生物大分子的制备2蛋白质(酶)的分离纯化.ppt

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1、1 生物大分子的制备生物大分子的制备2 蛋白质（酶）的分离纯化蛋白质（酶）的分离纯化第四章第四章 样品的全息制备样品的全息制备1 生物大分子的制备生物大分子的制备1.1 概述概述1.2 生物大分子制备的前处理生物大分子制备的前处理1.3 生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化1.4 样品的保存样品的保存1.1 概述概述在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大

2、分子的制备问题，首先解决生物大分子的制备问题，如果没有能够达到如果没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工足够纯度的生物大分子的制备工作作为前为前提提，结构与功能的研究就无从结构与功能的研究就无从谈起谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。生物材料的生物材料的组成组成极其极其复杂复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。，常常包含有数百种乃至几千种化合物。许多生物大分子在生物材料中的许多生物大分子在生物材料中的含量极微含量极微，分离纯化的，分离纯化的步骤步骤繁多繁多、流程长流程长。许多生物大分子一旦离开了生物体内的

3、环境时就极易失活，因此分离过程许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何中如何防止防止其其失活失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。，就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等值、离子强度等各种参数各种参数对溶液中各种组成对溶液中各种组成的综合影响的综合影响，很难准确估，很难准确估计和判断。计和判断。生物大分子中的各种具体物质的组成生物大分子中的各种具体物质的组成比例不同比例不同。与化学产品的分离制备相比较，生物大分子与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有

4、以下主要特点：的制备有以下主要特点：生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：确定要制备的生物大分子的确定要制备的生物大分子的目的目的和和要求要求，是进行科研、开发还是要发现新，是进行科研、开发还是要发现新的物质。的物质。建立相应的可靠的分析建立相应的可靠的分析测定方法测定方法，这是制备生物大分子的关键。，这是制备生物大分子的关键。通过通过文献调研文献调研和和预备性实验预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。化学性质。生物材料的生物材料的破碎破碎和和预处理预处理。分离纯化分离纯化方案方案的选择和探索，这是最困难的过程。的

5、选择和探索，这是最困难的过程。生物大分子制备物的均一性生物大分子制备物的均一性（即纯度即纯度）的的鉴定鉴定，要求达到一维电泳一条带，二，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。和毛细管电泳都是一个峰。产物的产物的浓缩浓缩、干燥干燥和和保存保存。要了解生物大分子的物理、化学性质主要有：要了解生物大分子的物理、化学性质主要有：在水和各种有机溶剂中的溶解性。在水和各种有机溶剂中的溶解性。在不同温度、在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。分子的稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时

6、的稳定性。各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带电情况、在电场中的行为、电情况、在电场中的行为、离心沉降时的表离心沉降时的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。稳定性和对各种化学试剂的稳定性。对其他生物分子的特殊亲和力。对其他生物分子的特殊亲和力。生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形

7、状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂有机溶剂沉淀、层析和结晶等；沉淀、层析和结晶等；将混合物置于某一物相将混合物置于某一物相（大多数是液相大多数是液相）中中，通过物理力场的作用通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的区域，从而达到分离的目的

8、，如电泳如电泳、离心离心、超滤等。超滤等。目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。电泳、层析和高速与超速离心。1.2 生物大分子制备的前处理生物大分子制备的前处理1.2.1 生物材料的选择生物材料的选择制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液

9、分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。1.2.2 细胞的破碎细胞的破碎不不同同的的生生物物体体或或同同一一生生物物体体的的不不同同部部位位的的组组织织，其其细细胞胞破破碎碎的的难难易易不不一一，使使用用的的方方法法也也不不相相同同，如如动动物物脏脏器器的的细细胞胞膜膜较较脆脆弱弱，容容易易破破碎碎，植植物物和和微微生生物物由由于于具具有有较较坚坚固固的的纤纤维维素素、半半纤纤维维素素组组成成的的细细胞胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。壁，要采取专门的细胞破碎方法。(1)机械法：机械法：研磨：研磨：将剪碎的动物组织或其它生物材料置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨成匀浆

10、。组织捣碎器：组织捣碎器：这是一种较剧烈的细胞破碎方法，通常可先用家用食品加工机械将组织打碎，然后再用1000020000r/min的内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎。(2)物理法：物理法：反复冻融法：反复冻融法：将待破碎的细胞冷至-15到-20，然后放于室温（或40）迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。超声波处理法：超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。压榨法：压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000105 Pa2000105 Pa 的高压下使细胞悬液

11、通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。冷热交替法：冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。(3)化学与生物化学方法：化学与生物化学方法：自溶法：自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的 pH 和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。溶胀法：溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。酶解法：酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和

12、酯酶等，于37，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。有机溶剂处理法：有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基磺酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。1.2.3 生物大分子的提取生物大分子的提取“提提取取”是是在在分分离离纯纯化化之之前前将将经经过过预预处处理理或或破破碎碎的的细细胞胞置置于于溶溶剂剂中中，使使被被分分离离的的生生物物大大分分子子充充分分地地释释放放到到溶溶剂剂中中，并并尽尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。通常：通常：极性物质易溶于极性

13、溶剂极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大；温度升高，溶解度加大；远离等电点的远离等电点的pH值，溶解度增加。值，溶解度增加。影响提取的因素主要有：影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；由固相扩散到液相的难易；溶剂的溶剂的pH值和提取时间等。值和提取时间等。注意：提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和注意：提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加

14、和保持其生物活性。保持其生物活性。由由于于生生物物体体的的组组成成成成分分是是如如此此复复杂杂，数数千千种种乃乃至至上上万万种种生生物物分分子子又又处处于于同同一一体体系系中中，因因此此不不可可能能有有一一个个适适合合于于各各类类分分子子的的固固定定的的分分离离程程序序，但但多多数数分分离离工工作关键部分的基本手段是相同的。作关键部分的基本手段是相同的。为为了了避避免免盲盲目目性性，节节省省实实验验探探索索时时间间，要要认认真真参参考和借鉴前人的经验，少走弯路。考和借鉴前人的经验，少走弯路。常常用用的的分分离离纯纯化化方方法法和和技技术术有有：沉沉淀淀法法（包包括括：盐盐析析、有有机机溶溶剂剂

15、沉沉淀淀、选选择择性性沉沉淀淀等等）、离离心心、吸吸附附层层析析、凝凝胶胶过过滤滤层层析析、离离子子交交换换层层析析、亲亲和和层层析析、快快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。1.3 生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化沉沉淀淀是是溶溶液液中中的的溶溶质质由由液液相相变变成成固固相相而而析析出出的的过过程程。沉沉淀淀法法（即即溶溶解解度度法法）操操作作简简便便，成成本本低低廉廉，不不仅仅适适用用于于实实验验室室中中，也也可可用用于于某某些些生生产产目目的的的的制制备备过过程程，是是分分离离纯纯化化生生物物大大分分子子，特特别别是是制制备备蛋蛋白白

16、质质和和酶酶时时最最常常用用的的方方法法。通通过过沉沉淀淀，将将目目的的生生物物大大分分子子转转入入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。沉淀法沉淀法 的基本原理是根据不同物质在溶剂中的的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及及结构有

17、关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的改变溶液的pH值值、离子强度和极性都会使溶质的溶解离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。度产生明显的改变。1.3.1 沉淀法沉淀法在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析技术要用到透析技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品液称为留在透析袋内未透析出的样品液称为“保留液保留液”，袋袋（膜膜）外的溶液称为外的溶液称为“渗出液渗出液”或或“透析液

18、透析液”。截。截留分子量留分子量(MwCO)通常为通常为10KD左右。左右。用用 1 BaCl2 检查检查(NH4)2SO4，用，用1AgNO3 检查检查NaCl、KCl等。等。1.3.2 透析透析超超过过滤滤即即超超滤滤，是是一一种种加加压压膜膜分分离离技技术术，即即在在一一定定的的压压力力下下，使使小小分分子子溶溶质质和和溶溶剂剂穿穿过过一一定定孔孔径径的的特特制制的的薄薄膜膜，而而使使大大分分子子溶溶质质不不能能透透过过，留留在在膜膜的的一一边边，从从而而使使大大分分子子物物质质得得到到了部分的纯化。了部分的纯化。超超滤滤可可广广泛泛用用于于含含有有各各种种小小分分子子溶溶质质的的各各种

19、种生生物物大大分分子子（如如蛋蛋白白质质、酶酶、核核酸酸等等）的的浓浓缩、分离和纯化。缩、分离和纯化。1.3.3 超滤超滤超滤工作原理示意图超滤工作原理示意图受压的生物大分子和小分子溶液浓缩的生物大分子小分子溶液冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。大分子容易失活，

20、通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。冰冻干燥是先将生物大分子的冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明，见下图：原理可用溶剂的三相点相图来说明，见下图：1.3.4 冰冻干燥冰冻干燥三相点相图三相点相图1.3.5 分离纯化方法的选择分离纯化方法的选择制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：以以分子大小和形态差异分子大小和形态差异为依据的方法：差为依据的方法：差速离心速离心、区带离心区带离心、超滤超滤、透析和凝胶过滤

21、透析和凝胶过滤等等。以以溶解度差异溶解度差异为依据的方法：盐析、萃取、为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。分配层析、选择性沉淀和结晶等。以以电荷差异电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等吸附层析和离子交换层析等。以以生物学功能专一性生物学功能专一性为依据的方法：亲和为依据的方法：亲和层析等。层析等。1.4 样品的保存样品的保存生物大分子制成品的正确保存极为重要，生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工

22、作化为乌有，性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。损失惨重，全功尽弃。空气空气：空气空气的影响主要是潮解、微生：空气空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。物污染和自动氧化。温度温度：每种生物大分子都有其稳定的温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高范围，温度升高10，氧化反应约加快数，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加倍，酶促反应增加13倍。倍。影响生物大分子样品保存的主要因素有：影响生物大分子样品保存的主要因素有：水份水份：样品本身所带的水份和由空气中吸收的：样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。水份。水可以参加水解、酶

23、解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。加速氧化、聚合、离解和霉变。光线光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，影响最大，样品受光催化的反应外线能量大，影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保存。样品通常都要避光保存。样品的样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的：保存液态样品时注意其稳定的pH范围，正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类范围，正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓

24、度十分重要。和浓度十分重要。时间时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。样品必须写明日期，定期检查和处理。2 蛋白质（酶）的蛋白质（酶）的分离纯化分离纯化2.1 酶活性测定酶活性测定2.2 酶溶液制备酶溶液制备2.3 酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程2.4 根据分子大小轻重建立的分离纯化方法根据分子大小轻重建立的分离纯化方法2.5 调节溶解度的分离方法调节溶解度的分离方法2.6 按电荷的正负性设计的分离方法按电荷的正负性设计的分离方法

25、2.7 根据亲和作用建立的纯化方法根据亲和作用建立的纯化方法2.8 根据稳定性的差异建立的分离纯化方法根据稳定性的差异建立的分离纯化方法2.9 蛋白质（酶）的高效液相色谱分离分析法蛋白质（酶）的高效液相色谱分离分析法酶的分离提纯包括三个基本环节：酶的分离提纯包括三个基本环节：抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；制剂：即将酶制成各种剂型。制剂：即将酶制成各种剂型。(1)要注意防止酶的变性失活要注意防止酶的变性失活.(2)酶的分离纯化的目的是将酶以

26、外的所有杂质尽可能的除去，酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此因此，在不破坏所需酶的条件下在不破坏所需酶的条件下，可使用各种可使用各种“激烈激烈”的手段的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提质存在时酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。供了更多条件和方法可供采用。(3)酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供适当方法和条件提供 直接依据直接

27、依据。在工作过程中在工作过程中，从原料开始从原料开始每步都必须检测酶活性一个好的方法和措施会使酶的纯度每步都必须检测酶活性一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:2.1 酶活性测定酶活性测定酶活力酶活力(Enzyme Activity)也称酶活性，指也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可

28、缺少的指标。酶活力是用在一定条件一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反应速度酶反应速度（指初速度指初速度）可用单位时间内单位可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，其单位为其单位为mol/s。2.1.1 酶的活力单位酶的活力单位2.1.2 摩尔催化活性摩尔催化活性/分子活性和转化率分子活性和转化率（催化催化中心活力中心活力）摩尔催化活性摩尔催化活性(Molar Catalytic Activity)表示在表示在单单位位时间时间内，内，酶酶分子中每个活性

29、中心分子中每个活性中心转换转换的分子数目。的分子数目。根据米氏方程：根据米氏方程：Vmax=K0E K0=Vmax/EK0即为转换率即为转换率(也用也用Kcat表示表示)，如果每一个酶分子只有一个催如果每一个酶分子只有一个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性，如果一个酶分化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性，如果一个酶分子有几个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以子有几个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n。每种酶的转换率不同，下表列出了几种酶的转换率：每种酶的转换率不同，下表列出了几种酶的转换率：酶酶转换率转换率(1/s)酶酶转换率转换率(1/s)碳酸酐酶碳酸

30、酐酶 600,000凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶 100乙酰胆碱脂酶乙酰胆碱脂酶 25,000DNA聚合酶聚合酶 5青霉素酶青霉素酶 2,000Trp合成酶合成酶 2乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 1,000溶菌酶溶菌酶 0.52.1.3 比活力比活力 比活力比活力(性性)(Specific Activity)是酶纯度的量度，指单位重量是酶纯度的量度，指单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用 IU/mg 蛋白质来表蛋白质来表示。一示。一 般来说，酶的比活力越高，酶越纯。般来说，酶的比活力越高，酶越纯。2.1.4 酶活力的测定方法酶活力的测定方法酶活力与底物浓度、酶浓

31、度、酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。终止反应法或连续反应法。2.1.4.1 终止反应法终止反应法(Stopped Method)终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反应物的消耗量，或产物的形物或产物，予以分离，再确定反应物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。成量，算出酶活性。使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也使酶停止作用常

32、用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用可用 SDS 使酶失活或加热使酶变性等。使酶失活或加热使酶变性等。产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。酶法酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：葡萄糖葡萄糖+O2 葡萄糖内脂葡萄糖内脂+H2O2欲测定葡萄糖内脂和欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧均较困难，可在

33、该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应化物酶和木酚，使发生下列反应:由于由于4-甲氧联酚在甲氧联酚在 435nm 波长处有光吸收峰，因此、波长处有光吸收峰，因此、只要测定只要测定 A435，就可知，就可知 4-甲氧联酚的量，可得甲氧联酚的量，可得H2O2的量，的量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶过氧化物酶)必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在也应在 5 倍以上。倍以上。偶联法中偶联酶对反应速度的影响偶联法中偶联酶对反应速度的影响再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）

34、：再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖葡萄糖 ATP 葡萄糖葡萄糖-6-P其偶联其偶联-指示剂为葡萄糖指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶 葡萄糖葡萄糖-6-P+NADP+6-P-葡萄糖酸葡萄糖酸+NADPH+H+这时即可测定这时即可测定 340nm 处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性。糖激酶）的活性。酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。(2)化学法化学法化学法化学法是利用化学反是利用化学反应应使使产产物物转变转变成一个可用某种物理方成一个可用某种物理方法法测测出出NH3和和C

35、O2，然后用比色法、滴定法、气体体，然后用比色法、滴定法、气体体积积量度法等量度法等方法方法测测出出酶酶活性。活性。化学分析法的化学分析法的优点优点是是：不需要特殊不需要特殊仪仪器器，一般有恒温水浴一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色滴定管、离心机及比色计计或分光光度或分光光度计计即可即可进进行工作。行工作。对对于于绝绝大多数的大多数的酶酶，都可根据底物及，都可根据底物及产产物的化学性物的化学性质质，设计设计具体的具体的测测定方法，定方法，应应用范用范围较围较广。广。缺点缺点是：由于是：由于测测定定结结果是根据果是根据间间隔一定隔一定时间时间取取样样所得，取所得，取样过样过多，多，则总则总的工

36、作量的工作量较较大，取大，取样过样过少，少，则则不能得到不能得到酶酶反反应过应过程的全貌，并且在程的全貌，并且在实际实际操作操作过过程中，取程中，取样样及停止及停止时间时间不容易准不容易准确控制，因此确控制，因此对对于反于反应较应较快的快的酶酶反反应应，结结果不果不够够准确。准确。目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、停目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排成程止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分

37、析法必须作出新的评价。分析法必须作出新的评价。放射性化学法放射性化学法是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性。从而计算出酶的活性。优点优点是：灵敏，可直接是：灵敏，可直接应应用于用于酶酶活力活力测测定，也可用于体定，也可用于体内内酶酶活性活性测测定，特定，特别别适用于低适用于低浓浓度的度的酶酶和底物的和底物的测测定。定。缺点缺点是：操作是：操作烦琐烦琐，样样品需要分离，反品需要分离，反应过应过程无法程无法连续连续跟踪，并且同位素跟踪，并且同位素对对人体有人体有损伤损伤作用。此外，作用。此外，辐辐射淬射淬灭灭会引会引

38、起起测测定定误误差，如差，如 3H 发发射的射射的射线线很弱，甚至会被很弱，甚至会被纸纸吸收。吸收。2.1.4.2 连续反应法连续反应法(Continuous Method)连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法使用检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定

39、。酶还不能用该法测定。一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。几种连续法的例子几种连续法的例子 酶酶 反应反应 观测方法观测方法乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸乳酸+NAD+丙酮酸丙酮酸+NADH+H+丙酮酸丙酮酸+NADH 乳酸乳酸+NAD+340nm波长处有波

40、长处有NADH形成形成340nm波长处有波长处有NADH减少减少糖苷酶糖苷酶(Glycosidase)Methylumbelvifery+glucoside 糖糖+Methylumbeviferone甲基伞型酮甲基伞型酮(Methylumbelviferone)发出发出荧光荧光内纤维素酶内纤维素酶纤维素纤维素 低聚葡萄糖低聚葡萄糖黏度下降黏度下降己糖激酶己糖激酶葡萄糖葡萄糖+mgATP 6-P-葡萄糖葡萄糖+ADP+H+pH降低，用降低，用pH计计非专一性磷脂酶非专一性磷脂酶405nm波长有硝基苯酚生成波长有硝基苯酚生成 偶联的连续法偶联的连续法是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接

41、是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反或间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必须在酶反应相同条件应必须在酶反应相同条件(pH、温度等、温度等)下进行，且加入的下进行，且加入的指示酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。指示酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。如醛缩酶如醛缩酶(Aldolase)催化催化1,6-二磷酸果糖生成二磷酸果糖生成3-P-甘油醛甘油醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出，用磷酸和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出，用磷酸丙糖异构酶丙糖异构酶(Triose Phosphate

42、Isomerase)作偶联酶作偶联酶(Coupling Enzyme)、甘油、甘油-1-P-脱氢酶脱氢酶(Glycerol-1-Phosphate Dehydrogenase)作指示酶，依据作指示酶，依据 NADH 变成变成 NAD+的光谱的光谱变化来算出醛缩酶活性。变化来算出醛缩酶活性。如下图：如下图：醛缩酶以醛缩酶以1-P-甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定酶活性法甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定酶活性法2.1.4.3 酶活力测定中应注意的几个问题酶活力测定中应注意的几个问题酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进行的，但酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进行的，但酶反应要比一般化学反应

43、复杂得多，除了反应物以外，还有酶这酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除了必须遵照所用分析化样一个决定性因素。因此，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的学方法的操作要求外，又有它的些特点。些特点。首先，测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底首先，测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗量在物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗量在 5以内，以内，或产物形成量占总产物量的或产物形成量占总产物量的15以下时的速度。以下时的速度。其次其次，底物浓度底物浓度、辅因子

44、的浓度必须大于酶浓度辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱和即过饱和)，否则，底物浓度本身是一个限制因子，此时的反应速度是两个因否则，底物浓度本身是一个限制因子，此时的反应速度是两个因素的复变函数。素的复变函数。第三，反应必须在酶的最适条件（如最适温度、第三，反应必须在酶的最适条件（如最适温度、pH 和离子强和离子强度等）下进行度等）下进行。此外此外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度抑制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓度对酶浓度(E)作图，应得一条通过原点的直线，即作图，应得一条通过原点的直线

45、，即 v 为为(E)的线性函数。的线性函数。初速度的确定是在底物浓度初速度的确定是在底物浓度S足够的条件下，通足够的条件下，通过过E的变化来确定，如下图。由图可见，当分别采用的变化来确定，如下图。由图可见，当分别采用不同的酶浓度时，测得反应量对时间的变化。不同的酶浓度时，测得反应量对时间的变化。求得几个适当时间的反应速度（反应量求得几个适当时间的反应速度（反应量/反应时间）反应时间）。再用反应速度对酶量作图。再用反应速度对酶量作图。由图可见，其中，。由图可见，其中，5min时测得的数据可用于求出初速度，若以时测得的数据可用于求出初速度，若以10min以上数以上数据时，测得的酶活性偏低。据时，测

46、得的酶活性偏低。2.1.4.4 酶活性测定实例酶活性测定实例这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶，催化反应为这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶，催化反应为:O2+O2+2H+H2O2+O2由于由于 O2 在溶液中极不稳定，给酶活性测定带来许多不便。在溶液中极不稳定，给酶活性测定带来许多不便。目前已有根据目前已有根据 O2的物理性质测定的物理性质测定 O2的歧化量，从而直接测的歧化量，从而直接测定定 SOD 活力的方法活力的方法。如电子顺磁共振波谱法如电子顺磁共振波谱法(ESR)、核磁共核磁共振法振法(NMR)、紫外分光光度法等紫外分光光度法等。这里只介绍以邻苯三酚法这里只介绍以邻苯三酚法测定酶活

47、力为例的化学法。测定酶活力为例的化学法。邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生的超氧阴邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生的超氧阴离子自由基可通过自氧化速率来表示。加入离子自由基可通过自氧化速率来表示。加入SOD，可抑制自，可抑制自氧化速率，由此计算出酶活力。氧化速率，由此计算出酶活力。SOD单位定义为：一定的实单位定义为：一定的实验条件下（见操作），抑制率达到验条件下（见操作），抑制率达到50%时的时的SOD的浓度为的浓度为 1 个酶单位。个酶单位。(1)超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活力测定活力测定单位体积活力单位体积活力(u/ml)=(0.07-样品速率样品速率)/0.07

48、100%)/50%反应液总体积反应液总体积(反应液稀释倍数反应液稀释倍数/样液体积样液体积)总活力总活力=单位体积活力单位体积活力(u/ml)原液总体积原液总体积操作：在试管中加入操作：在试管中加入pH8.2的的50mmol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液4.5ml，于于25保温保温20min，然后加入预热的，然后加入预热的45mmol/L连苯三酚连苯三酚溶液（对照管用溶液（对照管用10mol/L HCl代替）代替）10l，迅速摇匀倒入，迅速摇匀倒入1cm比色杯，每隔比色杯，每隔 30s 在在 325nm 处测一次光吸收值，即处测一次光吸收值，即可测定出连苯三酚的自氧化速率，一般要求自氧化速

49、率可测定出连苯三酚的自氧化速率，一般要求自氧化速率控制在控制在 0.070 OD/min。测酶或粗酶液活力时测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不同方法同测自氧化速率相同，所不同的仅是在加入缓冲液后再加入的仅是在加入缓冲液后再加入 10l 待测样品即可。酶活力计算待测样品即可。酶活力计算方法：方法：用这种方法测酶活力时，应注意由于连苯三酚和被测样用这种方法测酶活力时，应注意由于连苯三酚和被测样液的加入量只有液的加入量只有10l，在整个反应系统中可忽略不计，在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体积按故反应液总体积按4.5计算。计算。(2)糖苷酶的活力测定糖苷酶的活力测定糖苷酶的活力测

50、定多用人工底物，如对硝基苯基糖苷在糖苷酶的活力测定多用人工底物，如对硝基苯基糖苷在糖苷水解酶的作用下，糖苷键断裂，产生等当量的糖和对硝糖苷水解酶的作用下，糖苷键断裂，产生等当量的糖和对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下于基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下于400nm处有特异吸收，处有特异吸收，从对硝基苯酚对光吸收的标准曲线即可计算出糖苷水解酶的从对硝基苯酚对光吸收的标准曲线即可计算出糖苷水解酶的活性。活性。操作：试管中加入操作：试管中加入 5mmol/L 对硝基苯基糖苷对硝基苯基糖苷200ul，pH4.6的的0.2mol/L 磷酸氢二钠和磷酸氢二钠和 0.1mol/L 柠檬酸配制的缓冲液柠檬酸配制的