种类：主要是牛血清，分为：小牛血清（出

31、生清（出生10-3010-30天）、新生牛血清（出生天）、新生牛血清（出生2424小小时之内）和胎牛血清（剖腹产的胎牛）时之内）和胎牛血清（剖腹产的胎牛）1.2 1.2 血清的主要成分及主要作用：血清是由血浆血清的主要成分及主要作用：血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。制生长活性是达到生理平衡的。2021/7/27星期二42血清的作用：血清的作用：a.提

32、供基本营养物质：各种氨基酸、维生素、提供基本营养物质：各种氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等。无机物、脂类物质、核酸衍生物等。b.提供贴壁和扩展因子：血清中的纤连蛋白、提供贴壁和扩展因子：血清中的纤连蛋白、层粘连蛋白等可以促进细胞贴壁。层粘连蛋白等可以促进细胞贴壁。C.提供激素及各种生长因子：血清中含有各提供激素及各种生长因子：血清中含有各种激素，如胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化种激素，如胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。同时含有各种生长因子，睾酮、孕酮）等。同时含有各种生长因子，如成纤维细胞生

33、长因子（如成纤维细胞生长因子（FGF)、表皮细胞生、表皮细胞生长因子长因子(EGF)、血小板生长因子、血小板生长因子(PDGF)等。等。2021/7/27星期二43d.d.提供结合蛋白：结合蛋白的作用是携带重要提供结合蛋白：结合蛋白的作用是携带重要的低分子量物质。的低分子量物质。e.e.对培养中的细胞提供某些保护对培养中的细胞提供某些保护:血清终止胰血清终止胰酶的反应；血清蛋白形成血清的粘度，保护细酶的反应；血清蛋白形成血清的粘度，保护细胞机械损伤。胞机械损伤。1.3 1.3 血清的缺点：血清可能改变某种细胞在体血清的缺点：血清可能改变某种细胞在体内的正常状态；血清中含有一些物质对细胞产内的正

34、常状态；血清中含有一些物质对细胞产生毒性作用；成分不能保持一致；可能带入支生毒性作用；成分不能保持一致；可能带入支原体、病毒原体、病毒2021/7/27星期二441.4 1.4 血清的质量标准血清的质量标准a.a.理化性质：如：渗透压、理化性质：如：渗透压、pHpH、蛋白电泳谱图、蛋白电泳谱图、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括：蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括：血清总蛋白含量（不低于血清总蛋白含量（不低于35-45g35-45g）、球蛋白含量）、球蛋白含量（应小于（应小于20g/L20g/L）、血红蛋白等。球蛋白）、血红蛋白等。球蛋白(主要是主要是抗体）和血红蛋白是越低越好

35、。抗体）和血红蛋白是越低越好。b.b.微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等等c.c.促生长效果：克隆形成率、贴瓶率测定法、连促生长效果：克隆形成率、贴瓶率测定法、连续传代培养法续传代培养法2021/7/27星期二451.5 1.5 血清的使用与储存血清的使用与储存a.a.使用前处理：灭活即使用前处理：灭活即5656放置放置3030分钟。分钟。b.b.储存条件：储存于储存条件：储存于2020，分装保存，分装保存c.c.使用浓度：使用浓度：5%-20%5%-20%，常用，常用10%10%2.2.鼠尾胶原：促进细胞的贴壁，特别是对上皮鼠尾胶原：促进细胞的

36、贴壁，特别是对上皮类细胞。类细胞。2021/7/27星期二463.3.组织浸出液：最早使用的是鸡胚浸出组织浸出液：最早使用的是鸡胚浸出液，主要成分是大分子核蛋白和小分子液，主要成分是大分子核蛋白和小分子氨基酸，有刺激细胞生长的作用。氨基酸，有刺激细胞生长的作用。2021/7/27星期二472021/7/27星期二48三、合成培养基三、合成培养基1.1.基本培养基：基本组分包括：无机盐、氨基酸、基本培养基：基本组分包括：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物维生素、碳水化合物无机盐：无机盐：CaClCaCl2 2、KClKCl、MgSOMgSO4 4、NaClNaCl、NaHCONaHCO3 3、N

37、aHNaH2 2POPO4 4氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸（均为组氨酸、酪氨酸、缬氨酸（均为L L型）型）维生素：偏多酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟维生素：偏多酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素碳水化合物：葡萄糖碳水化合物：葡萄糖2021/7/27星期二49种类：种类：a.MEMa.MEM：仅含有：仅含有1212种必需氨基酸、谷氨酸，种必需氨基酸、谷氨酸，8 8种维种维生素及必要的无

38、机盐，成分简单。生素及必要的无机盐，成分简单。b.DMEMb.DMEM：在：在MEMMEM基础上研制而成，增加了各成分的基础上研制而成，增加了各成分的用量，同时又分为高糖型和低糖型，高糖型含葡用量，同时又分为高糖型和低糖型，高糖型含葡萄糖萄糖4.5g/L4.5g/L，低糖型为，低糖型为1.0g/L1.0g/L。c.IMDMc.IMDM：是：是DMEMDMEM改良结果，含有改良结果，含有4242种成分，增加种成分，增加了许多非必需氨基酸及一些维生素，增加了了许多非必需氨基酸及一些维生素，增加了HEPES,HEPES,为高糖型。为高糖型。d.RPMI1640d.RPMI1640：适合许多种类细胞的

39、生长，如肿瘤：适合许多种类细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代培养或传代培养的细胞。细胞或正常细胞、原代培养或传代培养的细胞。2021/7/27星期二50e.199e.199、109109培养基：培养基：199199培养基成分有培养基成分有6060多种，多种，几乎含有所有氨基酸、维生素、生长激素、核几乎含有所有氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等。酸衍生物等。109109是是199199的改良之作，比的改良之作，比199199效果效果更好。更好。f.HamF10f.HamF10、HamF12:F10HamF12:F10培养基不仅适合于小鼠培养基不仅适合于小鼠二倍体细胞，也适合于人类二倍体细

40、胞的培养。二倍体细胞，也适合于人类二倍体细胞的培养。F12F12是在配方中加入了一些微量元素和无机离子。是在配方中加入了一些微量元素和无机离子。可以在加入很少血清的情况下使用，适合单细可以在加入很少血清的情况下使用，适合单细胞分离培养。胞分离培养。g.McCoy5A:g.McCoy5A:是一种专门为肉瘤细胞设计的培是一种专门为肉瘤细胞设计的培养基，后来发现他特别适合原代细胞培养，适养基，后来发现他特别适合原代细胞培养，适合较难培养的细胞生长。合较难培养的细胞生长。2021/7/27星期二51培养基的配制：培养基的配制：a.a.认真阅读说明书，说明书中都注明干粉中不包认真阅读说明书，说明书中都注

41、明干粉中不包含的成分，常见的有含的成分，常见的有NaHCONaHCO3 3、谷氨酰胺、丙酮酸、谷氨酰胺、丙酮酸钠、钠、HEPESHEPES等。这些成分中有些是必须加的，如等。这些成分中有些是必须加的，如NaHCONaHCO3 3、谷氨酰胺，有些则需要根据实验来决定。、谷氨酰胺，有些则需要根据实验来决定。b.b.配制时保证充分溶解，配制时保证充分溶解，NaHCONaHCO3 3、谷氨酰胺等都、谷氨酰胺等都要在培养基完全溶解之后才能添加。要在培养基完全溶解之后才能添加。c.c.配制所用水为双蒸水或三蒸水，离子浓度很低，配制所用水为双蒸水或三蒸水，离子浓度很低，水电阻达水电阻达3030万万以上。以上

42、。d.d.所用器皿应十分洁净。所用器皿应十分洁净。e.e.配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4 4。2021/7/27星期二522.2.无血清培养基无血清培养基无血清培养基研制过程的几种策略：无血清培养基研制过程的几种策略：a.a.分析血清的成分：许多激素、生长因子需协同分析血清的成分：许多激素、生长因子需协同作用并且在血清中含量极少。还有许多不了解的作用并且在血清中含量极少。还有许多不了解的成分，无法用常规生化方法分离提纯。成分，无法用常规生化方法分离提纯。b.b.采用合成的方法：即在现有基础培养基中添加采用合成的方法：即在现有基础培养基中添加不同组合的

43、各种生长因子、各种激素、结合蛋白不同组合的各种生长因子、各种激素、结合蛋白以及贴壁和扩展因子以替代血清的作用。以及贴壁和扩展因子以替代血清的作用。c.c.寻找限制因素：降低血清浓度，直到细胞生长寻找限制因素：降低血清浓度，直到细胞生长受限制，再调整培养基中每种成分的浓度，直到受限制，再调整培养基中每种成分的浓度，直到细胞恢复生长。细胞恢复生长。2021/7/27星期二53无血清培养基的基本配方：无血清培养基的基本配方：为基础培养液及添加组分两大部分，基础培养为基础培养液及添加组分两大部分，基础培养液以液以HamF12HamF12和和DMEMDMEM最为常用，一般两者以最为常用，一般两者以1 1

44、1 1混合，添加的组分包括：混合，添加的组分包括：a.a.促贴壁物质：一般是细胞外基质，如纤连蛋促贴壁物质：一般是细胞外基质，如纤连蛋白白(FN)(FN)，层粘连蛋白，层粘连蛋白(LN)(LN)。b.b.促生长因子及激素：针对不同的细胞添加不促生长因子及激素：针对不同的细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质。细胞功能的重要物质。c.c.酶抑制剂：终止胰酶消化作用，达到保护细酶抑制剂：终止胰酶消化作用，达到保护细胞的作用，最常用的是大豆胰酶抑制剂。胞的作用，最常用的是大豆胰酶抑制剂。2021/7/27星期二54d.d.结合蛋白

45、和转运蛋白：常见的有转铁蛋白结合蛋白和转运蛋白：常见的有转铁蛋白和牛血清白蛋白，牛血清白蛋白可增加培养和牛血清白蛋白，牛血清白蛋白可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。基的粘度，保护细胞免受机械损伤。e.e.微量元素：硒是最常见的。微量元素：硒是最常见的。无血清培养基的使用方法：逐步降低血清浓无血清培养基的使用方法：逐步降低血清浓度，注意细胞形态的变化，细胞功能和特性度，注意细胞形态的变化，细胞功能和特性的改变。的改变。2021/7/27星期二553.3.无蛋白培养基（无蛋白培养基（PFM)PFM)和限定化学成分培养基和限定化学成分培养基(CDM)(CDM)PFM:PFM:即不含动物蛋白的

46、培养基，许多无蛋白培即不含动物蛋白的培养基，许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。因子的作用。CDMCDM：指培基中所有成分都是明确的，不含动物：指培基中所有成分都是明确的，不含动物蛋白，也没有添加植物水解物，而是使用一些蛋白，也没有添加植物水解物，而是使用一些已知结构与功能的小分子化合物，如：短肽、已知结构与功能的小分子化合物，如：短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。分泌产物。目前的目前的PFMPFM和和CDMCDM都只适合于悬浮生长的细胞。都只适合于悬浮生长的细胞。

47、2021/7/27星期二56四、其他培养用液四、其他培养用液1.1.平衡盐溶液平衡盐溶液(BSS):(BSS):主要由无机盐、葡萄糖组成，主要由无机盐、葡萄糖组成，作用是维持细胞渗透压平衡，保持作用是维持细胞渗透压平衡，保持pHpH稳定及提供稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂。胞的漂洗、配制其他试剂。2.2.消化液：常用的消化液有胰酶和消化液：常用的消化液有胰酶和EDTAEDTA溶液，有溶液，有时也用胶原酶溶液。时也用胶原酶溶液。2.12.1胰酶溶液：胰酶的活性可用消化酪蛋白的能胰酶溶液：胰酶的活性可用消化酪蛋白

48、的能力表示，常见的有力表示，常见的有1:1251:125和和1:2501:250，即一份胰酶可，即一份胰酶可消化消化125125份或份或250250份酪蛋白，组织培养用的胰酶浓份酪蛋白，组织培养用的胰酶浓度为度为0.1%-0.25%0.1%-0.25%，用不含，用不含CaCa、MgMg及血清的平衡盐。及血清的平衡盐。2021/7/27星期二572.2 EDTA2.2 EDTA液：作用机制为破坏细胞间的连接，液：作用机制为破坏细胞间的连接，EDTAEDTA的浓度为的浓度为0.02%0.02%。2.3 2.3 胶原酶溶液：在上皮类细胞原代培养时经胶原酶溶液：在上皮类细胞原代培养时经常使用，作用对象

49、是胶原组织，因此不易对细常使用，作用对象是胶原组织，因此不易对细胞产生损伤。使用浓度为胞产生损伤。使用浓度为0.1-0.3mg/L0.1-0.3mg/L或或2000000U/L,2000000U/L,作用的最佳作用的最佳pHpH为为6.56.5。3.pH3.pH调整液：调整液：NaHCONaHCO3 3是培养基中必须添加的成分。是培养基中必须添加的成分。HEPESHEPES液是一种弱酸，中文名是羟乙基哌嗪乙硫液是一种弱酸，中文名是羟乙基哌嗪乙硫磺酸。一般克隆化培养是要添加，配成磺酸。一般克隆化培养是要添加，配成100100倍浓倍浓缩液，使用终浓度为缩液，使用终浓度为0.01-0.05mol/L

50、0.01-0.05mol/L。2021/7/27星期二584.4.抗生素液：常用的是青链霉素俗称抗生素液：常用的是青链霉素俗称“双抗溶双抗溶液液”，青霉素对革兰阳性菌有效，链霉素对革，青霉素对革兰阳性菌有效，链霉素对革兰阴性菌有效。青霉素的终浓度为兰阴性菌有效。青霉素的终浓度为100000U/L100000U/L，链霉素终浓度为，链霉素终浓度为0.1g/L0.1g/L。5.5.谷氨酰胺补充液：在细胞代谢过程中起重要谷氨酰胺补充液：在细胞代谢过程中起重要作用，由于谷氨酰胺容易降解，所以都是使用作用，由于谷氨酰胺容易降解，所以都是使用前添加。终浓度为前添加。终浓度为0.002mol/L,0.002