实验三石蜡切片法.ppt

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1、实验三实验三 石蜡切片法石蜡切片法 一般光镜技术一般光镜技术 组织细胞化学技术组织细胞化学技术 免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 放射自显影技术放射自显影技术 电镜技术电镜技术 组织培养技术组织培养技术组织学的研究方法组织学的研究方法 涂片法涂片法 铺片法铺片法 磨片法磨片法 石蜡切片法石蜡切片法 火棉胶切片法火棉胶切片法 冰冻切片法冰冻切片法 一般光镜技术一般光镜技术非切片法非切片法切片法切片法 本实验主要掌握本实验主要掌握一般光镜技术一般光镜技术中的切片法中的切片法石蜡石蜡切片技术切片技术。实验目的与基本要求：实验目的与基本要求：掌握石蜡切片的制片技术和基本原理。掌握石蜡切片的制片技术和基

2、本原理。要求用要求用HEHE染色方法染色，获得清晰的组织切片。染色方法染色，获得清晰的组织切片。石蜡切片的流程石蜡切片的流程1 1、取材、取材2 2、固定、固定3 3、组织块修整、组织块修整4 4、洗涤、洗涤5 5、脱水、脱水6 6、透明、透明7 7、浸蜡与包埋、浸蜡与包埋8 8、切片与贴片、切片与贴片9 9、脱蜡、复水（水化）、脱蜡、复水（水化）1010、染色、染色1111、脱水、透明、脱水、透明1212、封固、封固1.1.取材取材l动物致死方法：常用方法有麻醉法、空气栓塞法、断头动物致死方法：常用方法有麻醉法、空气栓塞法、断头法、击头法、股动脉放血法等；无尾两栖类常用探针破法、击头法、股动

3、脉放血法等；无尾两栖类常用探针破坏脑和脊髓的方法处死，鼠类可用两手（戴手套）用力坏脑和脊髓的方法处死，鼠类可用两手（戴手套）用力拉，使颅骨和颈椎分离而导致延髓损伤致死。拉，使颅骨和颈椎分离而导致延髓损伤致死。l动物保护动物保护 组织材料新鲜组织材料新鲜 动作迅速动作迅速取材注意事项：取材注意事项：要熟悉取材部位；要熟悉取材部位；所取材料尽可能新鲜；所取材料尽可能新鲜；组织块力求小而薄：厚度一般不超过组织块力求小而薄：厚度一般不超过5mm5mm为宜，较理想的为宜，较理想的厚度为厚度为2mm2mm左右；左右；勿使组织块受挤压，以免破坏组织；勿使组织块受挤压，以免破坏组织；保持材料清洁，以免影响观察

4、。保持材料清洁，以免影响观察。2.2.固定固定l固定固定：固定是指处死的动物体或新取的组织块投入固定：固定是指处死的动物体或新取的组织块投入固定液使其结构得以凝固为不溶性物质的过程。其目的在于液使其结构得以凝固为不溶性物质的过程。其目的在于保持组织内细胞的形态、结构及其组成，防止细胞组织保持组织内细胞的形态、结构及其组成，防止细胞组织死后的自溶和腐败，使之尽量保持生前的状态和结构。死后的自溶和腐败，使之尽量保持生前的状态和结构。注射、灌注固定法注射、灌注固定法 小块组织固定法小块组织固定法 l常用的固定液有：甲醛（福尔马林）、酒精、醋酸、苦常用的固定液有：甲醛（福尔马林）、酒精、醋酸、苦味酸、

5、锇酸、味酸、锇酸、BouinsBouins液等。液等。固定液的用量通常为材料块的固定液的用量通常为材料块的2020倍左右；固定时间倍左右；固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从而定，可以从1 1小时至数天，通常为数小时至小时至数天，通常为数小时至2424小时。小时。l 常用的固定方法常用的固定方法3.3.组织块修整组织块修整l组织块修整组织块修整：经过固定后的组织有一定的硬度，此时就可以：经过固定后的组织有一定的硬度，此时就可以做一些修整，但改变不要太大，只要将组织材料切取平整，做一些修整，但改变不要太大，只要将组织

6、材料切取平整，修掉一些不规则的部位；过大、过厚的组织改小、改薄。修掉一些不规则的部位；过大、过厚的组织改小、改薄。4.4.洗涤洗涤l洗涤洗涤：将残余在组织内的固定液清洗干净，以免影响对组织：将残余在组织内的固定液清洗干净，以免影响对组织内部结构的观察、分析、研究。内部结构的观察、分析、研究。l常用的洗涤方法常用的洗涤方法 水洗法（含有铬、锇的固定液固定的组织块）水洗法（含有铬、锇的固定液固定的组织块）酒精洗涤法（含有苦味酸、酒精固定液固定的组织块）酒精洗涤法（含有苦味酸、酒精固定液固定的组织块）5.5.脱水脱水 l脱水脱水：将组织块内的水份被置换出的过程叫脱水；脱水目的：将组织块内的水份被置换

7、出的过程叫脱水；脱水目的是使水分完全除去的同时使组织块变硬。是使水分完全除去的同时使组织块变硬。l现采用的脱水剂一般是乙醇或丙酮来进行梯度脱水；脱水的现采用的脱水剂一般是乙醇或丙酮来进行梯度脱水；脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。时间，可根据组织的类型，大小而定。l方法：方法：70%70%80%80%95%(95%()95%(95%()无水酒精（无水酒精（）1-2h 1-2h 1-2h 1-2h 30min-1h 1-2h 1-2h 1-2h 1-2h 30min-1h 无水酒精（无水酒精（）30min-1h30min-1h 脱水注意事项：脱水注意事项：原则是在脱水彻底的前提下，尽量缩短

8、脱水的时间；原则是在脱水彻底的前提下，尽量缩短脱水的时间；脱水应逐步而不应跨越太大进行；脱水应逐步而不应跨越太大进行；如需要可在如需要可在70%70%的酒精中过夜或长期保存；的酒精中过夜或长期保存；如系胚胎或柔软组织脱水，应从更低浓度的酒精开始；如系胚胎或柔软组织脱水，应从更低浓度的酒精开始；每级脱水移入高浓度以前，应用吸水纸吸净表面的残液。每级脱水移入高浓度以前，应用吸水纸吸净表面的残液。6.6.透明（媒浸）透明（媒浸）l透明（媒浸）透明（媒浸）：无水酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精：无水酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类和石蜡相溶的媒浸

9、液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。渍过程称透明。l常用的透明剂有二甲苯、苯；透明剂的浸渍时间则要根据组常用的透明剂有二甲苯、苯；透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小和性质而定。织材料块大小和性质而定。l方法方法:纯酒精纯酒精:二甲苯（二甲苯（1:1)1:1)二甲苯二甲苯()二甲苯（二甲苯（）15min-30min 15min-30min 15min-30min15min-30min 15min-30min15min-30min 7.7.浸蜡与包埋浸蜡与包埋l浸蜡：是将已透明

10、的组织块移入熔化的石蜡内浸没的过是将已透明的组织块移入熔化的石蜡内浸没的过程。目的是用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支程。目的是用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常浸蜡应在高于石蜡熔点持作用。通常浸蜡应在高于石蜡熔点33左右的温箱中进左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。行，以利石蜡浸入组织内。l方法：浸蜡（方法：浸蜡（）浸蜡（浸蜡（）浸蜡（浸蜡（）30min-1h 1-2h 30min-1h 1-2h 1-2h1-2h l包埋：包埋：将浸蜡后的组织块包在石蜡之中，并使组织块将浸蜡后的组织块包在石蜡之中，并使组织块与石蜡一起凝固成均匀一致的蜡块的过程叫包埋。与石蜡一起凝固成均

11、匀一致的蜡块的过程叫包埋。l方法：将纸盒盛满已融化的石蜡，随即将第三杯中已方法：将纸盒盛满已融化的石蜡，随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中，并排出里面的气泡待石蜡表面浸蜡的材料放入其中，并排出里面的气泡待石蜡表面凝结后，将纸盒进入水中冷却石蜡全部凝结后，拆去凝结后，将纸盒进入水中冷却石蜡全部凝结后，拆去纸盒即成蜡块。纸盒即成蜡块。l组织在蜡块中可以长期保存。组织在蜡块中可以长期保存。8.8.切片与贴片切片与贴片 切片：切片：1)1)修块：切去组织标本周围过多的石蜡，不能留的过少，修块：切去组织标本周围过多的石蜡，不能留的过少，否则容易造成组织破坏。一般情况下在组织周围应留约否则容易造成组织破坏

12、。一般情况下在组织周围应留约 1-1-2mm2mm的石蜡边，把蜡块修成上下两对边平行的方形或梯形，否的石蜡边，把蜡块修成上下两对边平行的方形或梯形，否则会造成石蜡切出的蜡带不整齐或歪向一边。则会造成石蜡切出的蜡带不整齐或歪向一边。2)2)固着：将修好的蜡块用蜡粘在大小适宜的小木块上，木固着：将修好的蜡块用蜡粘在大小适宜的小木块上，木块装在切片机上，以待切片。块装在切片机上，以待切片。3)3)切片：在旋转式切片机上将蜡块切成切片：在旋转式切片机上将蜡块切成5-10um5-10um厚的薄片。厚的薄片。切下的薄片会连成蜡带。用毛笔轻托轻取蜡带，放在蜡带盒切下的薄片会连成蜡带。用毛笔轻托轻取蜡带，放在

13、蜡带盒内备用。内备用。切片切片修块修块18l贴片：贴片：（粘片、表片、展片）是将已切成的蜡带分割成（粘片、表片、展片）是将已切成的蜡带分割成小段后粘贴于载玻片的过程。用粘片剂将展平的蜡片牢小段后粘贴于载玻片的过程。用粘片剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中材料脱落。附于载玻片上，以免在以后操作中材料脱落。在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡带，置于在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡带，置于调好温度的水浴锅上铺展。将载玻片放入调好温度的水浴锅上铺展。将载玻片放入4545温箱中干温箱中干燥。燥。9.9.脱蜡及复水脱蜡及复水l脱蜡：脱蜡：用二甲苯将组织中的石蜡溶解掉，石蜡将会妨碍

14、染用二甲苯将组织中的石蜡溶解掉，石蜡将会妨碍染料进入组织、细胞中而不易染色。料进入组织、细胞中而不易染色。复水：复水：从第二杯二甲苯取出的切片经从第二杯二甲苯取出的切片经100%95%80%100%95%80%70%70%蒸馏水。在各液中停留蒸馏水。在各液中停留15min15min。l方法：方法：二甲苯（二甲苯（）二甲苯（二甲苯（）无水酒精无水酒精 95%80%95%80%10min 10min 10min10min 5min 5min 5min5min 5min5min 70%70%蒸馏水蒸馏水 5min 5min 5min5min10.10.染色染色 l最常用的染色法是苏木精（最常用的染色

15、法是苏木精（hematoxylin)hematoxylin)和伊红（和伊红（eosineosin）染色）染色简称简称HEHE染色染色。配制后的苏木精染液呈碱性，可使细胞核染成蓝紫。配制后的苏木精染液呈碱性，可使细胞核染成蓝紫色；伊红是酸性染料，可使多数细胞的细胞质染成粉红色。色；伊红是酸性染料，可使多数细胞的细胞质染成粉红色。l方法：方法：苏木精苏木精自来水自来水1%1%盐酸酒精盐酸酒精自来水自来水 蒸馏水蒸馏水70%80%90%70%80%90%伊红伊红 15min 10-15min 15min 10-15min 数秒数秒 冲洗冲洗15min 15min 片刻片刻 2min 2min 2mi

16、n 5min2min 2min 2min 5min 分色分色 蓝化蓝化 11.11.脱水、透明脱水、透明l 脱水：脱水：染色以后，组织切片中有水分，则光不易通透，在显染色以后，组织切片中有水分，则光不易通透，在显 微镜下观察不清组织机构，所以必须经过脱水。微镜下观察不清组织机构，所以必须经过脱水。l 透明：透明：以利于光线能透过组织切片，便于观察组织、细胞的以利于光线能透过组织切片，便于观察组织、细胞的 结构。结构。l 方法：方法：95%()95%()95%()95%()无水酒精无水酒精()()无水酒精无水酒精()()5min 5min 5min5min 5min5min 5min5min 无

17、水酒精无水酒精:二甲苯（二甲苯（1:11:1）二甲苯（二甲苯（）二甲苯（二甲苯（）5min 5min 5min5min 5min5min12.12.封固封固l封固封固：将切片从二甲苯（：将切片从二甲苯（）中取出，用纸或者布擦去材料周）中取出，用纸或者布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一滴中性树胶，然后用镊子加盖围的二甲苯。在材料中央滴一滴中性树胶，然后用镊子加盖盖玻片。待树脂干燥后，贴上标签，写明切片名称，即可用盖玻片。待树脂干燥后，贴上标签，写明切片名称，即可用于观察。于观察。染色结果：细胞核呈鲜艳的蓝色；染色结果：细胞核呈鲜艳的蓝色；细胞质及细胞间质呈粉红色。细胞质及细胞间质呈粉红色。H.E染染色色图图石蜡切片流程图石蜡切片流程图 作业作业 1.简述石蜡切片和简述石蜡切片和HE染色法的过程。染色法的过程。2.用用HE染色法制作一张清晰地组织切片。染色法制作一张清晰地组织切片。