生物化学核酸化学.ppt

《生物化学核酸化学.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学核酸化学.ppt（19页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、2.5 2.5 核酸的理化性质及其应用核酸的理化性质及其应用 2.5.1 核酸的一般性质核酸的一般性质 2.5.2 核酸的紫外吸收特性核酸的紫外吸收特性 2.5.3 核酸的变性、复性核酸的变性、复性 2.5.4 分子杂交分子杂交2.5.1 核酸的一般性质核酸的一般性质RNA为白色粉末，为白色粉末，DNA是白色纤维状固体，二者是白色纤维状固体，二者均微溶于水，而不溶于一般有机溶剂中，故常用均微溶于水，而不溶于一般有机溶剂中，故常用70%乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。核酸既有碱性基团，又有磷酸基团，故为两性电解核酸既有碱性基团，又有磷酸基团，故为两性电解质，但酸性强。

2、介质质，但酸性强。介质pH大于大于4时，呈阴离子，电泳时，呈阴离子，电泳时向阳极移动。时向阳极移动。大多数大多数DNA为线性分子，长度可达数厘米，直径为线性分子，长度可达数厘米，直径仅为仅为2nm，故，故DNA溶液粘度很高，分子极易断裂；溶液粘度很高，分子极易断裂；RNA溶液粘度较小。溶液粘度较小。2202402602800.10.20.30.4波长（波长（nmnm）光光吸吸收收123天然天然DNA核苷酸总核苷酸总吸收值吸收值变性变性DNA2.5.2 核酸的紫外吸收特性核酸的紫外吸收特性（max=260nm）纯DNA OD260/OD280=1.8纯RNA OD260/OD280=2.02.5

3、.3 核酸的变性、复性核酸的变性、复性是是双链核酸分子双链核酸分子的二个重要的二个重要物理特性物理特性；双链双链DNADNA、RNARNA双链区双链区、DNA:RNADNA:RNA杂交双杂交双链链都有此性质。都有此性质。2.5.3.1 核酸的变性核酸的变性（denaturation）(1)(1)变性的概念：变性的概念：变性的概念：变性的概念：双螺旋结构打开，形成无规则线性双螺旋结构打开，形成无规则线性结构的过程。结构的过程。加热加热部分双螺旋解开部分双螺旋解开 无规则线团无规则线团 链内碱基配对链内碱基配对(2)结构和性质的变化：结构和性质的变化：化学键变化：化学键变化：氢键、疏水键断裂，不涉

4、及共价键的断裂。氢键、疏水键断裂，不涉及共价键的断裂。结构变化：结构变化：改变核酸空间结构，一级结构不变。改变核酸空间结构，一级结构不变。增色效应：增色效应：DNADNA变性后，溶液紫外吸收作用增强的效应。变性后，溶液紫外吸收作用增强的效应。原因：原因：在双螺旋结构中，有序堆积的碱基紫外吸收降在双螺旋结构中，有序堆积的碱基紫外吸收降低，当低，当DNADNA变性后，双链解开，碱基外露，变性后，双链解开，碱基外露，260nm 260nm紫外紫外吸收增大，产生增色效应。吸收增大，产生增色效应。(3)变性的因素：变性的因素：l加热加热l极端的极端的pHl有机试剂（甲醇、乙醇、尿素等）。有机试剂（甲醇、

5、乙醇、尿素等）。DNADNA的热变性的热变性特点：特点：狭窄性：狭窄性：变性温变性温度范围小。度范围小。爆发式：爆发式：像晶体像晶体的的熔点熔点，到达变性，到达变性温度后，温度后，DNA很快很快变性解链，故名变性解链，故名熔熔解温度解温度。DNADNA热变性曲线热变性曲线熔解温度熔解温度（melting temperature，Tm）：）：DNA 分子双分子双链解开链解开50%所需温度所需温度。一般一般DNA的的Tm值在值在80-90 C之间。之间。T Tm m值的影响因素：值的影响因素：碱基组成碱基组成：（G+C）含量越高，双螺旋结构的越稳定，）含量越高，双螺旋结构的越稳定，Tm值越大，值越

6、大，氢键数氢键数GC，A=T。计算计算Tm的经验公式的经验公式(在在0.2mol/L NaCl溶液中溶液中):X%X%（G+CG+C）=2.44=2.44（Tm-69.3Tm-69.3）另外，另外，当当DNA链碱基数链碱基数20：Tm=4 Tm=4（G+CG+C）+2+2（A+TA+T）T Tm m值的影响因素：值的影响因素：DNADNA的均一性：的均一性：DNA分子中碱基组成的均一性：分子中碱基组成的均一性：如只含有如只含有一种碱基对一种碱基对的的多核苷酸片段，多核苷酸片段，Tm值范围很窄，变性时氢链断裂几乎可值范围很窄，变性时氢链断裂几乎可“齐同齐同”进行进行待测待测DNA样品组成的均一性

7、：样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒如样品中只含有一种病毒DNA，其，其 Tm 值范围较窄，若混有其它来源的值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则，则 Tm值范围较宽值范围较宽复复性性：在在一一定定条条件件下下，变变性性DNA单单链链间间碱碱基基重重新新配配对恢复双螺旋结构，对恢复双螺旋结构，DNA的功能恢复。的功能恢复。减减色色效效应应：变变性性DNA复复性性过过程程中中，伴伴有有A260减减小小的的现象。现象。核酸的复性核酸的复性（renaturation)变性（加热）变性（加热）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）影响复性的因素影响复性的因素温度和时间温度和时间DNADNA浓度浓度DN

8、ADNA序列的复杂度序列的复杂度温度和时间温度和时间一般认为一般认为比比 Tm低低25左右左右的温度是复性的温度是复性的最佳条件，一般为的最佳条件，一般为60 左右左右。复性时温度下降必须缓慢复性时温度下降必须缓慢，若在超过，若在超过Tm的的温度下迅速冷却至低温，复性几乎不可能。温度下迅速冷却至低温，复性几乎不可能。核酸实验中经常以此方式保持核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性的变性（单链）状态。（单链）状态。DNA浓度浓度DNA复性的第一步是两个单链分子间的复性的第一步是两个单链分子间的相互作用相互作用“成核成核”。“成核成核”速度与速度与DNA浓度的平方成正比。浓度的平方成正比。溶液中溶

9、液中DNA分子越多，相互碰撞结合分子越多，相互碰撞结合“成成核核”的机会越大。的机会越大。DNA顺序的复杂性顺序的复杂性简单顺序的简单顺序的DNA分子，如多聚（分子，如多聚（A）和多聚）和多聚（T）这二种单链序列复性时，互补碱基的配对）这二种单链序列复性时，互补碱基的配对容易。容易。顺序复杂的顺序复杂的DNA，如小牛，如小牛DNA的非重复部分的非重复部分（一般以单拷贝存在于基因组中），这种复杂的（一般以单拷贝存在于基因组中），这种复杂的特定序列要实现互补，显然要比上述简单序列困特定序列要实现互补，显然要比上述简单序列困难得多。难得多。定定义义：不不同同来来源源的的DNA单单链链间间、单单链链D

10、NA与与RNA、RNA与与RNA之之间间存存在在碱碱基基配配对对区区域，复性时形成域，复性时形成杂交分子杂交分子的现象。的现象。分子杂交分子杂交(简称杂交，简称杂交，hybridization)常用的杂交方法有常用的杂交方法有:Southern（DNA)印印迹迹法法:利利用用琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离经经限限制制性性内内切切酶酶消消化化的的DNA片片段段，将将胶胶上上的的DNA变变性性并并在在原原位位将将单单链链DNA片片段段转转移移至至尼尼龙龙膜膜或或其其他他固固相相支支持持物物上上，经经干干烤烤或或者者紫紫外外线线照照射射固固定定，再再与与相相对对应应结结构构的的标标记记探探针针

11、进进行行杂杂交交，用用放放射射自自显显影影或或酶酶反反应应显显色色，从从而检测特定而检测特定DNA分子的含量。分子的含量。Northern（RNA)印印迹迹法法:将将RNA固固定定在在硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上后后,用互补的用互补的,具有放射性标记的具有放射性标记的RNA或或DNA探针与其杂交探针与其杂交.分子杂交分子杂交(简称杂交，简称杂交，hybridization)本章重点本章重点五种碱基及相应的核苷酸及脱氧核苷酸的五种碱基及相应的核苷酸及脱氧核苷酸的结构式结构式；碱基与戊糖的；碱基与戊糖的连连接方式接方式；核苷酸残基的；核苷酸残基的连接方式连接方式；DNA双螺旋结构的基本要点双螺旋结构的基本要点tRNA的结构特点的结构特点l一级结构：一级结构：由由7090个核苷酸组成单链；含较多的个核苷酸组成单链；含较多的稀有碱基稀有碱基；5端多为端多为PG、3端多为端多为CCAOH。l二级结构：二级结构：三叶草形、四臂四环三叶草形、四臂四环l三级结构：倒三级结构：倒“L”mRNA特征特征l原核生物：原核生物：多顺反子多顺反子mRNAl真核生物：真核生物：单顺反子单顺反子mRNA，5“帽子帽子”和和3“尾巴尾巴”核酸主要的理化性质核酸主要的理化性质（相关概念）（相关概念）l变性与复性；增色效应和减色效应变性与复性；增色效应和减色效应lTml分子杂交分子杂交