SMN1基因外显子缺失检测试剂的临床价值及相关产品审评情况.docx

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1、SMN1基因外显子缺失检测试剂的临床价值及相关产品审评情况发布时间：2018-09-04(原创2018-09-04 CMDE中国器审)脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种常染 色体隐性遗传病，居儿童致死性常染色体隐性遗传病的第2位。位于 染色体5qll. 2ql3. 3上的运动神经元存活基因(Survival motor neuron, SMN)是SMA的主要致病基因。人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1 和着丝粒侧的SMN2,两者仅有5个碱基不同。SMN1是主要功能基 因，该基因突变可导致SMA发病，SMN2为临床表型的调节基

2、因，影响 病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻SMA表型。目前已知约94%的 SMA患者为SMN1基因第7和(或)第8外显子纯合缺失所致，少数 病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。SMN1基因外显子缺失检测在SMA诊断中的意义SMA以脊髓前角运动神经元退化变性为特征，临床表现为进行 性、对称性四肢近端和身体躯干肌肉无力、萎缩和瘫痪。根据发病年 龄和肌无力严重程度，临床上将SMA分为I、II和HI型，即婴儿型、 中间型和少年型，严重程度依次递减。一般的，神经专科医生根据发 病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断，辅助检查方法包括 肌电图、肌酶和肌肉活检，结合家族史和SMN1基因分析可进行

3、确诊。肌电图是定位诊断，特异度不高；肌酶在鉴别其他肌无力疾病中 有参考意义，但对SMA诊断无特异性；肌肉活检由于取材的创伤性， 患儿不易接受。由于SMA患儿中约94%为SMN1基因外显子纯合缺 失，因此SMN1基因缺失检测对于SMA的诊断具有更高的灵敏度和特 异性，且对不同型的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差异，也 就是说SMN1纯合缺失的检测对于不同型SMA患者具有相同的临床诊 断价值；同时与有创的组织学诊断相比，基因检测更易被接受。事实 上，在欧美人群中，SMN1基因纯合缺失检测已成为诊断和排除诊断 SMA的首选方法。SMN1基因外显子缺失检测在产前诊断和筛查中的意义SMA在人群中

4、的发病率为1/5 0001/10 000,群体携带 者频率为1/351/50,是出生缺陷的高危因素。由于该病严重危害人 类健康，且基因位点明确，因此极有必要进行SMA携带者的人群筛 查。通过SMN1基因外显子杂合缺失突变的检查可确认无症状的携带 者。当夫妻双方均为携带者时，可对其进行遗传咨询，评估生育患儿 的遗传风险，并可以通过产前诊断技术降低人群中SMA患儿的出生 率。在欧美等国家很早就建议在普通人群中进行SMA携带者的筛查。但在SMA患儿临床诊断和SMA携带者筛查中，对SMN1基因外显 子缺失检测的要求是截然不同的，前者仅需准确检测出SMN1基因外 显子纯合缺失，后者则需要鉴别SMN1基因

5、外显子杂合缺失。SMN1基因缺失检测试剂的现状目前，SMN1基因外显子缺失检测试剂较为缺乏。临床检验实验室较为公认的方法是PCR结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方 法，但该方法操作较为繁琐，且重复性差，不利于标准化，不易推 广。这种方法只能检测出纯合缺失，无法确认杂合缺失。荷兰的SMA MLPA检测试剂可对待测靶序列进行半定量分析，因 此既可检测纯合缺失，亦可确认杂合缺失。在国内外已有多篇文献报 道采用该方法进行SMA患者诊断和SMA携带者筛查。但该产品目前 仍为“仅用于研究”的试剂，尚未按照体外诊断类医疗器械上市 (98/79/EC) o2015年底，CFDA批准了第一项SMN

6、1缺失突变检测试剂上市。该 产品采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单拷贝 基因RPP40为内参基因，对SMN1基因第7外显子和第8外显子拷 贝数进行相对定量检测，用于脊肌萎缩症(SMA)患者的体外辅助分子 诊断。SMN1基因外显子缺失检测的难点之一在于排除高同源性基因 SMN2的干扰，特别是对于SMN2高拷贝数的受试者，需保证结果的准 确可靠。该产品通过对实时荧光PCR相对定量、绝对定量技术进行系 统整合，并在反应体系中加入特定化学组份，以抑制PCR引物3端 的胞喀咤(O与胸腺喀咤(T)的错配，增加PCR扩增的特异性，从 而有效控制SMN2基因非特异性扩增对检测结果的

7、影响，准确检出高 拷贝数SMN2样本中SMN1基因第7外显子和第8外的缺失情况。鉴于国内外尚无任何按照体外诊断试剂批准上市的SMA分子诊断 产品，因此临床试验方案中依据EMQN关于SMA分子诊断最佳实践 指南，采用了国内外SMA体外辅助分子诊断领域公认的PCR-RFLP 法作为对照方法。临床试验共完成1069例，其中正常对照组777 例，SMA病例组292例，统计分析结果显示申报产品与对比方法检测 结果的一致性为100% （95%置信区间：99. 66%-100%）。此外，9747 例正常成年人大样本中目标外显子 Ct分布范围的调查亦显示， 该产品的纯合突变判断界值设置合理。该试剂目前批准的预

8、期用途仅包含纯合缺失的检测，尚不能用于 杂合缺失的检测。因此无法用于SMA携带者的筛查。这是该产品的缺 陷之一。但事实上该产品在设计上已考虑到SMA携带者的检测。该产 品的检测原理是以待测样本中目标外显子荧光信号Ct值与内参基因 荧光信号Ct值之差（ Ct_s）,与正常对照品三个梯度稀释品中目 标外显子荧光信号Ct值与内参基因荧光信号Ct值之差的平均值（ Ct_a）之差，即44 Ct,作为待测样本中目标外显子拷贝数检 测变量（ Ct= Ct_s - Ct_a） o依据实时荧光定量PCR相 对定量的基本数学原理推导得到申报产品检测变量44 Ct的计算公 式，依据这一计算公式可推导出纯合缺失、杂合

9、缺失和野生型的 Ct理论值（或范围）；再结合目标外显子与内参基因扩增效率差异以 及SMN2不同拷贝数的影响，可对上述44 Ct理论值进行优化；结 果显示纯合缺失、杂合缺失和野生型的 Ct值（或范围）之间可 设置合理的判断界值，因此理论上该产品可分别检测出三种基因状 态。但鉴于生产企业对杂合缺失与野生型之间的判断界值研究尚不透 彻，再加上缺乏可判定杂合缺失的对比方法等其他困难，本次注册申 请的预期用途仅限于检测纯合突变，即SMA患者辅助诊断。小结综上，SMN1基因外显子缺失检测在SMA疾病诊断和SMA携带者 筛查中具有重要的临床价值。然而到目前为止，受到技术水平的限 制，相关的体外诊断试剂比较缺乏，特别是可用于SMA携带者筛查的 杂合缺失检测，尚无适合的体外诊断试剂上市。参考文献：1王佶等.脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数变异分析.中 国循证儿科杂志，2013年03期.2张文慧，曹延延等.运用MLPA技术分析脊髓性肌萎缩症患儿 SMN1基因的部分缺失.中华医学杂志，2015.95 (6).3江雨，周裕林，脊髓性肌萎缩症SMN1基因携带者筛查技术研究 进展.中国产前诊断杂志(电子版)2013,5(02): 34-39.