基因工程制胰岛素(生工版)讲课教案.ppt
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1、基因工程制胰岛素(生工版)基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法化学合成A链和B链的编码序列2022/11/272基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法表达产物的后期处理路线:2022/11/273基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略:2022/11/274基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法表达产物的后期处理路线:2022/11/275基因工程制胰岛素三种方法三、A链和B链同时表达法2022/11/276方法一:由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基,体外二硫键的正确配对率较低,通常只有10%-20%,因此成本高。方法二:胰岛素原能形成
2、良好的空间构象,三对二硫键的正确配对率提高,折叠率高。工艺路线依然繁琐。方法三:需体外折叠。基因工程制胰岛素三种方法三种方法比较:2022/11/277基因工程获取胰岛素的步骤基因工程获取胰岛素的步骤一、获取外源目的基因片段二、选择与获取表达载体三、重组目的DNA片段与表达载体四、选择与获取表达细胞五、重组体导入表达细胞六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定七、工程菌产物鉴定和保存八、发酵培养2022/11/278一、获取外源目的基因片段1选择实验材料2提取RNA,分离RNA3逆转录mRNA,得cDNA第一链4得双链DNA5DNA序列纠错6.目的基因通过细胞克隆扩增7.目的基因回收及DNA测序,最终
3、目的基因获取2022/11/279一、获取外源目的基因片段1选择实验材料胰岛素是一种蛋白质类激素,体内胰岛素是胰岛B细胞(即胰岛细胞)受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。胰岛素基因只有在胰岛B细胞中才能转录出信使RNA,所以用基因工程方法生产胰岛素时,选用胰岛B细胞为获取目的基因的实验材料。2022/11/2710一、获取外源目的基因片段2提取RNA,分离RNA 21 总RNA的提取 22 mRNA的纯化 23 mRNA的保存2022/11/2711一、获取外源目的基因片段21 总RNA的提取 总RNA的抽提方法有多种,TRIzol试剂是使用组广泛的R
4、NA抽提试剂,主要由苯酚和异硫氰酸胍组成,可以迅速破坏细胞结构,使存在于细胞质及核内的RNA释放出来,并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂,在样品裂解或匀浆过程中,TRIzol能保持RNA完整性。提取RNA时,首先用液氮研磨材料,匀浆,加入TRIzol试剂,进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提,离心,分离水相和有机相,收集含有RNA的水相,通过异丙醇沉淀,可获得比较纯的总RNA,用于
5、下一步mRNA的纯化。2022/11/2712一、获取外源目的基因片段211 TRIzol法提取流程(1)样品处理 培养细胞:收获细胞1-5*107,移入1.5ml离心管中,加入1ml TRIzol,混匀,室温静置5min。组织:取50-100mg组织(新鲜或-70及液氮中保存的组织均可)置1.5ml离心管中,加入1ml TRIzol充分匀浆,室温静置5min。(2)加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。(3)4离心,12000g*15min,取上清液。(4)加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。(5)4离心,12000g*10min,弃上清液。(6)加入1ml
6、 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4,7500g*5min,弃上清液。(7)晾干,加入适量的DEPCH2O溶解(65促溶10-15min)。2022/11/2713一、获取外源目的基因片段211 TRIzol法提取流程图2022/11/2714一、获取外源目的基因片段22 mRNA的纯化该方法利用mRNA3端含有PolyA(多聚腺苷酸)的特点,当RNA流经寡聚dT纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异性的结合在柱上,再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。2022/11/2715一、获取外源目的基因片段2 22 21 1 寡聚(寡聚(dTdT)纤维素
7、柱纯化)纤维素柱纯化mRNAmRNA(1 1)试剂准备:)试剂准备:3M3M醋酸钠(醋酸钠(pH5.2pH5.2););0.1M NaOH0.1M NaOH;上样缓冲液:上样缓冲液:20mM Tris-HCl20mM Tris-HCl(pH7.6pH7.6),0.5M NaCl,1M,0.5M NaCl,1M EDTA(pH8.0),0.1%SLS(EDTA(pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠十二烷基氨酸钠)。配制时可先配制。配制时可先配制Tris-HClTris-HCl(pH7.6pH7.6)、)、NaClNaCl、EDTAEDTA(pH8.0pH8.0)的母液,经高压消)的母液,
8、经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至6565,加入经加入经6565温育(温育(30min30min)的)的10%SLS10%SLS至终浓度为至终浓度为0.1%0.1%;洗脱缓冲液:洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl10mM Tris-HCl(pH7.6pH7.6),),1mM 1mM EDTAEDTA(pH8.0pH8.0),),0.05%SDS0.05%SDS;无水乙醇、无水乙醇、70%70%乙醇;乙醇;DEPCDEPC(0.1%0.1%焦炭酸二乙酯)焦炭酸二乙酯)2022/11/2716一、获取外源目的基因片段221
9、寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA(2 2)操作步骤:)操作步骤:将将0.5-1.0g0.5-1.0g寡聚(寡聚(dTdT)纤维悬浮于)纤维悬浮于0.1M0.1M的的NaOHNaOH溶液中。溶液中。用用DEPCDEPC处理的处理的1ml 1ml 注射器或适当的细管,将寡聚(注射器或适当的细管,将寡聚(dTdT)纤维素装柱)纤维素装柱0.5-1ml0.5-1ml,用,用3 3倍倍柱床体积的柱床体积的DEPCH2ODEPCH2O洗柱。洗柱。使用使用1*1*上样缓冲液洗柱,直至洗出液上样缓冲液洗柱,直至洗出液pHpH值小于值小于8.08.0。将将RNARNA溶解于溶解于DEPCH2ODEPCH2O中,
10、在中,在6565中温育中温育10min10min左右,冷却至室温后加入等体左右,冷却至室温后加入等体2*2*上样上样缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。当缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。当RNARNA上样液全部进入柱床后,再用上样液全部进入柱床后,再用1*1*上样缓上样缓冲液洗柱,继续收集流出液。冲液洗柱,继续收集流出液。将所有流出液于将所有流出液于6565加热加热5min5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。用用5-105-10倍柱床体积的倍柱床体积的1*1*上样缓冲液洗柱,每管上样缓冲液洗柱,每管1ml1ml分步收集,分步收集,OD260OD2
11、60测定测定RNARNA含量。含量。前部分收集管中流出液的前部分收集管中流出液的OD260OD260值很高,其内含物为无值很高,其内含物为无polyApolyA尾的尾的RNARNA。后部分收集管中。后部分收集管中流出液的流出液的OD260OD260值很低或无吸收。值很低或无吸收。用用2-32-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱polypoly(A+A+)RNARNA,分步收集,每部分为,分步收集,每部分为1/3-1/21/3-1/2柱柱体积。体积。OD260OD260测定测定polypoly(A+A+)RNARNA分布,合并含分布,合并含polypoly(A+A+)RNARNA
12、的收集管,加入的收集管,加入1/101/10体积体积3M 3M NaAcNaAc(pH5.2pH5.2)、)、2.52.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20-20放置放置30min30min。44离心,离心,10000g*15min10000g*15min,小心吸弃上清。用,小心吸弃上清。用70%70%乙醇洗涤沉淀。乙醇洗涤沉淀。44离心,离心,10000g*5min10000g*5min,弃上清,室温晾干。,弃上清,室温晾干。用适量的用适量的DEPCH2ODEPCH2O溶解溶解RNARNA。2022/11/2717一、获取外源目的基因片段221 寡聚(dT)纤维素
13、柱纯化mRNA(3 3)注意事项)注意事项 整个实验过程必须防止整个实验过程必须防止RnaseRnase的污染。的污染。步骤步骤中将中将RNARNA溶液置溶液置6565中温育然后冷却至室温再上样的目的有中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏两个,一个是破坏RNARNA的二级结构,尤其是的二级结构,尤其是mRNA polymRNA poly(A+A+)尾处的二)尾处的二级结构,使级结构,使polypoly(A+A+)尾充分暴露,从而提高)尾充分暴露,从而提高polypoly(A+A+)RNARNA的回收率;的回收率;另一个目的是能解离另一个目的是能解离mRNAmRNA与与rRNArR
14、NA的结合,否则会导致的结合,否则会导致rRNArRNA的污染。所的污染。所以此步骤不能省略。以此步骤不能省略。十二烷基肌氨酸钠盐在十二烷基肌氨酸钠盐在1818以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于若室温低于1818最好用最好用LiClLiCl替代替代NaClNaCl。寡聚(寡聚(dTdT)纤维素柱可在)纤维素柱可在44贮存,反复使用。每次使用前应该依贮存,反复使用。每次使用前应该依次用次用NaOHNaOH、灭菌、灭菌ddH2OddH2O、上样缓冲液洗柱。、上样缓冲液洗柱。一般而言,一般而言,107107哺乳动物培养细胞能提取哺乳动物培养细胞能提取1
15、-5g poly1-5g poly(A+A+)RNARNA,约相当于上柱总约相当于上柱总RNARNA量的量的1%-2%1%-2%。2022/11/2718一、获取外源目的基因片段23 mRNA的保存用少量水溶解mRNA,即可用于cDNA合成或保存在70%乙醇中并于-70下贮存。2022/11/2719一、获取外源目的基因片段胰岛素基因胰岛素基因mRNAmRNA序列序列2022/11/2720一、获取外源目的基因片段胰岛素基因胰岛素基因mRNAmRNA序列序列NCBINCBI中搜索得2022/11/2721一、获取外源目的基因片段3逆转录mRNA,得cDNA第一链 mRNAmRNA在反转录酶的作
16、用下由引物引导合成在反转录酶的作用下由引物引导合成cDNAcDNA。加入高浓度的加入高浓度的OligoOligo(dTdT)引物,)引物,OligoOligo(dTdT)引物与引物与mRNAmRNA的的33末端的末端的polypoly(A A)配对,)配对,引导反转录酶以引导反转录酶以mRNAmRNA为模板合成第一链为模板合成第一链cDNAcDNA。这种这种cDNAcDNA合成的方法在合成的方法在cDNAcDNA文库构建中应用文库构建中应用极为普遍,其缺点主要是由于极为普遍,其缺点主要是由于cDNAcDNA末端存在较长末端存在较长的的polypoly(A A)而影响)而影响cDNAcDNA测序
17、。(原因:测序。(原因:oligo oligo(dT dT)结合在)结合在 mRNA mRNA 的的 3 3 端,因此合成全长的端,因此合成全长的 cDNA cDNA 需要反转录酶从需要反转录酶从 mRNA mRNA 分子的一端移动到另一分子的一端移动到另一端,有时这种全合成难以达到)端,有时这种全合成难以达到)2022/11/2722一、获取外源目的基因片段4得双链DNA 4.1合成cDNA第二链得双链DNA 4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增 2022/11/2723一、获取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二链得双链DNA mRNAmRNAcDNAcDNA杂合双链中的杂合双链中的
18、mRNAmRNA链在链在RNARNA酶酶HH作用下先形成很作用下先形成很多切口,多切口,mRNAmRNA链就被切割成很多的小片段,这些小片段为大肠杆菌链就被切割成很多的小片段,这些小片段为大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶提供了合成第二链的引物。大肠杆菌提供了合成第二链的引物。大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶以第一链以第一链cDNAcDNA为模板合成一段段互补的为模板合成一段段互补的cDNAcDNA片段。这些片段。这些cDNAcDNA片段进而在片段进而在DNADNA连接酶的作用下连接成一条链,即连接酶的作用下连接成一条链,即cDNAcDNA的第二链。遗留在的第二链。遗留在5-5-末端的一段很小的
19、末端的一段很小的mRNAmRNA也被大肠杆菌也被大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的的5533核酸外切酶和核酸外切酶和RNARNA酶酶HH降解,暴露出降解,暴露出与第一链与第一链cDNAcDNA对应的对应的3-3-端部分序列。同时,大肠杆菌端部分序列。同时,大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶酶的的3-53-5核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNAcDNA的的3-3-端部分消化掉,形成平端或差不多的平端端部分消化掉,形成平端或差不多的平端优点优点:a)a)合成合成cDNAcDNA的效率高的效率高 b)b)直接利用第一链的反应产物直接利用第一链的反应产物,不需纯化不
20、需纯化 c)c)避免使用避免使用S1S1核酸酶来切割双链核酸酶来切割双链cDNAcDNA2022/11/2724一、获取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二链得双链DNA 2022/11/2725一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增 4.2.14.2.1模板模板DNADNA的变性的变性向离心管加入模板、引物、耐热的向离心管加入模板、引物、耐热的DNADNA聚合酶、聚合酶、PCRPCR缓冲液(缓冲液(500mm01500mm01L KClL KCl;100mmol100mmolL TrisL Tris一一HCl(pH8.4)HCl(pH8.4),150mmol150
21、mmolL L MgCl2MgCl2,lmglmgm1m1明胶)、明胶)、5mmo15mmo1L dNTPL dNTP贮备贮备液,然后加热至液,然后加热至9393左右一定时间后,使模左右一定时间后,使模板板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离,解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备反应作准备2022/11/2726一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增 4.2.24.2.2模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)模板模板DNADNA经加热变性成单链后,
22、温度降至经加热变性成单链后,温度降至5555左右,引物与模板左右,引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结单链的互补序列配对结合合;2022/11/2727一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增 4.2.34.2.3引物的延伸引物的延伸DNADNA模板模板-引物结合引物结合 物在物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下,以用下,以dNTPdNTP为反应原料,靶序列为模板,为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板的与模板DNA DNA 链互补的半保留复制链,重复链互补的半保留复制链,重复
23、循环变性循环变性-退火退火-延伸三过程,就可获得更延伸三过程,就可获得更多的多的“半保留复制链半保留复制链”,而且这种新链又可,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2 24 4分钟,分钟,2 23 3小时就能将待扩目的基因扩增小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。放大几百万倍。2022/11/2728一、获取外源目的基因片段5.目的基因回收纯化及DNA测序纠错 5.1 将目的基因进行回收纯化 5.2 对目的基因进行测序 5.3 DNA序列纠错2022/11/2729一、获取外源目的基因片段 5.1 将目的基因进行回收纯化1)1)在在PCR
24、PCR试管中加入凝胶缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳电泳到试管中加入凝胶缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳电泳到适当位置后在目的适当位置后在目的DNADNA条带的前端挖一长方形槽,向槽中条带的前端挖一长方形槽,向槽中加入融化的低熔点胶,待凝固后进行电泳。加入融化的低熔点胶,待凝固后进行电泳。2 2)当)当DNADNA进入低熔点胶中心时停止电泳。紫外灯下切下目的进入低熔点胶中心时停止电泳。紫外灯下切下目的条带的低熔点胶。条带的低熔点胶。3)3)将切下的胶放到离心管中,加入将切下的胶放到离心管中,加入200200的缓冲液,的缓冲液,6565温浴温浴3 3分钟以融化低熔点胶。分钟以融化低熔点胶。4)4)然后分别用酚然
25、后分别用酚/氯仿,氯仿抽提一次。取上清,加入氯仿,氯仿抽提一次。取上清,加入2 2倍体倍体积的无水乙醇,积的无水乙醇,-20-20沉淀沉淀DNA 2hDNA 2h以上,以上,12 000rpm12 000rpm离心离心15min15min,弃上清,用,弃上清,用70%70%乙醇洗涤,吹干后溶于乙醇洗涤,吹干后溶于10l10l无菌无菌水中。水中。注意事项:在紫外灯下切出含有目的注意事项:在紫外灯下切出含有目的DNA DNA 片段的琼脂糖凝胶片段的琼脂糖凝胶时应注意要快速操作,以免损伤。时应注意要快速操作,以免损伤。2022/11/2730一、获取外源目的基因片段 5.2 对目的基因进行测序利用利
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