实验三-离心技术及物质代谢实验-xuxia.ppt

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1、实验三-离心技术及物质代谢实验-xuxia Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验内容v离心技术v邻甲苯胺法测血糖含量v糖酵解中间产物磷酸丙糖的鉴定v酶法测定血浆胆固醇测定血浆胆固醇（下午）定义定义：离心技术：离心技术（Centrifuge technologyCentrifuge technology）是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或

2、漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。之目的。用途用途：离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组：离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一。分分离的最常用的方法之一。离心技术离心技术第一节第一节 离心技术的原理离心技术的原理 当一个粒子在高速旋当一个粒子在高速旋转下会受到离心力转下会受到离心力F F作用，作用，其大小为：其大小为：。m m：沉降粒子的有效质量：沉降粒子的有效质量 r r：粒子的旋转半径，单位：粒子的旋转半径，单位cmcm ：粒子旋转的角速度：粒子旋转的角速度离心机转速的表示方法离心机转速的表示方法：v1.1.每分钟转数

3、每分钟转数 R Revolutions evolutions P Per er M Minute inute(rpm)(rpm)v2.2.相对离心力相对离心力 R Relative elative C Centrifugal entrifugal F Force(RCF)orce(RCF)RCF RCF 表示实际离心力相当于地球引力的倍数，表示实际离心力相当于地球引力的倍数，常用数字乘常用数字乘“g”g”来表示。来表示。9802rwRCF=FmgRCF=1.11910-5(rpm)rrpmrpm：每分钟转数，单位：每分钟转数，单位r/minr/ming g：重力加速度，约等于：重力加速度，约等

4、于980cm/s980cm/s：单位弧度：单位弧度/秒秒 （rad/srad/s）相对离心力：相对离心力：v沉降颗粒在离心管中所处位置也不同，则所沉降颗粒在离心管中所处位置也不同，则所受离心力不同。因此在描述超速离心条件时，受离心力不同。因此在描述超速离心条件时，通常用通常用RCFRCF代替代替rpmrpm，因为它可以真实地反映，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。变化。F=m*F=m*r*r 沉降系数沉降系数定义：沉降速度与离心力加速度的比值，即单位离定义：沉降速度与离心力加速度的比值，即单位离心场中颗粒的沉降速度，单位为心场

5、中颗粒的沉降速度，单位为“S S”。S=V/r S=V/r 人们规定人们规定1S=1101S=110-13-13 秒秒 S=V(D-D)/f 用途：对于某些大分子化合物，当它们的详细结构用途：对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和分子量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去和分子量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们。如核糖体描述它们。如核糖体RNARNA有有30S30S亚基和亚基和50S50S亚基，这里亚基，这里的的S S就是沉降系数。就是沉降系数。第二节第二节 离心机的主要类型和构造离心机的主要类型和构造 工业用离心机工业用离心机离心机离心机 制备型离心机制备型离心机 实验用离心机

6、实验用离心机 分析型离心机分析型离心机 制备性离心机制备性离心机一、制备性离心机的一、制备性离心机的类型：类型：1.1.普通离心机普通离心机 2.2.高速冷冻离心机高速冷冻离心机 3.3.超速离心机超速离心机普通离心机普通离心机高速冷冻离高速冷冻离心机心机超速离心机超速离心机最大转速最大转速（rpmrpm）600020000 2500050000 80000 超速离心机装超速离心机装有真空系统，有真空系统，这是它与高速这是它与高速离心机的主要离心机的主要区别区别.v转头：包括角式转头转头：包括角式转头、荡平式转头、区带、荡平式转头、区带转头、垂直转头、连续流动转头转头、垂直转头、连续流动转头

7、v离心管：离心管：包括包括塑料离心管、塑料离心管、玻璃离心管、玻璃离心管、不锈钢离心管不锈钢离心管制备性离心机的主要构件：制备性离心机的主要构件：角式转头角式转头荡平式转头荡平式转头塑料离心管塑料离心管玻璃离心管玻璃离心管v首先根据待离心液体的性质及体积选用合适首先根据待离心液体的性质及体积选用合适的离心管的离心管v使用各种离心机前，必须事先在天平上精密使用各种离心机前，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，对称放置，不得地平衡离心管和其内容物，对称放置，不得使用奇数个离心管。使用奇数个离心管。v离心过程中不得随意离开离心过程中不得随意离开v若要在低于室温的温度下离心时，提前预冷若要在低

8、于室温的温度下离心时，提前预冷v注意最高转速，不得超速使用。注意最高转速，不得超速使用。离心操作的离心操作的注意事项注意事项 二、胰岛素对血糖含量的影响及测定二、胰岛素对血糖含量的影响及测定 实验目的：实验目的：通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用，即检测家兔注射胰岛素前后血糖浓度的改变用，即检测家兔注射胰岛素前后血糖浓度的改变.掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度。掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度。实验原理：实验原理：1.1.胰岛素降血糖的机理：胰岛素降血糖的机理：1)1)促促进进肌肌肉肉、脂脂肪肪组组织织对对葡葡萄萄糖糖的的通通透透性性，促促进进葡萄糖进入这些

9、细胞；葡萄糖进入这些细胞；2)2)糖原合成糖原合成,糖原分解糖原分解；3)3)糖有氧氧化糖有氧氧化；4)4)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成糖异生糖异生；5)5)激素敏感性脂肪酶激素敏感性脂肪酶脂肪动员脂肪动员。2.邻甲苯胺法测血糖含量邻甲苯胺法测血糖含量 葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液中），水中），水 浴加热至浴加热至100100左右，脱水生成羟甲基呋喃左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深浅并进行成蓝绿色的化合物

10、，根据颜色深浅并进行630 nm630 nm波长波长比色测定其含量。比色测定其含量。实验方法实验方法1.1.胰岛素对血糖含量的影响：家兔注射胰岛素前后胰岛素对血糖含量的影响：家兔注射胰岛素前后 血糖含量的变化。血糖含量的变化。1）取饥饿12小时家兔一只，记录体重。2）采取血标本：用二甲苯棉球涂擦家兔耳部，使局部血管 扩张，然后用刀片纵行切开边缘耳静脉，让血液自然滴 入试管中，收集约2ml，待血凝固后，分离血清。3）按家兔体重，皮下或腹腔注射1.5单位kg胰岛素，记录 注射时间，待40分钟后，用同样方法取血，分离血清。4）将注射胰岛素前后的血清，分别测定血糖含量。2.2.血糖含量的测定：血糖含量

11、的测定：1.1）取试管四支，按下表操作试剂（试剂（mlml）测定管（前）测定管（前）测定管（后测定管（后)标准管标准管空白管空白管血清（前）血清（前）血清（后）血清（后）糖标准糖标准蒸馏水蒸馏水邻甲苯胺试剂邻甲苯胺试剂0.10.14.04.00.10.14.04.00.10.14.04.00.10.14.04.02）混匀，置沸水浴中加热10分钟，取出立即置冷水中冷却3）用630nm波长，以空白管校正吸光度为0，分别测定各管吸光度值4）计算：180v目前国内医院多采用葡萄糖氧化酶法和邻甲苯胺法测定血糖。葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶法邻甲苯胺法测定邻甲苯胺法测定血糖血糖优点优点特异性强、价廉、方特异

12、性强、价廉、方法简单法简单不易出现假性过不易出现假性过高或过低高或过低,结果较结果较可靠可靠正常正常值值空腹全血为空腹全血为3.65.3mM/L空腹全血为空腹全血为3.35.6mM/L注意问题注意问题二甲苯能扩血管但是它有溶血的作用，所以切开取血前要晾一会。v沸水浴时注意安全；管口朝墙，防止高温溅出伤到自己。糖酵解中间产物的鉴定糖酵解中间产物的鉴定【实验目的实验目的】检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。【实验原理实验原理】3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛 磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮6-磷酸果糖磷酸果糖1,6-二磷酸果糖二磷酸果糖ADPATP6-6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖AD

13、PATP葡萄糖葡萄糖3-磷酸甘油醛脱氢酶磷酸甘油醛脱氢酶NAD+1,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸ADPATPNADH+H+丙酮酸丙酮酸酶酶-SH+ICH2COOH酶酶S-CH2COOH+HI一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸红棕色红棕色v【实验方法实验方法】取试管取试管3 3支，编号，按下表进行操作支，编号，按下表进行操作记录三管所发生的情况，并加以简要的分析记录三管所发生的情况，并加以简要的分析CCLCCL3 3COOHCOOH的作用：强酸，使糖酵解的全部酶失活。的作用：强酸

14、，使糖酵解的全部酶失活。一碘醋酸的作用：使一碘醋酸的作用：使3-3-磷酸甘油醛脱氢酶失活。磷酸甘油醛脱氢酶失活。硫酸肼的作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。硫酸肼的作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。试试 剂（剂（mlml）1 12 23 3pH7.4pH7.4磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液一碘醋酸一碘醋酸硫酸肼硫酸肼1010CCLCCL3 3COOH COOH 酵母液酵母液水水 2.02.00.5 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 4.0 4.0 2.02.00.5 0.5 0.50.54.04.01.01.02.0 2.0 4.0 4.0 2.02.0混匀，在混匀，在37373

15、838恒温水浴中保温恒温水浴中保温3030分钟分钟一碘醋酸一碘醋酸 硫酸肼硫酸肼1010CCLCCL3 3COOH COOH 水水 2.02.0 1.0 1.0 1.01.00.50.50.50.51.01.0 混匀，静置混匀，静置1010分钟，分钟，离心离心,3000,3000转转/min,10/min,10分钟，再取三支试分钟，再取三支试管，对号按下表操作管，对号按下表操作上清液上清液 1mol/LNaOH1mol/LNaOH0.5 0.5 0.50.50.50.5 0.50.50.5 0.5 0.50.5混匀，在室温放置混匀，在室温放置1010分钟分钟2 2，4 4二硝基苯肼二硝基苯肼

16、1mol/L NaOH1mol/L NaOH0.5 0.5 3.53.50.5 0.5 3.53.50.50.53.53.5v实验注意事项：试管、移液管洗干净；加入的试剂正确；混匀；成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，生成的颜色比较稳定。血清胆固醇测定（酶法）血清胆固醇测定（酶法）【实验目的实验目的】1.1.了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。2.2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。掌握血清胆固醇测定的临床意义。血清中总胆固醇包括胆固醇酯血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE,70%)(CE,70%)和游离型

17、胆固醇和游离型胆固醇(FC,(FC,30%)30%)。胆固醇酯酶（。胆固醇酯酶（CEHCEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（离脂肪酸（FFAFFA），胆固醇在），胆固醇在胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶（CODCOD）的作用）的作用下氧化生成下氧化生成44胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（PODPOD）催化与）催化与4-4-氨基安替比林（氨基安替比林（4-AAP4-AAP）和酚反应，生成）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500 500 nmnm波长

18、处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：含量。反应式如下：【实验原理实验原理】1.1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。抗凝，不可用草酸盐、氟化物。2.2.取试管取试管3 3支，编号，按下表操作。支，编号，按下表操作。【实验方法实验方法】加入物加入物（ul ul）测定管测定管标准管标准管空白管空白管血清血清1010-胆固醇标准胆固醇标准液液-1010-蒸馏水蒸馏水-1010酶应用液酶应用液10001000100010001

19、00010003 3.混匀后，混匀后，3737水浴保温水浴保温1515分钟，在分钟，在500 nm500 nm波长处比波长处比 色，以空白管调零，读取各管吸光度。色，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算计算】A A标本标本 CHOCHO（mmol/Lmmol/L）=标准液浓度标准液浓度 A A标准标准 【标准液标准液】胆固醇胆固醇 5.17 mmol/L5.17 mmol/L（200mg/dL200mg/dL）【正常参考范围正常参考范围】3.10 3.105.70mmol/L 5.70mmol/L 注意问题注意问题v胆固醇含量测定：4个组做空白和标准管，样品管每个组都做。测吸光度值时把空白管和标准管放入分光光度计，只换样品液即可。