综合实验一:植物原生质体的分离、融合与培养.docx
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1、综合实验一:植物原生质体的分离、融合与培养植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义,在植物遗传工程和育种研究 上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一,它不仅能克服远缘杂 交有性不亲和障碍,也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦,最终将野生种的 远缘基因导入栽培种中,原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。1954年,植物单细胞培养才获 得成功。Mllir培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的 单细胞克隆,并建立了看护培养的方法;I960年Jones等建立了微室培养法。同年
2、,Cocking 应用酶法分离原生质获得成功,从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适 用于原生质体分离的商品酶的出现,原生质体的培养方法也得到了不断地改进,现在常用的 原生质体培养方法有:液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使 用条件培养基或饲喂培养等。实验目的了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞。是开展基础研究的理想 材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半 纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细 胞壁
3、。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合,现在被广泛采用并证明行之有效 的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。高Ca高pH法和电融合法:PEG作为一种高分子化合物,2050%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应,原生 质体很快发生收缩与粘连,随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。PEG诱导融合的机理:PEG由于含有醛键而具负极性,与水、蛋白质和碳水化合物等 一些正极化基团能形成氢键,当PEG分子足够长时,可昨为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子,Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥, 因而促进粘连。在洗涤过程中,连接在原生质体膜上的
4、PEG分子可被洗脱.这样将引起电 荷的紊乱和再分布.从而引起原生质体融合:高Ca高pH由于增加了质膜的流动性,因而 也大大提高了融合频率,洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。原生质体分离纯化或融合后,在适当的培养基上应用合适的培养方法,能够再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂,直至形成细胞团,长成愈伤组织或胚状体,再分化发育成苗。其中, 选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。实验内容1.原生质体分离2.原生质体融合3.原生质体及融合体的培养实验材料与用品三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镶子、培养皿、滤纸、0.21im滤 膜、滤器、培养瓶(注:以上用品
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