基因工程操作步骤复习课程.ppt
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1、基因工程操作步骤一、目的基因的获取1 1目的基因主要是目的基因主要是编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因:如:与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2 2获取目的获取目的基因基因的常用方法:的常用方法:1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。
2、不编码蛋白质。:编码蛋白质:编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游有游有RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点:基基因因结结构构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 编码区编码区非编码区非编码区外显子:能编码蛋白质的序列外显子:能编码蛋白质的序列内含子:不能编码蛋白质的序列内含子:不能编码蛋白质的序列:有调控作用:有调控作用,上游有上游有RNARNA聚合聚合 酶结合位点酶结合位点(启动子启动子)。与与RNAR
3、NA聚合酶聚合酶结合位点结合位点基基因因结结构构1.从基因文库中获取目的基因1.基因文库的概念基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因。2.基因文库的种类基因文库的种类:基因组文库:基因组文库:含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库:部分基因文库:只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因,基因,如:如:cDNA文库文库基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部某生物体内全部DNADNA 许多许多DNA
4、DNA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶限制酶与运载体连接导入与运载体连接导入基因组文库基因组文库cDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接导入与运载体连接导入cDNA文库文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNA真核细胞的cDNA的获取编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区DNA聚合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA逆转录酶逆转录酶转录转录剪接剪接逆转录逆转录复制复制启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因不含不含非编码非编码序列序列。即不。即不
5、含含非编码区非编码区和和内含子内含子基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型文库类型 cDNA文库文库 基因组文库基因组文库 文库大小文库大小基因中启动子(具有启基因中启动子(具有启动作用的动作用的DNA片段)片段)基因中内含子基因中内含子(位于编位于编码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码DNA片段)片段)基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因 根据目的基因的有关信
6、息,例如,根据基因根据目的基因的有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物位置、基因的转录产物mRNA,以及基因的表达,以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。产物蛋白质等特性来获取目的基因。2.利用PCR技术扩增目的基因1 1概念:概念:PCRPCR全称为全称为_,是一项,是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。2 2原理:原理:DNADNA复制复制原料:原料:模板模板DNADNA;DNADNA引物;四种脱氧核苷引物;四种脱氧核苷酸;热稳定酸;热稳定DNADNA聚合酶聚合酶多聚
7、酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3 3前提:前提:已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程a a、DNADNA变性变性(90-9590-95):):双链双链DNADNA模板在热作用下,模板在热作用下,_断裂,形成断裂,形成_b b、退火、退火(复性复性55-6555-65):):系统温度降低,系统温度降低,引物引物与与DNADNA模模板结合,形成局部板结合,形成局部_。c c、延伸、延伸(70-7570-75):在):在TaqTaq酶酶的作用下,合成与模板的作用下,合成与模板互补的互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DN
8、ADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤:每重复一步骤:每重复一次,目的基因增加次,目的基因增加_倍倍一一5 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G变性变性复性复性延伸延伸1.目的基因目的基因DNA受热变性,解链;受热变性,解链;2.引物与单链互补结合;引物与单链互补结合;3.合成链在合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。5 5/3 3/A AG G引物引物过程:过程:PCR技术的操作过程PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数指数指
9、数(2(2n n)形式扩增形式扩增形式扩增形式扩增PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋变复制边解旋变复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段
10、片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、聚合酶、解旋酶、解旋酶、DNA连接酶等连接酶等PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性(变性(90-9590-95):双链):双链DNADNA模板模板 在热作用下,在热作用下,断裂,形成断裂,形成_ _ b b、复性(、复性(55-6055-60):系统温度降低,引物):系统温度降低,引物 与与DNADNA模板结合,形成局部模板结合,形成局部_。c c、延伸(、延伸(70-7570-75):在):在TaqTaq酶的作用下,从酶的作用下,从 引物的引物的55端端33端延伸,合成与
11、模板互补端延伸,合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链3.人工合成法 在基因较小,核苷酸序列已知的情况下,可在基因较小,核苷酸序列已知的情况下,可以利用以利用DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测思考:思考:化学法合化学法合成的目的基因含成的目的基因含内含内含子、启动子和终止子子、启动子和终止子吗?吗?人工合成法(真核生物真核生物)反转录法反转录法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA目的基因目的基
12、因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成推测推测推测推测单链单链DNADNA合成合成课堂小结目的基因的获取目的基因的获取1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种种类类基因组文库:基因组文库:含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库:部分基因文库:只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因,基因,如:如:cDNA文库文库二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1 1目的:目的:使目的基因在受体细
13、胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。2 2基因基因表达载体表达载体的组成:的组成:复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心(1 1)用一定的)用一定的_切切割质粒,使其出现一个切口,割质粒,使其出现一个切口,露出露出_。(2 2)用)用_切断目切断目 的基因,使其产生的基因,使其产生_ _ _。(3 3)将切下的目的基因片段插入质粒的)将切下的目的基因片段插入质粒的_处,再加入适量处,再加入适量_,形成了一个重组,形成了一个重组 DNADNA分子(重组质粒)分子(重组质
14、粒)限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程:基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心 1、目的:、目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因能够表达和发挥作用。2 2、基因表达载体的组成:、基因表达载体的组成:复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?启动子:启动子:位于基因的首端的位
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