xsl新新222动物细胞融合与单克隆抗体.ppt

《xsl新新222动物细胞融合与单克隆抗体.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《xsl新新222动物细胞融合与单克隆抗体.ppt（24页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、二、动物细胞融合与单克隆抗体 通过长期的实验，科学家们采用植物体细通过长期的实验，科学家们采用植物体细胞杂交技术获得了胞杂交技术获得了“白菜白菜甘蓝甘蓝”植株。植株。动物细胞也能融合吗？动物细胞也能融合吗？（一）（一）.动物细胞融合动物细胞融合1、概念：、概念：请同学们阅读课本请同学们阅读课本P52动物细胞融合动物细胞融合杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。遗传信息的单核细胞。也称细胞杂交，是指两个或多个细胞结也称细胞杂交，是指两个或多个细胞结合形成一个细胞的过程。合形成一个细胞的过程。2、动物融合的过程、动物融合的过程

2、动动物物细细胞胞融融合合过过程程示示意意图图不同DNA的两个细胞 灭活的病毒有丝分裂两个完整的杂交细胞思考题思考题1.1.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？酶解法，如纤维素酶或果胶酶酶解法，如纤维素酶或果胶酶2.2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？无需，因为动物细胞无细胞壁无需，因为动物细胞无细胞壁3.3.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？离心、电激等物理方法；离心、电激等物理方法；PEGPEG等化学方法等化学方法4.4.动物细

3、胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？能能 还可以利用灭活的病毒进行诱导还可以利用灭活的病毒进行诱导5.5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形 成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？吗？不能不能不同不同DNADNA的的两个细胞两个细胞2、动物融合的过程、动物融合的过程诱导融合诱导融合方法：聚乙二方法：聚乙二醇、醇、灭活病毒灭活病毒、电激等电激等杂交细胞杂交细胞(1)(1)(1)(1)、动物细胞融合基本原理：

4、、动物细胞融合基本原理：、动物细胞融合基本原理：、动物细胞融合基本原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性（3 3）、）、应用：主要用于制备单克隆抗体应用：主要用于制备单克隆抗体(2)(2)、意义：意义：克服远缘杂交不亲和性，成为研究细胞遗传、细克服远缘杂交不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株主要用途主要用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振动动、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导

5、方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合 细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性细胞融合的原理细胞融合的原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目3 3、比较、比较意义：意义：克服远缘杂交障碍克服远缘杂交障碍使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能长期以来，人们为了获得抗体，采用的是长期以来，人们为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方

6、法。用这动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅种方法获得的抗体，不仅产量低产量低，而且抗，而且抗体的体的特异性差特异性差，纯度低，纯度低，反应不够灵敏反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以淋巴细胞可以产生多达百万种以 上的特异性抗体，但每一个上的特异性抗体，但每一个B淋巴细胞只淋巴细胞只泌一种泌一种化学性质单一、化学性质单一、特异性强特异性强的抗体的抗体.复习？1.1.抗体是由何种细胞产生的？抗体是由何种细胞产生的？浆细胞浆细胞2.2.一个淋巴细胞一个淋巴细胞(浆细胞浆细胞)能分泌

7、多种抗体吗？能分泌多种抗体吗？每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。3.3.一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗？一种吗？动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上。动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上。4.4.简述获得抗体的传统途径？简述获得抗体的传统途径？抗原抗原 动物体动物体 抗体抗体 抗原不纯抗原不纯 抗体不纯抗体不纯（二）、单克隆抗体（二）、单克隆抗体刺激浆细胞阅读课本第阅读课本第5354页内页内内容，回答相关问题是。内容，回答相关

8、问题是。6.6.如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体7.7.体外培养淋巴细胞能无限增殖吗体外培养淋巴细胞能无限增殖吗?怎样解决这个怎样解决这个问题？问题？5.5.这种方法获得的抗体有什么缺陷？这种方法获得的抗体有什么缺陷？产量低，纯度低，特异性差产量低，纯度低，特异性差设计方案：设计方案：一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能够在体外大量增殖小鼠骨髓瘤细胞能够在体外大量增殖杂种细胞杂种细胞（二）、单克隆抗体（二）、单克隆抗体1、原始获得

9、抗体的方法：、原始获得抗体的方法：向动物体内反复注射某种向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后，从动物血清中分离所抗原，使动物产生抗体，然后，从动物血清中分离所需抗体。（缺点：产量低、纯度低、特异性差）需抗体。（缺点：产量低、纯度低、特异性差）2、单克隆抗体、单克隆抗体制备过程制备过程：单单克克隆隆抗抗体体制制备备免疫小鼠免疫小鼠培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞融合融合骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞注射特定注射特定抗原蛋白抗原蛋白选择培养基上培养选择培养基上培养专一抗体专一抗体检验阳性检验阳性专一抗体专一抗体检验阳性检验阳性注射到小鼠体内注射到小鼠体内体外培养体外培养单克隆抗

10、体单克隆抗体克隆杂交细胞克隆杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞专一抗体，检验阳性细胞 单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程示示意意图图多种杂交细胞多种杂交细胞注射抗原注射抗原注射抗原注射抗原体外培养体外培养体外培养体外培养体内培养体内培养体内培养体内培养B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程注射特注射特定抗原定抗原诱导融合诱导融合克隆培养，检测，筛选，克隆培养，检测，筛选，能分泌所需抗体能分泌所需抗体的杂交

11、瘤细胞的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体小鼠小鼠相应的相应的浆细胞浆细胞骨髓瘤骨髓瘤细胞细胞选择性培养基选择性培养基 ，筛选，筛选多种细胞多种细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外培养体外培养从培养液中提取从培养液中提取从小从小鼠鼠腹水腹水中提取中提取说明：说明：杂交瘤细杂交瘤细胞特点：既能大量胞特点：既能大量繁殖，又能产生专繁殖，又能产生专一抗体。一抗体。第一次筛选：选第一次筛选：选出杂交瘤细胞。出杂交瘤细胞。第二次筛选：选第二次筛选：选出能分泌所需抗体出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。的杂交瘤细胞。由单个由单个B细胞克隆形成的细胞群产细胞克隆形成的细胞群产生的化学性质单一、特异

12、性强的抗体生的化学性质单一、特异性强的抗体。3、单克隆抗体：、单克隆抗体：优点：特异性强、灵敏度高、并可大量制备优点：特异性强、灵敏度高、并可大量制备。4.4.单克隆抗体的应用：单克隆抗体的应用：（1 1）作为诊断试剂：）作为诊断试剂：具有准确、高效、简易、具有准确、高效、简易、快速的特点。快速的特点。“生物导弹生物导弹”：借助单克隆抗体的导向作用，：借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位置杀死癌细胞。置杀死癌细胞。(在抗体上连接药物）在抗体上连接药物）优点：疗效高、毒副作用小优点：疗效高、毒副作用小（2）用于治疗疾病和运载药物。

13、）用于治疗疾病和运载药物。知识结构两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三三个个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活的病毒灭活的病毒一个新细胞一个新细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞一个优势一个优势单克隆抗体特异性单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势教学反馈1.1.动物细胞融合技术最重要的用途是动物细胞融合技术最重要的用途是 （）A.A.克服远源杂交不亲和克服远源杂交不亲和 B.B.制备单克隆抗体制备单克隆抗体C.C.培育新物种培育新物种 D.D.生产杂种细胞生产杂种细胞B2.2.单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的单

14、克隆抗体是由下列哪种细胞产生的（）A.BA.B淋巴细胞淋巴细胞 B.TB.T淋巴细胞淋巴细胞 C.C.骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 D.D.杂交瘤细胞杂交瘤细胞 D3.3.（多选）（多选）19751975年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下列细胞中与单克隆抗体的制备有关的是列细胞中与单克隆抗体的制备有关的是（）A.A.效应效应B B细胞细胞 B BT T淋巴细胞淋巴细胞C.C.骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 D D杂交瘤细胞杂交瘤细胞 A B C DB B体外培养体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C

15、4.4.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案伤风杆菌的实验方案制备单克隆抗体制备单克隆抗体不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的生单一抗体的B B淋巴细胞。淋巴细胞。(1).(1).该实验方案的目的是：该实验方案的目的是：_(2).(2).该方案能达到预期效果吗？为什么？该方案能达到预期效果吗？为什么？(3).A(3).A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_ _ 该细胞能该细胞能够产生够产生_ _。(4).(4).图中图中B B为为_过程，常用过程，常用_作为诱

16、导剂，该细胞继承作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,_,又能又能_。(5).C(5).C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培培养两个阶段，其中养两个阶段，其中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。B B淋巴细胞淋巴细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活的病毒灭活的病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代5050巩固习题巩固习题1.1.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂

17、交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 （）淋巴细胞淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞 B B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞杂交瘤细胞A.B.A.B.C.C.D.D.C C2.2.动物细胞融合和植物原生质融合决定于动物细胞融合和植物原生质融合决定于 ()()A.A.细胞膜的流动性细胞膜的流动性 B B细胞膜的选择透过性细胞膜的选择透过性C.C.细胞质的流动性细胞质的流动性D D细胞质酶的活性细胞质酶的活性 A一一.选择题选择题3.3.“生物导弹生物导弹”是指是指 （）A.A.单

18、克隆抗体单克隆抗体 B.B.杂交瘤细胞杂交瘤细胞C.C.产生特定抗体的产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞 D.D.在单克隆抗体上连接抗癌在单克隆抗体上连接抗癌药物药物 D4.4.只能使动物细胞融合的常用诱导方法是只能使动物细胞融合的常用诱导方法是 （）A APEGPEG B B灭活的病毒灭活的病毒 C C电刺激电刺激 D D离心离心B二二.简答题简答题1.1.淋巴细胞是由动物体淋巴细胞是由动物体-中的中的-细胞分细胞分化发育而来的。化发育而来的。2.2.杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是-骨髓骨髓造血干造血干主动运输主动运输三

19、三.思考与探究：思考与探究：5555页页1.1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？不同？2.2.制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用B B淋巴细胞和骨淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。提示：哺乳动物感染抗原后，其体

20、内会形成相应的提示：哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B B淋巴细胞，淋巴细胞，B B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种反应的过程中，每一种B B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞大量增殖。大量增殖。B B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖；

21、骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。性的抗体。2.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？融合？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生

22、物的方法，其的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率融合率都不可都不可能是能是100%100%。仅用两个细胞融合，其效率。仅用两个细胞融合，其效率太低太低，不一定，不一定能得到融合细胞。更重要的是，能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种我们知道，体

23、内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个以上，但是每一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含如果仅取一个脾细胞（含B B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。胞。3.3.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化

24、培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行释，一般需进行3 34 4次，直至确信每个孔中增殖的次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。化培养。