丙酮丁醇高产菌株选育及发酵工艺研究_万冬梅.docx

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1、 I 山东大学硕士论文 目录 .1 m-M 新仑 . 1 u 纤维素及其预处理 . 1 l.i.i 木质纤维原料的组成 . 1 1.1.2 纤维素预处理技术 . 2 1.1.2.1 物理法 . 2 1.1.2.2 化学法 . 2 1.1.2.3 酶解法 . 3 1.2 丙酮丁醇性质及用途 . 3 1.3 丙酮丁醇的主要生产方法 . 4 1.4 发酵菌种和过程 . 5 1.5 丙酮 -丁醇发酵生产现状 . 6 1.6 我国丙酮 -丁醇方面近年来取得的研宄成果 . 7 1.7 论文研宄的意义和主要内容 . 7 #嫌 . 9 第二章丙酮丁醇发酵产物检测分析方法 . 12 弓 I 言 . 12 2.

2、1 实验材料与方法 . 13 2.1.1 实验试剂 . 13 2.1.2 实验主要仪器 . 13 2.1.3 实验方法 . 13 2.1.3.1 气相色谱检测方法 . 13 2.1.3.2 溶剂出峰时间的研宄方法 . 13 2.1.3.3 发酵液中产物含量的检测 . 14 2.2 结果与分析 . 14 2.2.1 色谱条件的选择 . 15 2.2.2 定性和定量方法 . 15 2.2.3 溶剂出峰时间的研宄 . 16 2.2.4 检测方法准确性研宄的结果 . 17 2.3 20 参考文献 . 21 第三章木糖渔的糖化及发酵 . 22 S . 22 3.1、实验材料及方法 . 23 3.1.1

3、试剂 . 23 3.1.2 仪器 . 23 3.1.3 实验方法 . 24 山东大学硕士论文 3.1.3.1 纤维素含量的测定 . 24 3.1.3.2 纤维素酶活的测定 . 25 3.1.3.3 糖化方法 . 25 3.1.3.4 发酵方法 . 25 3.1.3.5 发酵产物检测方法 . 26 3.2 实验结果 . 26 3.2.1 不同方式处理木糖渣 . 26 3.2.2 木糖渣和脱木素渣的糖化比较 . 27 3.2.3 温度对糖化的影响 . 28 3.2.4 漆酶对糖化的影响 . 28 3.2.5 分步糖化发酵 . 29 3.2.6 同步糖化发酵 . 30 3.3 4. 30 #文献 .

4、 32 第四章高产菌种选育 . 33 引言 . 33 4.1 实验材料和方法 . 34 4.1.1 菌株 . 34 4.1.2 试剂 . 34 4.1.3 主要设备 . 34 4.1.4 培养基及培养方法 . 34 4.1.5 检测方法 . 36 4.1.6 自然选育 . 36 4.1.7 紫外诱变 . 36 4.1.8 低能离子注入法诱变 . 37 4.1.9 丁醇耐受性实验 . 38 4.2 实验结果 . 38 4.2.1 自然选育结果 . 38 4.2.2 不同碳源对发酵影响的结果 . 39 4.2.3 玉米浆添加量对发酵的影响 . 41 4.2.4 紫外诱变结果 . 41 4.2.5

5、低能 N+注入法诱变结果 . 43 4.2.6 丁醇耐受性实验结果 . 45 4.3 小结 . 46 参考文献 . 47 第五章发酵条件优化 . 48 弓 1 胃 . 48 5.1 实验材料及方法 . 48 5.1.1 菌种 . 48 5.1.2 试剂 . 49 5.1.3 培养基 . 49 5.1.4 主要设备 . 49 5 丄 5 检测方法 . 49 5.1.6 不同接种量实验 . 49 2 5.1.7 补料实验 . 49 5.1.8 菌种传代次数对发酵的影响 . 50 5.1.9 5L 发酵罐培养条件优化 . 50 5.2 实验结果 . 50 5.2.1 不同接种量实验结果 . 50 5

6、.2.2 补料实验结果 . 51 5.2.3 传代对发酵影响的结果 . 53 5.2.4 5L 罐培养条件对发酵结果的影响 . 54 5.2.4.1 不同初始 pH 对发酵的影响 . 54 5.2A2 温度对发酵的影响 . 54 5.2.4.3 搅拌转速对发酵的影响 . 55 5.2A4 发酵条件优化的验证 . 56 5.3 56 参考文献 . 58 第六章展望 . 59 W . 61 3 山东 大 学硕士论文 摘要 丙酮丁醇发酵作为一项传统的发酵曾经仅次于酒精发酵是世界第二大发酵。 在 上世 纪五 十年 代， 丙酮 丁醇 发 酵逐 渐被 迅速 发展 的石 油 化工 产业 所替 代。 随着 石

7、 油资 源的 日趋 短缺 ， 利 用丰 富 廉价 的生 物质 做原 料， 进 行微 生物 发酵 ， 生 产石 油 的替 代燃 料己 成为 重点 研宄 方 向。 丙酮 丁醇 发酵 其作 为 一种 将生 物质 转化 成燃 料 和化 工原 料的 重要 手段 ， 再 度 引起 人们 的广 泛青 睐。 传 统的 丙酮 丁醇 发酵 是粮 食 发酵 ， 原 料成 本太 高， 为了 降 低原 料成 本， 人们 对农 作 物辖 杆， 麸皮 以及 工业 生产中的废液废渣等原料进行了大量深入的研宄。 这些原料资源丰富， 价格低廉， 并 且利 用这 些资 源发 酵有 利于 保 护环 境。 本论 文以 工业 废 液木

8、糖母 液和 玉米 浆为 原 料， 进行 丙酮 丁醇 发酵 。 但 丙 酮丁 醇发 酵溶 剂产 量低 、 提取 成本 过高 ， 这 些严 重 制约 该产 业的 发展 ， 因 此通 过 高产 菌株 的选 育、 发酵 工 艺优 化等 手段 来提 高溶 剂产量是十分必要的。 本论文的主要研宄内容： (1) 产物检测方法的建立 为 丙 酮丁 醇 发 酵产 物 检 测 建立 了 一 种快 速 有 效 的方 法 ， 采用 GC1690 气 相 色 谱 仪 、 AC-20 毛 细 管 色 谱 柱 和 FID( 氢 火 焰 离 子 ) 检 测 器 对 发 酵 产 物 进 行 检 测 。 检 测 条 件 经 过

9、优 化 后 ， 将 ABE 的 检 测 时 间 缩 短 到 4.2min, 若 需 要 检 测 乙 酸 和 丁 酸 两种副产物的含量，每个样品的检测时间是 8.5min。 以 异 丁 醇 为内 标 物 ， 以 峰 面 积内 标 法 ， 对发 酵 产物 进 行 定 量分 析 。 绘 制 出 每 种 溶 剂 的 回 归 曲 线 ， 5 种 溶 剂 的 回 归 方 程 相 关 系 数 R2 都 大 于 0.99, 表 明 As/Ai 与 溶 剂 浓 度 的 线 性 相 关 程 度 好 。 重 复 性 和 稳 定 性 实 验 表 明 溶 剂 检 测 结 果 的 相 对 标 准 偏 差 RSD 都 很

10、小 。 说 明 测 定方 法 和仪 器 条 件 能够 快 速 、 准 确 的 检测 发 酵样 品 ， 为 筛 选高 产 菌株 和 大规 模 发酵 检 测提 供 保障。 (2) 木糖渣的糖化和发酵 对木糖渣进行预处理， 酸碱处理后的糖化效果不如自来水处理的效果好。 温 度 对纤 维素 酶的 酶 解反 应有 很大 影 响， 在 37C 、 45C 和 55C 条 件下 进行 糖化 反 应，最终确定 45C 为最佳糖化温度。糖化体系中添加漆酶会抑制纤维素酶的催 山东大学硕士论文 化反应， 降低纤维素转 化率。 进行分步糖化发酵和同步糖化发酵， 结 果表明同步 糖化发酵溶剂产量更高。 (3) 高产菌株

11、的选育 对拜氏梭菌 ATCC55025 (C/oy/nW/w/w 进行自然选育挑选出产量 较 高 的 菌 株 L-1 ， 并 对 该 菌 株 进 行 碳 源 和 氮 源 实 验 ， 确 定 以 10% 木 糖 母 液 和 3.5% 玉米衆为发酵培养基， 不添加任何其他成分， 降低了培养基的成本， 简化了培养 基 的 组 成 。 以 L-1 为 出 发 菌 株 ， 对 其 进 行 紫 外 诱 变 和 低 能 矿 注 入 诱 变 ， 以 10% 木 糖 母 液 和 3.5% 玉 米 浆 为 发 酵 培 养 对 诱 变 菌 株 进 行 厌 氧 瓶 筛 选 。 诱 变 后 溶 剂 产 量有了大幅度提高

12、。 丁 醇对细胞有很大的毒害作用， 诱变后的菌株最 高可以耐受 llg/ L 的丁醇。 (4) 发酵工艺的优化 在 厌 氧 瓶 中 进 行 接 种 量 和 补 料 实 验 ， 确 定 最 佳 接 种 量 为 5% ， 补 料 时 间 是 36 小时， 补料量是 15 g/L。 菌种在液体中连续扩大培养， 负变异很快， 溶剂产量骤 减。 菌种在固体中传代 4 次， 发酵产量没有很大 影响， 在固体传代中菌种性能稳 定。 在 5L 罐 中 进 行 发 酵 ， 以 总 溶 剂 产 量 作 为 主 要 参 考 指 标 ， 确 定 了 最 佳 发 酵 工 艺条件 : 初始 PH6.0 ， 温度 37C，

13、 搅拌转速 lOOrpm。 为了验证以上优化结果， 在 优化条件下发酵，总溶剂产量达 21.138 g/L。 关键词 ： 丙酮；丁醇 ； 丙酮丁醇梭菌；诱变育种 ； 工艺优化 2 2 山东大学硕士论文 Abstract Acetone -butanol fermentation is a traditional fermentation, once is fermentation of the worlds second largest, after alcoholic fermentation. In the 1950s, the acetone -butanol fermentation

14、is gradually being replaced by the rapid development petrochemical industry. With the increasingly tense of the oil resources, that microbial fermentation with the use of biomass as feedstock can replace petroleum fUels has become a research focus. Acetone -butanol fermentation as an important means

15、 of converting biomass into chemical raw materials and fuel is re- attracted wide attention. The traditional Acetone -butanol fermentation is grain fermentation, raw material costs are too high , in order to reduce the cost of raw materials, People a lot further study on the fermentation raw materia

16、l including crop straw, bran and industrial production waste ,etc. These rich resources of raw materials are low prices, and fermentation used of these resources is in favor of protecting the environment In this paper, acetone-butanol fermentation produces ABE from industrial waste xylose mother liquor and com steep liquor, but acetone-butanol ferment