实验2：分离以尿素为氮源的微生物.ppt

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1、实验实验2 2：分离以尿素为氮源的微生物：分离以尿素为氮源的微生物l 尿素是蛋白质降解的产物，通常用作植物的尿素是蛋白质降解的产物，通常用作植物的氮肥氮肥。但是。但是植物的根几乎不吸收尿素，植物的根几乎不吸收尿素，尿素尿素经微生物经微生物(脲酶脲酶)分分解为解为氨氨,氨溶解于水中成为氨溶解于水中成为铵根离子铵根离子而被植物吸收。而被植物吸收。一、基础知识一、基础知识1、尿素尿素(脲脲)：l 大量尿素的存在会对环境造成大量尿素的存在会对环境造成污染污染，如土壤板结、肥料，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。利用率下降、地下水污染等。例如：例如：2、选择培养基：选择培养基：添加添加或或减少减

2、少某种某种成分，以成分，以允许允许某种某种微生物生长微生物生长，同时同时抑制或阻止其他种类微生物生长抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基的培养基。培养基中培养基中缺乏有机碳源缺乏有机碳源时可筛选出时可筛选出自养型自养型微生物微生物只只以以尿素尿素为为氮源氮源的的培养基可筛选出培养基可筛选出含脲酶含脲酶的微生物的微生物一、基础知识一、基础知识3、玻璃砂漏斗玻璃砂漏斗：l 玻璃砂玻璃砂(砂芯砂芯)漏斗漏斗有有6种：种：G1G6(砂芯含有不同规砂芯含有不同规格格 小孔小孔)。G6孔径最小，细菌不能孔径最小，细菌不能 滤过。滤过。l 若培养基中含有若培养基中含有不不能能加加热热灭菌灭菌的化合物的化合物

3、，如，如尿素尿素(加热加热会会 分解分解)等，等，只能用只能用G6玻璃砂漏斗过滤玻璃砂漏斗过滤来来除除去去微生物微生物。l 玻璃砂漏斗玻璃砂漏斗用前用前也要进行也要进行高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌(121，15min)。用后用后需需用用1mol/L的的HCl浸泡浸泡，并抽，并抽滤滤去酸，去酸，再用再用蒸蒸馏馏水洗水洗 至洗出液呈中性至洗出液呈中性，干燥，干燥后保存。后保存。体积调节按纽体积调节按纽吸头脱卸按纽吸头脱卸按纽容量显示窗容量显示窗吸头吸头(枪头枪头)套筒套筒弹性吸嘴弹性吸嘴一、基础知识一、基础知识4、移液器移液器：移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的移液器是一种在一定容量范围内可随意

4、调节的精精密取液装置密取液装置（俗称（俗称移液移液枪）枪）。（1 1）结构：）结构：（2 2）使用方法使用方法：各种规各种规各种规各种规格吸头格吸头格吸头格吸头各种规格移液器各种规格移液器各种规格移液器各种规格移液器移液器的使用移液器的使用n 根据取用溶液体积根据取用溶液体积选用适当选用适当 的移液器的移液器n 操作方法：操作方法：设定体积设定体积安装吸头安装吸头 吸吸 液液 放放 液液卸掉吸头卸掉吸头从大从大值调值调整到小整到小值时值时，逆逆时针时针旋转体积调节按纽旋转体积调节按纽到到刚刚好即可。好即可。从小从小值调值调整到大整到大值时值时，应应顺时针顺时针先先调调至至超超过过设定设定值值后

5、再后再回回调调。设定体积设定体积安装吸头安装吸头将移液器将移液器顶端端垂直插入吸垂直插入吸头头，再再轻轻轻轻用力下用力下压压的的同同时时，左右微微左右微微转动转动，上，上紧紧即可即可。切切记记用力不能用力不能过过猛猛，选择与移液器匹配的吸头。，选择与移液器匹配的吸头。吸吸 液液1、预预洗吸洗吸头头：吸取、排放吸取、排放样液液23次次，让让吸吸头头内壁形成一道内壁形成一道 同同质质液膜，确保移液工作的精度和准度液膜，确保移液工作的精度和准度。一般液体，一般液体，正向吸液正向吸液(将按钮按到将按钮按到第一档第一档释释放吸液放吸液)粘稠液体和易粘稠液体和易挥发挥发液液体，体，反相吸液反相吸液(将按钮

6、将按钮直接按到直接按到第二档第二档吸液吸液)2、垂直吸液垂直吸液、慢吸慢放、慢吸慢放：吸吸头头垂直垂直浸入液面浸入液面2-4mm。尽量避。尽量避 免吸免吸头头浸入液面浸入液面过过深，以免液深，以免液压对压对吸液的精确度造成影响。吸液的精确度造成影响。吸液速度切吸液速度切记记不能不能过过快快，以免，以免导导致液体吸入移液器内部。致液体吸入移液器内部。将移液将移液枪枪提离液面提离液面需需停停约约13秒秒，观，观察是否有液滴察是否有液滴缓缓慢的流慢的流出。若有流出，出。若有流出，说说明有漏气明有漏气现现象象。放放 液液吸吸头头紧贴紧贴容器壁容器壁放液。放液。按按钮要待液体要待液体完全打出后完全打出后

7、再放松。再放松。正向：正向：先将按先将按钮钮按至第一按至第一档档，略作停，略作停顿顿以后，再按至第二以后，再按至第二 档档，这样这样做可以确保吸液做可以确保吸液头头内无残留液体。内无残留液体。反向：反向：轻轻按按按按钮钮至第至第一档一档，排出液体。，排出液体。继续继续按住按按住按钮钮，将，将 留在吸留在吸头头中的多余液体返回原来容器或随吸中的多余液体返回原来容器或随吸头丢头丢弃。弃。卸掉吸头卸掉吸头 一般用力一般用力下按下按吸吸头脱卸按脱卸按纽即可卸掉吸即可卸掉吸头头。将吸将吸头丢头丢弃到弃到废废物收集器中。物收集器中。移液器移液器如不使用，将如不使用，将刻度刻度调调到到最大量程最大量程，使使

8、弹弹簧簧 恢复原形，延恢复原形，延长长移液器的使用寿命。移液器的使用寿命。（一）实验目的：（一）实验目的：1、使用使用专一的培养基专一的培养基（尿素尿素为惟一氮源为惟一氮源）分离分离专专一的细菌（一的细菌（有脲酶的细菌有脲酶的细菌）。）。2、使用使用指示剂指示剂（酚红酚红）颜色的变化检知颜色的变化检知酶酶（脲酶脲酶）所催化的反应。所催化的反应。l 本实验的内容是本实验的内容是本实验的内容是本实验的内容是：用用尿素固体培养基尿素固体培养基从土壤中分离从土壤中分离出能利用尿素的细菌出能利用尿素的细菌，观察，观察菌落数菌落数；并以并以LB全营养全营养固固体体培养基培养基为为对照对照，观察，观察全营养

9、培养基上的全营养培养基上的菌落数菌落数。二、实验内容二、实验内容比较两者的比较两者的菌落数菌落数，可知，可知能利用尿素的能利用尿素的细细菌在土壤菌在土壤菌菌群群中中所所占占的比例的比例（二）实验原理：（二）实验原理：在土壤中，存在一些在土壤中，存在一些细细菌，它菌，它们们含有含有脲脲酶酶，能能分分解解尿尿素素(脲脲)作作为为其生其生长长的的氮源氮源(NH3)1.利用利用尿素培养基尿素培养基(以尿素为以尿素为惟惟一氮源一氮源的的选择培养选择培养基基)，分离分离出出土壤中土壤中含含脲脲酶酶的的细细菌菌。2CO32NH2OH+脲脲酶酶22)(ONH=C二、实验内容二、实验内容2.细菌合成的细菌合成的

10、脲脲酶酶能将能将尿素分解成尿素分解成NH3，致使，致使PH升高，使升高，使酚红指示剂变红酚红指示剂变红。二、实验内容二、实验内容（三）设备及用品（三）设备及用品：略略（四）材料（四）材料2 2、全营养、全营养LBLB固体培养基固体培养基：蛋白胨蛋白胨、酵母提取物酵母提取物、NaCl、琼脂琼脂糖糖、水、水。3 3、尿素固体培养基尿素固体培养基：葡萄糖葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红酚红、琼脂琼脂糖糖、水、水、尿素尿素。1 1、100mL100mL烧杯：烧杯：装有装有50mL70%酒精，浸泡着玻璃刮刀酒精，浸泡着玻璃刮刀6 6、土样：、土样：从有从有哺乳动物排泄物哺乳动物排泄物的地方取（的地方

11、取（粪便中含尿素，粪便中含尿素，利于含脲酶利于含脲酶的的微生物生长微生物生长）4 4、5 5支有塞试管：支有塞试管：盛有盛有4.5mL蒸馏水蒸馏水5 5、250mL250mL三角瓶：三角瓶：盛有盛有90mL蒸馏水蒸馏水l为什么要设置为什么要设置为什么要设置为什么要设置全营养全营养全营养全营养LBLBLBLB固体固体固体固体培养基培养基培养基培养基？起对照作用。起对照作用。土壤中含有多种土壤中含有多种细细菌，菌，在在全营养全营养LB培养培养基中，多数基中，多数细细菌都能生菌都能生长长；而在而在仅仅以尿素以尿素为为氮源的培养基氮源的培养基中，只有含有中，只有含有脲脲酶酶的微生物才能生的微生物才能生

12、长长。1 1 1 1、为什么用琼脂糖替代琼脂作为固化剂？为什么用琼脂糖替代琼脂作为固化剂？为什么用琼脂糖替代琼脂作为固化剂？为什么用琼脂糖替代琼脂作为固化剂？l酚红在此起什么作用？酚红在此起什么作用？酚红在此起什么作用？酚红在此起什么作用？琼琼脂脂是末被纯化的混合物，内是末被纯化的混合物，内含有一定量的含氮化合含有一定量的含氮化合物。物。如果用如果用琼琼脂固化培养基，会脂固化培养基，会为细为细菌提供一定量的非尿菌提供一定量的非尿素素类类氮源，氮源，这样这样会在尿素固体培养基上会在尿素固体培养基上产产生大量以非尿素生大量以非尿素为为氮源的氮源的细细菌，不利于以尿素菌，不利于以尿素为为氮源的氮源的

13、细细菌的菌的筛选筛选。酚酚红为红为酸碱指示酸碱指示剂剂，在酸性环境呈黄色，在碱性环境在酸性环境呈黄色，在碱性环境呈红色。通过酚红的颜色变化，呈红色。通过酚红的颜色变化，可可检测检测培养基中培养基中pH的的变变化化。思考与练习：思考与练习：注意：注意：取样时尽量只取取样时尽量只取悬液悬液。称量称量溶化溶化调调PH分装分装加塞封口加塞封口包扎包扎灭菌灭菌二、实验内容二、实验内容（五）（五）实验步骤实验步骤：1 1、配制培养基并灭菌配制培养基并灭菌2 2、倒平板倒平板3 3、制备细菌悬液、制备细菌悬液4 4、用、用涂布分离法涂布分离法分离细菌分离细菌5 5、细菌培养、细菌培养6 6、观察、对比、观察

14、、对比全营养全营养LB固固体培养基和体培养基和尿素固尿素固体培养体培养基基(除尿素外除尿素外)均均进进行行高压蒸汽高压蒸汽灭灭菌菌；尿素尿素固体固体培养基培养基待待冷却到冷却到60，加入，加入用用G6玻璃漏斗玻璃漏斗过过滤滤的的尿素溶液。尿素溶液。用用10-4和和10-5的土壤稀的土壤稀释液液各各浓度均做度均做三个三个培养皿培养皿培养基培养基倒置倒置培养，培养，37 2448h。实验组实验组与与对对照照组组菌落数菌落数制成制成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀土壤稀释释液液用移液器用移液器用移液器用移液器取取取取0.1ml0.1ml土壤稀释液土壤稀释液土壤稀释液土壤稀释液用涂布器涂布

15、分离用涂布器涂布分离用涂布器涂布分离用涂布器涂布分离二、实验内容二、实验内容（六）（六）实验结果实验结果：1010-4-4、1010-5-5土壤土壤稀释液稀释液尿素培养基上涂布结果尿素培养基上涂布结果1010-4-4、1010-5-5土壤土壤稀释液稀释液全全营养养LBLB培养基上涂布结果培养基上涂布结果 这说这说明能利用尿素的明能利用尿素的细细菌在土壤菌在土壤菌群菌群中只占少数。中只占少数。因因为为人和其他哺乳人和其他哺乳动动物物产产生生的排泄物的排泄物毕毕竟是少量的，竟是少量的，且且尿素尿素还还可以在高温下自然分可以在高温下自然分解，因此解，因此，以，以尿素尿素为为氮源的氮源的菌群菌群较较少

16、。少。4 4、与全营养培养基上的菌落与全营养培养基上的菌落与全营养培养基上的菌落与全营养培养基上的菌落数相比，为什么尿素培养基数相比，为什么尿素培养基数相比，为什么尿素培养基数相比，为什么尿素培养基上只有少数菌落？上只有少数菌落？上只有少数菌落？上只有少数菌落？思考与练习：思考与练习：2 2 2 2.有脲酶的细菌在生态系统稳定上起什么作用？有脲酶的细菌在生态系统稳定上起什么作用？有脲酶的细菌在生态系统稳定上起什么作用？有脲酶的细菌在生态系统稳定上起什么作用？3 3 3 3.有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的

17、环带出现？有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？土壤土壤中中大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。结、肥料利用率下降、地下水污染等。有有脲脲酶酶的细菌能的细菌能分解分解尿素尿素，并利用所形成的氨，有利，并利用所形成的氨，有利于自然界中的氮循于自然界中的氮循环环。有脲酶的有脲酶的细细菌向胞外分泌菌向胞外分泌脲脲酶酶，使培养基中的尿素，使培养基中的尿素(中中性性)分解分解产产生氨生氨(碱性碱性)，导导致培养基中酚致培养基中酚红红指示指示剂剂变为变为红红色。色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化培养基中酸碱指示剂产生颜色变

18、化(变红变红)，标标志着志着存在存在脲脲酶酶分解尿素的作用，从而分解尿素的作用，从而证证明明该该菌株可以以尿素菌株可以以尿素为为氮源。氮源。红色红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红红色区色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越域越大，表明菌株利用尿素的能力越强强。思考与练习：思考与练习：l 本实验的微生物分离与上一实验中大肠杆菌的分离实本实验的微生物分离与上一实验中大肠杆菌的分离实本实验的微生物分离与上一实验中大肠杆菌的分离实本实验的微生物分离与上一实验中大肠杆菌的分离实质上一样吗？质上一样吗？质上一样吗？质上一样吗？实验名称实验名称实验名称实验名称分离方法分离方法分离方法分离方法分离内容分离内容分离内容分离内容分离结果分离结果分离结果分离结果 大大肠肠杆菌杆菌培养和分离培养和分离划线划线分离分离法法从从同种菌种同种菌种中分中分离得到同种菌的离得到同种菌的单单菌落菌落 在划在划线线的末端的末端出出现现大大肠肠杆菌杆菌单单菌落菌落 分离以尿素分离以尿素为为氮源的微氮源的微生物生物 涂布涂布分离分离法法从土壤浸出液里从土壤浸出液里所存在的所存在的各种各种细细菌菌中将中将含有含有脲脲酶酶的的细细菌菌分离出来分离出来 只出只出现现含有含有脲脲酶酶的的细细菌菌落菌菌落思考与练习：思考与练习：