生化实验技术讲座.ppt

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1、生物化学实验技术理论讲座生物化学实验技术理论讲座n工欲善其事，必先利其器工欲善其事，必先利其器n天津科技大学生物技术系天津科技大学生物技术系n刘常金刘常金n2007 12第一部分第一部分 色谱技术色谱技术n层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是19061906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为名为“色谱法色谱法”（Ch

2、romatography)Chromatography)。n后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。n19441944年出现纸层析。年出现纸层析。n以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法的基本原理层析法的基本原理n层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为力、分配系数等），

3、使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。以不同的速度移动而达到分离的目的。n按层析过程的机理分类：按层析过程的机理分类：吸附层析吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。的分配系数不同，使之分离。离子交换层析离子交换层析：利

4、用不同组分对离子交换剂亲和：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。力的不同。凝胶层析凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。分阻滞作用的不同。n按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：柱层析柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。移动而达到分离。纸层析纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行

5、物质的分离和鉴定。层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。第一节第一节 吸附层析技术吸附层析技术一、基本原理一、基本原理吸附层析法（液吸附层析法（液-固色谱法，固色谱法，LSCLSC）原理：原理：利用固定相的固体吸附剂表面利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。特点：特点：适合分离不同种类的化合物适合分离不同种类的化合物(醇类醇类和芳香烃）。和芳香烃）。二、吸附剂二、吸附剂吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质

6、的极性官能团作用。极性官能团作用。常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等羟基羟基磷灰石（羟基羟基磷灰石（HAHA）CaCa1010(PO(PO4 4)6 6.(OH).(OH)2 2,可用于分离蛋可用于分离蛋白质与核酸。白质与核酸。其表面有其表面有CaCa2+2+和和POPO4 43-3-两种带电基团；酸性和两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与中性蛋白质可与CaCa2+2+结合；碱性蛋白质可与结合；碱性蛋白质可与POPO4 43-3-结合。结合。HAHA柱层析最重要的用途之一是分离单链柱层析最重要的用途之一是分离单链DNADNA和双链和双

7、链DNADNA，因为因为它对双链它对双链DNADNA的亲和力大于单链的亲和力大于单链DNADNA。第二节第二节 分配层析技术分配层析技术分配层析法（液分配层析法（液-液层析法，液层析法，LLCLLC）原理：原理：利用混合物利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的动相）之间的分配系数分配系数的不同而达到分离各组分的目的。的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。分配系数：分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固

8、定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。数。K=cK=c1 1/c/c2 2v分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。可彼此分开。特点：特点：液液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体液层析法适合于分离同系物或同分异构体第三节第三节 凝胶过滤层析技术凝胶过滤层析技术一、基本原理一、基本原理概念（概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分排阻层析，分子筛层析）：当生

9、物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分分子大小子大小不同而进行分离的技术。不同而进行分离的技术。原理：原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分被分离的混合物流离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出经过的路程较长移动速

10、度较慢，最后被洗脱出来。来。二、凝胶的种类和性质二、凝胶的种类和性质 一一 、交联葡聚糖凝胶（、交联葡聚糖凝胶（Sephadex)Sephadex)1)Sephadex G 1)Sephadex G G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍。倍。G G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。2 2）SephadeX LHSephadeX LH2020，是是Sephadex GSephadex G2525的羧丙基衍生物，的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质P37P37。

11、二二 、琼脂糖凝胶（、琼脂糖凝胶（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。状结构越密集。三三 、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶商品名为生物胶P P（Bio-Gel P).Bio-Gel P).四

12、四 、聚丙乙烯凝胶（聚丙乙烯凝胶（Styrogel)Styrogel)大网孔结构。大网孔结构。三、三、凝胶过滤在试验室中的应用凝胶过滤在试验室中的应用1）生物大分子物质的分离纯化生物大分子物质的分离纯化2 2）分子量的测定）分子量的测定3 3）分级分离）分级分离4 4）溶液浓缩）溶液浓缩5 5）平衡常数的测定）平衡常数的测定6 6）细胞及颗粒的分离）细胞及颗粒的分离第四节第四节 离子交换层析法离子交换层析法原理原理:根据离子交换树脂对需要分离的各种离子根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的的亲和力亲和力不同而达到分离的目的。不同而达到分离的目的。将离子交换树脂装入层析柱。将离子交换树脂装入层析

13、柱。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团分子中含有可解离的基团.含有酸性可解离基含有酸性可解离基团的称为团的称为阳离子交换树脂阳离子交换树脂，可解离出，可解离出H+H+，含有含有碱性可解离基团的称为碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂阴离子交换树脂，可解，可解离出离出OH-OH-。离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理+若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+H+发生交发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与

14、荷的物质可与OH-OH-发生交换而结合在树脂上。发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。来，达到分离纯化的目的。+第五节第五节 亲和层析法亲和层析法原理：原理：利用生物大分子间利用生物大分子间特异的亲和能力特异的亲和能力来纯来纯化生物大分子化生物大分子 如：如：抗原和抗体抗原和抗体 ；酶和底物酶和底物或辅酶或抑制剂或辅酶或抑制剂 ；激素和受体；激素和受体；RNARNA和其和其互补的互补的DNADN

15、A等。等。将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结合的物质再用含游离的相应配体溶液去。被结合的物质再用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。把它从柱上洗脱下来。第六节第六节 高压液相层析高压液相层析（HPLCHPLC）特点：特点：使用的固相支持剂颗粒很细，使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大表面积很大,因而分辨率很高。因而分辨率很高。溶剂系统采用高压，因此洗脱速溶剂系统采用高压，因此洗脱

16、速度增大。度增大。许多类型的柱层析都可用许多类型的柱层析都可用HPLCHPLC来代替，来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。凝胶过滤等。第二部分第二部分 离心技术离心技术n离心机的使用及注意事项台式高、台式高、超速离心超速离心机机0.6-10万万转转/分以分以上上离心机离心机制备性制备性分析性分析性分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心机普通离心机冰冻离心机冰冻离心机台式（或地台式（或地面式）普通面式）普通离心机离心机大容量冰大容量冰冻离心机冻离心机小于小于0.6万万转转/分分高速冰冻高速冰冻离心机离心机0.6-2.5万万超速冰冻超速冰冻

17、离心机离心机2.5-8万或万或更高更高(分析性超速离心主要用于分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特检测大分子物质的沉降特征和结构等征和结构等)概述概述二、转子离心管及选择二、转子离心管及选择（一）离心管（一）离心管v 常常见见的的玻玻璃璃离离心心管管质质虽虽硬硬，但但脆脆，不不能能承承受受超超离离心心的的压力。压力。v 用用于于超超离离心心机机转转子子中中的的离离心心管管分分为为塑塑料料管管及及不不锈锈钢钢管管两类。两类。v离离心心时时样样品品一一般般应应装装满满离离心心管管，否否则则将将可可能能因因有有气气泡泡而而使使管管的的外外部部受受压压不不均均，造造成成离离心心管管破破裂裂，使

18、使转转子子不不平平衡衡产产生事故生事故 （二）离心管帽（二）离心管帽v 超超离离心心机机所所用用离离心心管管一一般般都都附附有有管管帽帽，离离心心时时离离心心管管需戴上管帽。需戴上管帽。（三）转子及选择（三）转子及选择v 主主要要有有角角转转子子（TypeType）、水水平平转转子子（swsw）、垂垂直直转转子子（v v）、）、区带转子（区带转子（c c）等几种类型。等几种类型。1 1、角转子、角转子v 指离心管腔与转轴成一定倾角的转子，角度越大，沉降指离心管腔与转轴成一定倾角的转子，角度越大，沉降越结实，分离效果越好，相反，角度越小，颗粒沉降距离越结实，分离效果越好，相反，角度越小，颗粒沉降

19、距离短，沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，短，沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积，称为此管的一侧会出现颗粒沉积，称为“壁效应壁效应”。最适合差。最适合差速离心，强度大、方便，但加速或减速时，对样品有搅动。速离心，强度大、方便，但加速或减速时，对样品有搅动。2 2、水平转子、水平转子v 转转子子活活动动管管套套内内的的离离心心管管，旋旋转转时时随随着着转转子子的的转转动动，从从垂垂直直悬悬吊吊上上升升到到水水平平位位置置（约约2002008008

20、00rpmrpm）时时。颗颗粒粒在在水水平平转转子子中中的的沉沉降降是是沿沿管管子子方方向向的的，梯梯度度离离心心中中颗颗粒粒沉沉降降区区带带横横过过离离心心管管，离离心心后后区区带带不不必必重重新新定定位位，但但只只有有处处于于样样品品区区带带中中心心的的颗颗粒粒才才直直接接向向管管底底沉沉降降，其其它它颗颗粒粒则则撞撞向向壁壁的的两两侧侧，产产生生“壁壁效效应应”，但但受受振振动动和和变变速速搅搅乱乱后后对对流现象小得多。流现象小得多。3 3、垂直转子、垂直转子v 角角式式转转子子的的特特殊殊形形式式，主主要要用用于于等等密密度度梯梯度度离离心心，这这种种转转子子颗颗粒粒移移动动距距离离短

21、短，比比水水平平式式和和角角式式转转子子节节约约大大量量时时间间，但速度剧变但速度剧变 容易产生对流扰乱。容易产生对流扰乱。4 4、区带转子、区带转子 已破碎的细胞已破碎的细胞 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）上清液上清液 沉淀（细胞膜碎片、沉淀（细胞膜碎片、线粒体、溶酶体）线粒体、溶酶体）上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白体）沉淀（核糖核蛋白体）上清液（可上清液（可溶性组分）溶性组分）500g,1010 000g,10100 000g,3h第三部分第三部分 电泳技术电泳技术n电泳的概念电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（的现象称为电泳（electr

22、ophoresiselectrophoresis）。）。n电泳现象早在十九世纪初就已发现（电泳现象早在十九世纪初就已发现（18081808年俄国年俄国物理学家物理学家ReRessss进行了世界上第一次电泳实验）。进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在但电泳技术的广泛应用，则是在19371937年用滤纸作年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应

23、用。域得到了广泛应用。电泳的分类电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类：原则上按电泳的原理来分，可分为二类：n自由界面电泳：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。贵，费时费力，不便于推广应用。n区带电泳：区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成是防止电泳过程中的对流和扩

24、散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。按按支持介质种类支持介质种类的不同，区带电泳可分为：的不同，区带电泳可分为：纸电泳纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。高

25、。v以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。引引 言言淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，到重复的电泳结果，加之电泳时

26、间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。测。其分辨率较高。v聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质引引 言言第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，电泳是在电

27、场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。反电极泳动速度不同进而达到分离目的。.若将带净电荷若将带净电荷Q Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：F F引引=E Q E Q （1）在溶液中在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F F阻阻 F F阻阻=6=6r rV V 当当F F引引=F F阻阻时时 EQ=6EQ=6r rV V V=V=由上式可以看出由上

28、式可以看出,粒子的移动速度粒子的移动速度(泳动速度泳动速度V)V)与电场强度与电场强度(E)E)和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量(Q)Q)成正比成正比,而与粒子的半径而与粒子的半径(r)r)及溶液的粘度及溶液的粘度()成反比。成反比。非球形分子（如线状非球形分子（如线状DNADNA）在电泳过程中受到更大在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。EQEQ6 6r r（2）（3）（4）电泳的基本原理电泳的基本原理在一定在一定pHpH条件下，每一种分子都具有特定条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在的电荷（种类和数量

29、）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。术进行分离、分析和鉴定的基本原理。+-由由（4 4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，了便于比较，常用迁移率常用迁移率 m m（或称泳动度，指带电粒或称泳动度，指带电粒子在单位电场强

30、度下的泳动速度）子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示代替泳动速度表示粒子的泳动情况。粒子的泳动情况。m=V/E=Q/6m=V/E=Q/6r r （5 5）由上式可以看出，由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。EQEQ6 6r r（4）V=电泳的基本原理电泳的基本原理 由于蛋白质、氨基酸等的电离度由于蛋白质、氨基酸等的电离度随溶液随溶液pHpH变化变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率率U U为迁移率为迁移率m

31、 m和当时条件下电离度和当时条件下电离度的乘积。的乘积。U=m U=m （6 6）将（将（6 6）式代入（）式代入（5 5）式得：）式得：U=U=（7 7）.Q Q.6 6r r 由由（7 7）式可以看出，）式可以看出，凡能影响溶液粘度凡能影响溶液粘度的因素的因素如如温度温度，影响分子带电量，影响分子带电量Q Q及解离度及解离度的因素如的因素如pHpH的的改变，都会对有效迁移率，产生影响。改变，都会对有效迁移率，产生影响。电泳的基本原理电泳的基本原理 以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有

32、效迁移率还受持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受电电渗渗（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。最后要考虑选用最后要考虑选用离子强度离子强度适宜的溶液。离子强度影响粒子的适宜的溶液。离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。总之，电泳受总之，电泳受

33、粒子本身大小、形状、所带电量粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、溶液粘度、温度、温度、pHpH、电渗及离子强度电渗及离子强度多种因素的影响。多种因素的影响。第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electropho-polyacrylamide gel electropho-resisresis，PAGEPAGE）是以是以聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，

34、化学性质稳定，对稳定，对pHpH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体（acry-acry-lamidelamide，简称简称AcrAcr）和和交联剂交联剂N N，N N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（methylane methylane bisacrylamidebisacrylamide，简称简称BisBis）在催化剂作用下合成的。在催化剂作用下合成的。聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和

35、操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型。等电聚焦电泳，双向电泳等类型。一、概述一、概述CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=OC=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CHCH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C

36、=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰胺胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、聚丙烯酰胺凝胶的制备二、聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1 1.化学聚合化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵过硫酸铵（ammonium persulfateammonium persulfate，ApAp），），此外还需要加速剂此外还需要加速剂TEMEDTEMED（N

37、 N，N N，N N，N N-四甲基乙二胺），四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量它能以自由基的形式存在。微量TEMEDTEMED的加入，可使过硫酸铵形成的加入，可使过硫酸铵形成自由基：自由基：S S2 2O O8 82-2-2SO 2SO4 4-这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。.光聚合通常用光聚合通常用核黄素核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。再被痕

38、量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMEDTEMED的存在，的存在，可以加速聚合。可以加速聚合。上述聚合反应受许多因素的影响：上述聚合反应受许多因素的影响：（1 1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。合。（2 2）低温、低）低温、低pHpH都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。（3 3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有

39、机玻璃，一些金属等可抑制）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。聚合反应。2.2.光聚合光聚合 凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（于凝胶总浓度（T T）和和AcrAcr与与BisBis两者之比。两者之比。凝胶总浓度（凝胶总浓度（T T）和交和交联度（联度（C C）的计算公式分别为：的计算公式分别为：T=C=T=C=凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔凝胶浓度越大，孔径越小径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀。凝胶浓度过大

40、，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为当凝胶浓度确定后，交联度为5%5%时，时，凝胶具有最小孔径，凝胶具有最小孔径，超过超过5%5%或低于或低于5%5%时凝胶孔径都要增大。时凝胶孔径都要增大。三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%在浓度为在浓度为7.5%7.5%的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为满意的分离效果。因此，把浓度为7

41、.5%7.5%凝胶称为标准胶。对于凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准胶或的标准胶或4%-10%4%-10%的凝胶梯度来测试，的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。而后选出适宜的凝胶浓度。用于研究大分子核酸的凝胶多为用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%2.4%的大孔凝胶，此时凝的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入胶太软，不易操作，可加入0.5%0.5%琼脂糖，或在琼脂糖，或在3%3%凝胶中加入凝胶中加入20%20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳四、不连续聚丙烯酰

42、胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个系统的不连续性表现在以下几个方面：方面：1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的pHpH不不同。电极缓冲液为同。电极缓冲液为pH8.3pH8.3的的Tris-Tris-甘氨甘氨酸缓冲液，浓缩胶为酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7pH6.7的的Tris-Tris-HClHCl缓冲液，而分离胶为缓冲液，而分离胶为pH8.9pH8.9的的Tris-HClTris-HCl缓

43、冲液。缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即三种物理效应，即样品的浓缩效应，样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。分辨率高。8.38.38.96.7水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽电泳条带电泳条带第三节第三节 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。种电泳

44、方法。对于分子量较大的样品对于分子量较大的样品，如大分子核酸、，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。离。琼脂糖凝胶约可区分相差琼脂糖凝胶约可区分相差100100bpbp的的DNADNA片段，其分辨片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于尤其适于分离大片段分离大片段DNADNA。普通琼脂糖凝胶分离普通琼脂糖凝胶分离DNADNA的范的范围为围为0.2-200.2-20kbkb，利用脉冲电泳，可分离高达利用脉冲电泳，可分离高达10107 7bpbp的的DNADNA片段。片段。关于实验笔试部分的复习与考试关于实验笔试部分的复习与考试n1、范围 本学期所做的所有实验及其内容n2、复习材料 实验讲义有关部分及本课件n3、重点提示：实验的原理及实验后的思考题均要熟悉，实验中所用重要试剂及其作用要熟悉，重要的实验现象和结果要熟悉。n4、设计性实验虽然自己未全部做，但基本的让要复习掌握。完完n希望同学们认真复习希望同学们认真复习n争取取得好成绩！争取取得好成绩！n最后真诚欢迎对本课程及本最后真诚欢迎对本课程及本人授课情况提出意见与建议！人授课情况提出意见与建议！n谢谢同学们！谢谢同学们！