流式细胞术讲义.ppt

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1、流式细胞术的血液学应用流式细胞术的血液学应用北京协和医院血液科北京协和医院血液科汪汪 玄玄流式细胞术的概念流式细胞术的概念l 流式细胞术（流式细胞术（Flow cytometry；FCM）是集计算）是集计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现代细胞分析技术，它以流式细胞仪（代细胞分析技术，它以流式细胞仪（Flow cytometer）为工具，在单细胞水平上对大量细胞进）为工具，在单细胞水平上对大量细胞进行高速（每秒计数可达行高速（每秒计数可达1000100

2、00个细胞）、准确、个细胞）、准确、多参数的定量分析或分选（纯度可达多参数的定量分析或分选（纯度可达99%以上），以上），已成为现代骨髓血细胞学研究中最先进的分析技术。已成为现代骨髓血细胞学研究中最先进的分析技术。流式细胞术与流式细胞术与PNH的诊断的诊断原原 理理l 阵发性睡眠性血红蛋白尿症（阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是）是一种获得性基因突变所致的克隆性疾病，一种获得性基因突变所致的克隆性疾病，其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂锚其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂锚（GPIanchor）连接蛋白如）连接蛋白如CD59,CD55等表达明显减低或缺乏，导致对补体的敏等表达明显减低或缺乏，导致对补体的

3、敏感性增强而产生溶血性贫血。感性增强而产生溶血性贫血。样本要求：样本要求：vEDTA抗凝血或骨髓抗凝血或骨髓3mlv每天上午送检每天上午送检v收费收费：CD55/CD59 280元元v CD59 140元元临临 床床 诊诊 断断 值值vCD59阳性的红细胞大于等于阳性的红细胞大于等于95%vCD59阳性的中性粒细胞大于阳性的中性粒细胞大于90%流式细胞术与流式细胞术与白血病免疫分型白血病免疫分型免疫分型原理免疫分型原理l 流式细胞术（流式细胞术（FCM）白血病免疫分型是利用荧光）白血病免疫分型是利用荧光染料标记的单克隆抗体（染料标记的单克隆抗体（McAb）检测相应抗原，经）检测相应抗原，经过多

4、参数分析，测定白血病细胞的细胞膜、细胞浆过多参数分析，测定白血病细胞的细胞膜、细胞浆和细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所和细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。属细胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表分析白血病免疫表型时测量细胞数量一般是在型时测量细胞数量一般是在1000050000个细胞之间，个细胞之间，而且快速、特异、准确、重复性好，能区分细胞的而且快速、特异、准确、重复性好，能区分细胞的系列，划分其分化、发育阶段等，对白血病的诊断系列，划分其分化、发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机制研究与分型、治疗方案选择与预后判断

5、、发病机制研究等有重要价值。等有重要价值。样本要求：样本要求：肝素抗凝骨髓肝素抗凝骨髓3ml(或外周血或外周血)每天上午送检每天上午送检收费：收费：70元元/每个单抗每个单抗(临床常规检测临床常规检测12个单个单抗抗)v干干/祖细胞标志：祖细胞标志：CD34、CA133v髓系标志：髓系标志：CD33、CD13、CD11b、CD15、MPOvB细胞相关标志：细胞相关标志：CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、CyIg、SmIgvT细胞相关标志：细胞相关标志：CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义常用白血病免疫分型荧

6、光素标记单克隆抗体组合及其意义常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义管号管号三色标记三色标记McAb染色细胞及目的染色细胞及目的1MouseIgG1/MouseIgG1/CD45 PerCP阴性对照及设门阴性对照及设门2CD5 FITC/CD7 PE/CD45 PerCPT淋巴系细胞、部分早期髓系细胞淋巴系细胞、部分早期髓系细胞3CD10 FITC/CD19 PE/CD45 PerCPB淋巴系细胞淋巴系细胞4Anti-HLA-DA FITC/CD13 PE/CD45 PerCP髓系细胞、髓系细胞、B淋巴系细胞、部分淋巴系细胞、部分T

7、淋淋巴系细胞巴系细胞5CD34 FITC/CD38 PE/CD45 PerCP反映细胞分化程度反映细胞分化程度6CD14 FITC/CD33 PE/CD45 PerCP髓系细胞和单核细胞髓系细胞和单核细胞7CD20 FITC/CD22 PE/CD45 PerCPB淋巴系细胞及其分化程度淋巴系细胞及其分化程度8CD8 FITC/CD4 PE/CD45 PerCPT淋巴系细胞及其分化程度淋巴系细胞及其分化程度9CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCPT淋巴系细胞、淋巴系细胞、NK细胞细胞10CD36 FITC/GP-A PE/CD45 PerCP幼红细胞幼红细胞11CD61 F

8、ITC/CD41 PE/CD45 PerCP巨核细胞巨核细胞B-ALLT-ALLAMLCD10+CD19+CD22c/m+CD3c/m+CD5+CD7+CD13+CD33+MPO+AML AML 免疫分型免疫分型FAB/CD34CD33HLA-DR CD13CD14CD15CD11b其它其它M1M2M3CD38CD9M4M5M6CD71GP-AM7CD41CD61T-ALLT-ALL免疫分型免疫分型CD2 CD3 CD5CD7CD4CD8TdT早期早期T-ALL+前前TALL+T-ALL+B-ALLB-ALL免疫分型免疫分型HLA-DRCD19CD10CD20CD22cIgMmIgMTdT早早

9、B前体前体ALL+普通型普通型+前前B-ALL+B-ALL+FCM-IM诊断混合型白血病诊断混合型白血病l流式细胞术测定发现的双系列或多系列表达的结果较多，流式细胞术测定发现的双系列或多系列表达的结果较多，但双表型白血病不一定就是混合型，理由如下：但双表型白血病不一定就是混合型，理由如下：l混合型白血病诊断：混合型白血病诊断：应根据形态、免疫、遗传、分子生物应根据形态、免疫、遗传、分子生物学等综合判断，属双系列（双克隆）？双表型（单克隆）学等综合判断，属双系列（双克隆）？双表型（单克隆）？系列转换型？系列转换型？l需考虑到抗原需考虑到抗原/单抗的多向性：单抗的多向性：lCD4、CD7、CD10

10、、CD38、CD56l正常血细胞随分化成熟，各系列血细胞的免疫标志特性逐正常血细胞随分化成熟，各系列血细胞的免疫标志特性逐步规律化：步规律化：l白血病细胞的分化发育却丧失严格的规律性（白血病细胞的分化发育却丧失严格的规律性（lineage infidelity）与免疫表型的阶段性（）与免疫表型的阶段性（differentiation asynchrony），因而出现异常抗原表达，或过高或过低或），因而出现异常抗原表达，或过高或过低或不表达或交叉系列表达。不表达或交叉系列表达。设门方案设门方案u采用采用CD45/SSC设门法设门法（优于（优于FSC/SSC设门法）设门法）uCD45其其表达程度在

11、不表达程度在不同细胞各异。淋巴细胞同细胞各异。淋巴细胞单核细胞单核细胞成熟粒细胞成熟粒细胞原原/幼细胞，而红细胞幼细胞，而红细胞不表达。不表达。uSSC在成熟粒细胞在成熟粒细胞单单核细胞核细胞原原/幼细胞幼细胞淋淋巴细胞巴细胞红细胞。红细胞。临床原临床原/幼细胞群定量幼细胞群定量按照新的按照新的WHO分型标准，对初发病者，分型标准，对初发病者，原原/幼细胞占总细胞数幼细胞占总细胞数20%以上即可判为以上即可判为白血病。白血病。对于临床原对于临床原/幼细胞群定量应以原幼细胞群定量应以原/幼细幼细胞群的细胞数为分母。胞群的细胞数为分母。对于临床原对于临床原/幼细胞群定性比定量更重要。幼细胞群定性比

12、定量更重要。白血病免疫分型病例分析白血病免疫分型病例分析l病例病例1l梁丽琴梁丽琴 女性女性 24岁岁l异常表型中异常表型中:lCD10+.CD34+.lCD22+.CD38+.lCD19+.HLA-DR+l结论：表型符合结论：表型符合Pre-B-ALL白血病免疫分型病例分析白血病免疫分型病例分析l病例病例2l王丙午王丙午 男性男性 68岁岁l异常表型中异常表型中:lCD33+.CD13+.lCD15+.CD11b+.lHLA-DR+.lCD34+.CD19+l结论：表型符合结论：表型符合AML-M2白血病免疫分型病例分析白血病免疫分型病例分析l病例病例3l冯亮冯亮 男性男性 33岁岁l异常表

13、型中异常表型中:lCD34+.CD10+.lCD22+.CD19+.CD33+.CD13+.lCD15+.HLA-DR+l结论：表型符合双结论：表型符合双表型白血病表型白血病流式细胞术与流式细胞术与造血干造血干/祖细胞计数祖细胞计数原原 理理 造血干造血干/祖细胞存在于骨髓和外周血中，祖细胞存在于骨髓和外周血中，形态与淋巴细胞相似，用普通形态学方法形态与淋巴细胞相似，用普通形态学方法难于识别。但根据造血干难于识别。但根据造血干/祖细胞的特征，祖细胞的特征，可用可用FCM多参数分析血液、骨髓和浓缩白多参数分析血液、骨髓和浓缩白细胞悬液中造血干细胞悬液中造血干/祖细胞的数量，对血液祖细胞的数量，对血液病、恶性肿瘤、基因异常等疾患的造血干病、恶性肿瘤、基因异常等疾患的造血干/祖细胞移植治疗有十分重要的意义。祖细胞移植治疗有十分重要的意义。流式细胞术其它应用流式细胞术其它应用l血小板疾病的诊断血小板疾病的诊断lDNA倍体与细胞周期分析倍体与细胞周期分析l应用流式细胞术检测微小残留病变应用流式细胞术检测微小残留病变l网织红细胞分析网织红细胞分析l细胞免疫功能分析细胞免疫功能分析