微生物基因工程.ppt

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1、D D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策8 8 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程C C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略B B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征E E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征8 8 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有全基因组测序，

2、共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征8 8 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源

3、性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素B B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理8 8 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数启动子启动子启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测目的基因目的基因EEEEAAEEEE启动子启动子A A 酶切开酶切开Bal31Bal31酶解酶解目的基因目的基因启动子启动子启动子的筛选启动子的筛选ApAprroriorigalKgalKpKO1pKO1终止密码子终止密码子采用鸟枪法战略，将合适大小的

4、采用鸟枪法战略，将合适大小的DNADNA片段片段克隆到启动子探针质粒克隆到启动子探针质粒pKO1pKO1上上受体细胞染色体受体细胞染色体DNADNA上的上的galEgalE、galTgalT与质与质粒上报告基因粒上报告基因galkgalk的表达产物联合作用，的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化转化galEgalE+、galTgalT+、galKgalK-的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆启动子启动子启动子的构建启动子的构建-35-35 区序列区序列-10-10 区序列区序列P

5、Pl ll lLLP PrecArecAP PtrptrpP PlaclacP PtraAtraAP Ptactac启动子启动子T T G A C AT T G A C AG A T A C TG A T A C TT T G A T AT T G A T AT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G A C AT T A A C TT T A A C TT A G A C AT A G A C AT A A T G TT A A T G TT T T A C AT T T A C AT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G

6、 A C AT A T A A TT A T A A TP Ptactac =3 3 P Ptrptrp =1111 P Placlac启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性PP乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性：的可控性：OOPPOO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖 异丙基异丙基-bb-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的PPlaclac与其控制区与其控制区OOlaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基基底水平转录基底水平转录底水平表达；诱导物可以使底水平表达；诱

7、导物可以使启动子启动子PPlaclac介导的转录大幅介导的转录大幅提高提高启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性PPlaclac乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性：的可控性：OOPPlaclacOO高效转录高效转录葡萄糖代谢葡萄糖代谢野生型的野生型的PPlaclac上游附近拥有上游附近拥有代谢激活因子（代谢激活因子（CAPCAP）结合结合区，区，cAMPcAMP激活激活CAPCAP，CAPCAP基底水平转录基底水平转录结合启动子控制区，进而促结合启动子控制区，进而促进进PPlaclac介导的转录。葡萄糖介导的转录。葡萄糖代谢使代谢使cAMPcAMP减少，也能阻减少，也能阻遏遏PP

8、laclac介导的转录。因此，介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即突变型，即PPlac lac UV5UV5CAPCAPcAMPcAMPcAMPcAMP浓度降低浓度降低PPlac lac UV5UV5OO高效转录高效转录启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性PPtrptrp色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrptrp的可控性：的可控性：OOtrptrp除去除去色氨酸色氨酸色氨酸启动子色氨酸启动子PPtrptrp受色氨酸受色氨酸-阻阻遏遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统

9、中去除色氨酸状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转录基底水平转录或者加入或者加入3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸（IAAIAA），），便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加中往往添加IAAIAA诱导诱导PPtrptrp介导的目介导的目基因的表达基因的表达色氨酸色氨酸或加或加3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白 （IAAIAA）OOtrptrpPPtrptrp高效转录高效转录OOtrptrpPPtrptrp启动子启动子启动子的可控性启动子

10、的可控性l l噬菌体噬菌体启动子启动子P Pl ll lLL的可控性：的可控性：噬菌体启动子噬菌体启动子PPLL受受CICI阻遏蛋白阻阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的cIcI突突变基因变基因cIcI857857控制控制PPLL。cIcI857857阻遏蛋阻遏蛋在在4242时失活脱落，时失活脱落，PPLL便可介导便可介导目的基因的表达。但在大型细菌目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达用

11、色氨酸间接控制目的基因表达PPtrptrpAABBcIcI857857PPLL目的基因目的基因阻遏作用阻遏作用PPtrptrpAABBPPLL表达表达色氨酸色氨酸终止子终止子强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性 外外源源基基因因在在强强启启动动子子的的控控制制下下表表达达，容容易易发发生生转转录录过过头头现现象象，即即RNARNA聚聚合合酶酶滑滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNADNA序列，形成长短不一的序列，形成长短不一的mRNAmRNA混合物混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基

12、因的表达，其原因如下：转转录录产产物物越越长长，RNARNA聚聚合合酶酶转转录录一一分分子子mRNAmRNA所所需需的的时时间间就就相相应应增增加加，外外源源基基因因本身的转录效率下降；本身的转录效率下降；如如果果外外源源基基因因下下游游紧紧接接有有载载体体上上的的其其它它重重要要基基因因或或DNADNA功功能能区区域域，如如选选择择性性标标记记基基因因和和复复制制子子结结构构等等，则则RNARNA聚聚合合酶酶在在此此处处的的转转录录可可能能干干扰扰质质粒粒的的复复制制及及其其它它生生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的过长的mRNAmRNA往往会产生

13、大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更更为为严严重重的的是是，过过长长的的转转录录物物往往往往不不能能形形成成理理想想的的二二级级结结构构，从从而而大大大大降降低低外外源源基因编码产物的翻译效率基因编码产物的翻译效率终止子终止子强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌止子是来自大肠杆菌rRNArRNA操纵子上的操纵子上的rrnTrrnT11T T22以及以及T7T7噬菌体噬菌体DNADNA上的上的T Tf f。对对于一些终止作用较弱的终止子，通常于一些终

14、止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组组DNADNA中克隆筛选中克隆筛选pCP1pCP1ApAprrorioriTcTcrr筛选筛选ApAprr、TcTcss的转化子的转化子核糖体结合位点核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与频率，而且在很大程度上还与mRNAm

15、RNA的翻译起始效率密切相关。大的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的肠杆菌细胞中结构不同的mRNAmRNA分子具有不同的翻译效率，它们之分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。间的差别有时可高达数百倍。mRNAmRNA翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其5 5 端端的结构序列所决定，称为的结构序列所决定，称为核糖体结合位点核糖体结合位点（RBSRBS）核糖体结合位点核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位位于于翻翻译译起起始始密密码码子子上上游游的的6-86-8个个核核苷苷酸酸序序列列5

16、 5 UAAGGAGG UAAGGAGG 33，即即Shine-DalgarnoShine-Dalgarno（SDSD）序序列列，它它通通过过识识别别大大肠肠杆杆菌菌核核糖糖体体小小亚亚基基中中的的 1616S S rRNA rRNA 33端端 区区 域域 3 3 AUUCCUCC AUUCCUCC 55并并 与与 之之 专专 一一 性性 结结 合合，将将mRNAmRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；定位于核糖体上，从而启动翻译；翻翻译译起起始始密密码码子子，大大肠肠杆杆菌菌绝绝大大部部分分基基因因以以AUGAUG作作为为阅阅读读框框架架的的起起始位点，但有些基因也使用始位点，但有些基因也使用

17、GUGGUG或或UUGUUG作为翻译起始密码子；作为翻译起始密码子；SDSD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区基因编码区5 5 端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列的影响序列的影响：一般来说，一般来说，mRNAmRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于率就越高，而这种结合程度主要取决于SDSD序列与序列与161

18、6S rRNAS rRNA的碱的碱基互补性，其中以基互补性，其中以GGAGGGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成言，上述四个碱基中任何一个换成CC或或T T，均会导致翻译效率大幅均会导致翻译效率大幅度降低度降低 核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响：SDSD序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为AAAAAAAA或或UUUUUUUU，翻译效率最高；而翻译效率最高；而CCCCCCCC或或GGGGGGGG

19、的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的50%50%和和25%25%。紧邻。紧邻AUGAUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b b-半半乳糖苷酶的乳糖苷酶的mRNAmRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAUUAU或或CUUCUU，如果用如果用UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG取代之，则酶的表达水平低取代之，则酶的表达水平低2020倍倍核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列与起始密码子之间的距离的影响序列

20、与起始密码子之间的距离的影响：SDSD序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体在核糖体上定位后，翻译起始密码子上定位后，翻译起始密码子AUGAUG正好处于核糖体复合物结构中的正好处于核糖体复合物结构中的P P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SDSD序列位于序列位于AUGAUG之前大约之前大约七个碱基七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低会导致翻译起始效率不同程度的降低核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位

21、点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响：大肠杆菌中的起始大肠杆菌中的起始tRNAtRNA分子可以同时识别分子可以同时识别AUGAUG、GUGGUG和和UUGUUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUGGUG为为AUGAUG的的50%50%而而UUGUUG只及只及AUGAUG的的25%25%。除此之外，从。除此之外，从AUGAUG开始的前几个密码子碱开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNAmRNA的的

22、5 5 端非编码区形端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰成茎环结构，否则便会严重干扰mRNAmRNA在核糖体上的准确定位在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的 密码子密码子生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：子使用频率

23、并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量生物基因组中的碱基含量 在富含在富含ATAT的生物（如单链的生物（如单链DNADNA噬菌体噬菌体f fX174X174）基因组中，密码子第三位上的基因组中，密码子第三位上的UU和和A A出现的频率较高；而在出现的频率较高；而在GCGC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有GG或或CC的简并密码子的简并密码子占占90%90%以上的绝对优势以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律性中等强度规律 细胞细胞内内tRNAtRNA的含量的

24、含量如如GGGGGG、CCCCCC、GCGGCG、GGCGGC、AAAAAA、UUUUUU、AUAAUA、UAUUAU等使用少；等使用少；如如GUGGUG、CACCAC、UCGUCG、AGCAGC、ACAACA、UGUUGU、AUCAUC、UUGUUG等使用多；等使用多；密码子密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高 效翻译的一个重要

25、因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成外源基因全合成同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因密码子密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的

26、高效表达均采用了这种方法大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法 外源基因全合成外源基因全合成密码子密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNAtRNA编码基因同步克隆表达编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在的策略较为有利。例如，在人尿激酶原人尿激酶原cDNAcDNA的的412412个密码子中，共含个密码子中，共含有有2222个个精氨酸密码子精氨酸密码子，其中，其中7 7个

27、个AGGAGG、2 2个个AGAAGA，而大肠杆菌受体细胞而大肠杆菌受体细胞中中tRNAtRNAAGGAGG和和tRNAtRNAAGAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNAcDNA在大肠在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNAtRNA编码基因克隆在另一个编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用细胞对外源基因高效表达的制约作用同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因质粒

28、拷贝数质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的

29、下降而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道轨道质粒拷贝数质粒拷贝数质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制pCP3pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子拥有一个温度可诱导型的复制子pCP3pCP3PPLLMCSMCSorioriApAprr在在2828时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为6060在在4242时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至300-600300-600在此温度下，受体细胞染色体上的在此温度下，受体细胞染色体上的CICI基基 因表达的温

30、度敏感型阻遏蛋白失活因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一种手段同时控制质粒拷因此，用一种手段同时控制质粒拷 贝数和基因的表达贝数和基因的表达C C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略6 6 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质包涵体及其性质 在某些生

31、长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为溶性的结构称为包涵体包涵体（Inclusion BodiesInclusion Bodies，IBIB）。）。富含蛋白质的包涵富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理

32、化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNADNA、RNARNA和和脂多糖等非蛋白分子脂多糖等非蛋白分子包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵

33、体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来解物中分离出来能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁蛋白的稳定性已构不成威胁包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目

34、的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的分子中的CysCys残基数目较高时，体外复性蛋

35、白质的成功率相当低，残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过一般不超过30%30%包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的操作以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%20%以上时，表达产以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是

36、包涵体的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在法的长处所在包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作C C 共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质蛋白质变性复性的动力学原理：蛋白质变性复性的动力学原理：CC11CC22CCnnCCUUI I 11I I nnNNXX11XX22XXnnXXAgAgAgAgAgAgAgAgI I 有效变复性过程中的中间状态有效变复性过程中的中间状态X X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态N N 天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质U U 变性状态的蛋白质

37、变性状态的蛋白质A A 集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质在细菌细胞内，在细菌细胞内，集聚状态集聚状态和和共价修饰共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的包涵体的溶解

38、与变性的主要任务是拆开错配的二硫键二硫键和和次级键次级键在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：包涵体溶解变性的试剂和条件包括：清洗剂清洗剂 SDSSDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂促溶剂 盐酸胍盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂混合溶剂 如如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强

39、尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强 极端极端pH pH 廉价，但许多蛋白质在极端廉价，但许多蛋白质在极端pHpH条件下发生修饰反应条件下发生修饰反应包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：通过通过次级键次级键的形成使蛋白质复性的形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开的将多肽链中被拆开的游离巯基游离巯基重新折叠重新折叠包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变

40、性与复性操作包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）：复性操作复性操作 包涵体复性操作的方法包括：包涵体复性操作的方法包括：分段稀释法，分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生一步稀释法，一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大试剂添加法，试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEGPEG、CaCa2+2+蛋白修饰法，蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，

41、产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，分子伴侣法，GroELGroEL、GroESGroES、DnaKDnaK，固定化，共表达固定化，共表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）：二硫键形成二硫键形成在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防化学氧化法（化学氧化法（AA）需要电子受体，最廉价的电子受体为

42、空气，二硫键形成是需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是二硫键交换（二硫键交换（BB）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSHGSH和和GSSGGSSG），），二硫键二硫键止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有：配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有：随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 形成相对

43、特异，因此适用性较广，重折叠效果好形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好HSHSHSHS S S S S+22ee+22HH+AAHSHSHSHS S-S-R S-S-R HS HS+BBR-S-S-RR-S-S-R S S S S22R-SHR-SH分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白运输或分泌

44、方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物产物NN端端信号肽信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件序列的存在是蛋白质分泌的前提条件分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳 稳定性大约是在细胞质中的稳定性大约是在细胞质中的1010倍倍目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白相当多的真核生物成熟蛋白NN端并不含有端并不含有 甲硫氨酸残

45、基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质 N N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠 杆菌的杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其NN端端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的缺点：分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机

46、制并不健相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍尽管有，但并不普遍分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达蛋白质的分泌机制蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多原核细菌周质中含有多种种分子伴侣分子伴侣可阻止分泌可阻止分泌蛋白的随机折叠蛋白的随机折叠，

47、分泌分泌在细胞周质或培养基中在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感蛋白酶不敏感 分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型目的蛋白表达系统的构建分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌泌到胞外，但有些

48、革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内上的磷酸酯酶上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。，导致细菌内外膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并

49、使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。组大肠杆菌中的完全分泌。融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架阅读框架进行表达。由这进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于通常受体细菌

50、的蛋白部分位于NN端，异源蛋白位于端，异源蛋白位于CC端。通过在端。通过在DNADNA水水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物