SDS-聚丙烯酰胺凝胶理论.ppt

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1、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量 一.实验目的学习学习SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。运用运用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴。测定蛋白质分子量及染色鉴。熟悉蛋白印迹技术原理和方法熟悉蛋白印迹技术原理和方法二二.实验原理实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十

2、二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小SDSSDS的作用的作用 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进中引进SDSSDS（十二烷基磺酸钠），（十二烷基磺酸钠），SDSSDS能断裂分子内和能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的含有强还原剂的SDSSDS溶液中，与溶液中，与SDSSDS分子按比例结合，分子按比例结合

3、，形成带形成带负电荷的负电荷的SDS-SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物，这种复合物由于结，这种复合物由于结合大量的合大量的SDSSDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDSSDS与与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度主要取决于蛋白质分子的迁移速度主要取决于分子大小分子大小。二二.实验原理实验原理当

4、蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：Lg MW =b m R +K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 若若将将已已知知分分子子量量的的标标准准蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率对对分分子子量量对对数数作作图图，可可获获得得一一条条标标准准曲曲线线，未未知知蛋蛋白白质质在在相相同同条条件件下下进进行行电电泳泳，根根据据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。二.实验原理PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，

5、分分为为连连续续系系统统和和不不连续系统连续系统两大类。两大类。连连续续系系统统电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下，主主要要靠靠电电荷荷和和分分子筛效应。子筛效应。不不连连续续系系统统中中由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分，pHpH，凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有浓浓缩缩效效应应，因因而而其其分分离离条条带带清清晰晰度度及及分分辨辨率率均均较前者佳。较前者佳。Gel5%10%15%2

6、94566972002945669720029456697200影响蛋白质和 SDS 结合的主要3个因素1）二硫键是否完全被还原：二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS 才能定量地结才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。般以巯基乙醇作还原剂。般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。化而形成蛋白质聚合体。2）溶液中 SDS

7、的浓度：溶液中 SDS 的总量，至少要比蛋白质的量高 3 倍，一般需高达 10 倍以上。当溶液中SDS单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1:0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3。3）溶液的离子强度：溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过溶液的离子强度应较低，最高不能超过 0.26，因为因为 SDS 在水溶液中是以在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在，单体和分子团的混合体而存在，SDS 结合到蛋内质分子上的量，仅

8、决定于平结合到蛋内质分子上的量，仅决定于平衡时衡时 SDS 单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS 单体具单体具有较高的平衡浓度。有较高的平衡浓度。三三.注意事项注意事项用用SDS-PAGE测蛋白质测蛋白质Mr时应注意以下问题：时应注意以下问题：1).如果蛋白质 -SDS 复合物不能达到 1.4 SDS lg 蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。2).不同凝胶浓度适用于不同的 Mr范围，Weber 的实验指出，在 5%的凝胶中，M r 为 25 000-200 000 的蛋白质，其 Mr的对数与迁移率 呈直线关系；在

9、10 的凝胶中，M r 为 10 000-70 000 蛋白质，其 Mr的对数与迁移率 呈直线关系；在 15 的凝胶中，Mr为 10 000-50 000 蛋白质，其 M r 的对数与迁移率呈直线关系；3.33 (以上各种浓度的凝胶，其交联度都是 2.6%)的凝胶可用于 Mr更高的蛋白质。3).许多蛋白质，是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在 SDS 和疏基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的 M r，而不是完整分子的 Mr。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其 Mr及分子中肽链的数

10、目等，与 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果相互参照。4).不是所有的蛋白质都能用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其 Mr，已发现电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白（如胶原蛋白等）用这种方法测定出的 Mr是不可靠的。如组蛋白 F 1，它本身带有大量正电荷，尽管结合了正常量的 SDS，仍不能完全掩盖其原有电荷的影响。它的 Mr是 21 000，但 SDS-凝胶电泳测定的结果却是 35 000。因此，要确定某种蛋白质的分子量时，最好用两种方法互相验证，则更为可靠。采采用用SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳法法测测蛋蛋白白质质分分子子量

11、量时时，只只有有完完全全打打开开二二硫硫键键，蛋蛋白白质质分分子子才才能能被被解解聚聚，SDSSDS才才能能定定量量地地结结合合到到亚亚基基上上而而给给出出相相对对迁迁移移率率和和分分子子量量对对数数的的线线性性关关系系。因因此此在在用用SDSSDS处处理理样样品品同同时时往往往往用用巯巯基基乙乙醇醇处处理理，巯巯基基乙乙醇醇是是一一种种强强还还原原剂剂，它它使使被被还还原原的的二二硫硫键键不不易易再再氧氧化化，从从而而使使很很多多不不溶溶性性蛋蛋白白质质溶解而与溶解而与SDSSDS定量结合。定量结合。有有许许多多蛋蛋白白质质是是由由亚亚基基（如如血血红红蛋蛋白白）或或两两条条以以上上肽肽链链

12、（如如胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶）组组成成的的，它它们们在在SDSSDS和和巯巯基基乙乙醇醇作作用用下下，解解离离成成亚亚基基或或单单条条肽肽链链，因因此此这这一一类类蛋蛋白白质质，测测定定时时只只是是它它们们的的亚亚基基或或单单条肽链的条肽链的MWMW。已已发发现现有有些些蛋蛋白白质质不不能能用用SDS-PAGESDS-PAGE测测定定分分子子量量。如如电电荷荷异异常常或或构构象象异异常常的的蛋蛋白白质质，带带有有较较大大辅辅基基的的蛋蛋白白质质（某某些些糖糖蛋蛋白白）以以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。采采用用SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳法

13、法测测蛋蛋白白质质分分子子量量时时，往往往往采采取取2 2种种以以上上测测定定方方法法结结合合使使用用。目目前前其其他他常常用用测测定定相相对对分子量的方法有：分子量的方法有：聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺梯梯度度凝凝胶胶电电泳泳法法测测定定蛋蛋白白质质的的相相对对分分子子量量（有有浓浓缩缩样样品品特特点点，可可分分次次加加样样；不不需需解解离离亚亚基基，适适宜宜测测定定球球蛋蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需白，而对纤维蛋白有误差。电泳需20002000伏特小时）伏特小时）凝凝胶胶层层析析法法测测定定蛋蛋白白质质相相对对分分子子量量（特特点点方方法法简简单单，样样品品用用量量少少，而而且且有有时时不不需需纯纯物物质质，一一般般不不引引起起生生物物活活性性物物质质的的变变化化。局局限限性性是是pH6-8pH6-8的的范范围围内内，线线性性关关系系比比较较好好，但但在在极极端端pHpH时，蛋白质有可能因变性而偏离。）时，蛋白质有可能因变性而偏离。）七 分析计算绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：(m R)以每个蛋白标准的分子量 对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。