生化课件2蛋白质.ppt

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1、 1.1.掌握蛋白质化学组成和掌握蛋白质化学组成和分类分类；2.2.掌握氨基酸分类、结构、和分离分析方法，氨基掌握氨基酸分类、结构、和分离分析方法，氨基酸的两性性质，酸的两性性质，pI pI 和和 PkPk，重要化学反应；，重要化学反应；3.3.弄清楚蛋白质的一级结构及其序列分析方法；了弄清楚蛋白质的一级结构及其序列分析方法；了解二、三和四级结构基本概念；解二、三和四级结构基本概念；4.4.了解蛋白质的生物功能了解蛋白质的生物功能、重要理化性质；重要理化性质；5.5.了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据；了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据；6.6.了解结合蛋白的分布、特性和生物功能。了解结合

2、蛋白的分布、特性和生物功能。第二章第二章 蛋白质蛋白质蛋白质是各种氨基酸通过肽键蛋白质是各种氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的含氮的连接而成的具有特定结构的含氮的生物大分子，是生命存在的形式。生物大分子，是生命存在的形式。蛋蛋蛋蛋白质存在于所有的生物细胞中，白质存在于所有的生物细胞中，白质存在于所有的生物细胞中，白质存在于所有的生物细胞中，是动植物是动植物和微生物细胞中最重要的有机物质之一，和微生物细胞中最重要的有机物质之一，是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大分子，是构成生物体最基

3、本的结构物质和分子，是构成生物体最基本的结构物质和分子，是构成生物体最基本的结构物质和分子，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。它参与了几乎所有的生命活动过程。它参与了几乎所有的生命活动过程。它参与了几乎所有的生命活动过程。2.1 蛋白质的分类12/2/2022一、蛋白质的重要作用一、蛋白质的重要作用 1.1.生物催化作用（酶）生物催化作用（酶）2.2.结结构构物物质质(生生物物膜膜、结结缔缔组组织织的的胶胶原原蛋蛋白

4、白、血血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）3.3.物物质质运运输输（血血红红蛋蛋白白、NaNa+-K-K+-ATPase-ATPase、葡葡萄萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）4.4.运动功能运动功能(肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白)5.5.贮存功能（卵清蛋白、种子蛋白、铁蛋白等）贮存功能（卵清蛋白、种子蛋白、铁蛋白等）6.6.防防御御、免免疫疫作作用用(抗抗体体、皮皮肤肤的的角角蛋蛋白白、血血凝凝蛋白蛋白)12/2/2022 7.7.接受和传递信息（受体蛋白，味觉蛋白、支接受和传递信息（受体蛋白，味觉蛋白、支架蛋

5、白架蛋白)8.8.调节代谢、控制生长和分化功能调节代谢、控制生长和分化功能(组蛋白、阻组蛋白、阻遏蛋白；遏蛋白；调节新陈代谢的生理活性物质，如胰岛素。）调节新陈代谢的生理活性物质，如胰岛素。）9.9.感染和毒性作用感染和毒性作用(能引起机体中毒症状和死亡的异能引起机体中毒症状和死亡的异体蛋白，如细菌毒素、蛇毒、蝎毒、蓖麻蛋白等）体蛋白，如细菌毒素、蛇毒、蝎毒、蓖麻蛋白等）二、蛋白质组成与分类二、蛋白质组成与分类1.1.化学组成化学组成(1)元素组成元素组成:主要组成元素为主要组成元素为碳、氢、氧、氮碳、氢、氧、氮;有的还含有少量的有的还含有少量的硫、磷、硫、磷、碘碘或或金属元素金属元素（如铁、

6、铜、锌等）。其中，（如铁、铜、锌等）。其中，C占占5055%，H68%，O2023%，N1518%，S04%。大多数蛋大多数蛋白质的白质的N含量约为含量约为16%。凯氏定氮：粗蛋白质含量凯氏定氮：粗蛋白质含量凯氏定氮：粗蛋白质含量凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白含氮量蛋白含氮量蛋白含氮量蛋白含氮量6.256.25(2)氨基酸组成氨基酸组成氨基酸组成氨基酸组成蛋白质是由蛋白质是由蛋白质是由蛋白质是由2020种基本氨基酸组成的长链分子，这些种基本氨基酸组成的长链分子，这些种基本氨基酸组成的长链分子，这些种基本氨基酸组成的长链分子，这些氨基酸中，氨基酸中，大部分属于大部分属于L-氨基酸；脯氨酸氨基酸；脯

7、氨酸属于属于L-亚氨基酸，而亚氨基酸，而甘氨酸甘氨酸则属于则属于-氨基酸。氨基酸。12/2/20222.2.蛋白质的常见分类方法蛋白质的常见分类方法(1)(1)根据蛋白质的分子组成根据蛋白质的分子组成 简单蛋白质简单蛋白质和和结合蛋白质结合蛋白质清蛋白清蛋白 球蛋白球蛋白 谷蛋白谷蛋白 醇溶谷蛋白醇溶谷蛋白 组蛋白组蛋白 鱼精蛋白鱼精蛋白 硬蛋白硬蛋白简单简单蛋白蛋白结合结合蛋白蛋白核蛋白核蛋白脂蛋白脂蛋白糖蛋白糖蛋白和粘蛋白和粘蛋白磷蛋白磷蛋白色蛋白色蛋白:血红蛋白血红蛋白黄素蛋白黄素蛋白金属蛋白金属蛋白根据溶解度的不同根据溶解度的不同根据非蛋白质即辅基的不同根据非蛋白质即辅基的不同12/2

8、/2022类类别别特点及分布特点及分布举例简单蛋白质清蛋白溶于水，加热即凝固。需饱和硫酸铵才能沉淀。广泛分布于一切生物体中血清清蛋白、乳清蛋白球蛋白不溶于水，溶于稀盐溶液，需半饱和硫酸铵沉淀。分布普遍血清球蛋白、肌球蛋白、大豆球蛋白等谷蛋白不溶于水、醇及中性盐溶液，易溶于稀酸或稀碱，受热不凝固。各种谷物中米谷蛋白、麦谷蛋白醇溶谷蛋白不溶于水，溶于7080乙醇中玉米蛋白精蛋白溶于水及稀酸，遇热不凝固，是碱性蛋白，含His.Arg多蛙精蛋白组蛋白溶于水及稀酸，不溶于稀氨水，碱性蛋白，含His.Lys多小牛胸腺组蛋白硬蛋白不溶于水、盐、稀酸或稀碱溶液。分布于动物体内结缔组织，毛、发、蹄、角等角蛋白、

9、胶原、弹性蛋白、丝心蛋白等结合蛋白质核蛋白辅基是核酸。存在于一切细胞中核糖体、脱氧核糖核蛋白体脂蛋白与脂类结合。存在于生物膜和动物血浆中卵黄蛋白、血清-脂蛋白糖蛋白与糖类结合而成,广泛存在于动植物组织中粘蛋白、-球蛋白、膜蛋白等磷蛋白以丝苏残基的-OH与磷酸成酯键结合而成。乳、蛋等生物材料中酪蛋白、卵黄蛋白血红素蛋白辅基为血红素。存在于一切生物体中血红蛋白、细胞色素等黄蛋白辅基为FAD或FMN。存在于一切生物体中琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶等金属蛋白与金属元素直接结合铁蛋白、乙醇脱氢酶(含锌)、黄嘌呤氧化酶(含钼、铁)血浆脂蛋白的组成、性质及功能血浆脂蛋白的组成、性质及功能 血浆脂蛋白血浆脂

10、蛋白（lipoprotein）：血液中的脂类与蛋白质结合成可溶性的复合物，是血脂的存在和运输形式。血浆中所含脂血浆中所含脂类物质统称为血脂。类物质统称为血脂。组成：组成：血浆脂蛋白均由蛋白质（载脂蛋白，Apo）、甘油三酯(TG)、磷脂(PL)、胆固醇(Ch)及其酯(ChE)所组成。结构：结构：通常呈球形颗粒。颗粒外层为亲水的载脂蛋白和磷脂的极性部分，疏水部分则伸入到内部，疏水的甘油三酯和胆固醇被包裹在内部。乳糜微粒乳糜微粒极低密度脂蛋白极低密度脂蛋白低密度脂蛋白低密度脂蛋白高密度脂蛋白高密度脂蛋白CMVLDLLDLHDL形成部位形成部位：小肠粘膜：小肠粘膜肝细胞肝细胞血浆、肝血浆、肝肝细胞肝细

11、胞功能：功能：转运外源转运外源转运内源转运内源转运内源转运内源逆向转运逆向转运甘油三甘油三酯酯甘油三甘油三酯酯胆固醇胆固醇胆固醇胆固醇血浆脂蛋白功能血浆脂蛋白功能：(2)(2)根据蛋白质分子形状根据蛋白质分子形状球状蛋白质和纤维状蛋白质球状蛋白质和纤维状蛋白质(3)(3)根据蛋白质生物功能根据蛋白质生物功能活性蛋白质和非活性蛋白质活性蛋白质和非活性蛋白质活性蛋白质活性蛋白质包括生命活动过程中一切有活性的蛋白质以包括生命活动过程中一切有活性的蛋白质以及它们的前体分子。绝大多数蛋白质属于活性蛋白质，包括及它们的前体分子。绝大多数蛋白质属于活性蛋白质，包括酶、激素蛋白、运输蛋白（转运蛋白）、贮存蛋白

12、、运动蛋酶、激素蛋白、运输蛋白（转运蛋白）、贮存蛋白、运动蛋白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白等。蛋白等。非活性蛋白质非活性蛋白质对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。2.2 2.2 蛋白质的组成单位蛋白质的组成单位氨基酸氨基酸(Aminoacid)一、氨基酸的结构一、氨基酸的结构二、氨基酸的分类二、氨基酸的分类三、氨基酸的理化性质三、氨基酸的理化性质四、氨基酸的分离与分析四、氨基酸的分离与分析五、氨

13、基酸的制备和应用状况五、氨基酸的制备和应用状况一、氨基酸的结构生物体内的氨基酸包括三大类：生物体内的氨基酸包括三大类：基本氨基酸基本氨基酸：编码蛋白质的氨基酸，组成蛋白质，编码蛋白质的氨基酸，组成蛋白质，2020种种；稀有氨基酸稀有氨基酸：是多肽合成后由基本：是多肽合成后由基本AAAA经酶促修饰产生的，出现在一些蛋经酶促修饰产生的，出现在一些蛋白质的水解液中含有的少量氨基酸，如：胱氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、白质的水解液中含有的少量氨基酸，如：胱氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、L-L-甲状腺素等；含稀有氨基酸的蛋白质多具有较强的活性。甲状腺素等；含稀有氨基酸的蛋白质多具有较强的活性。非蛋白质氨基酸非蛋

14、白质氨基酸：氨基酸的衍生物，以游离或结合的形式存在于生物体氨基酸的衍生物，以游离或结合的形式存在于生物体内。有些是重要的代谢前体或中间产物如内。有些是重要的代谢前体或中间产物如-丙氨酸丙氨酸（维生素泛酸的前（维生素泛酸的前体），体），瓜氨酸、鸟氨酸（瓜氨酸、鸟氨酸（精氨酸的前体）；精氨酸的前体）；-氨基丁酸氨基丁酸（神经递质）等，（神经递质）等，还还有有些些是是-,-,-,-,-,-,和和D-D-型型氨氨基基酸酸；植植物物的的非非蛋蛋白白质质氨氨基基酸酸是是其其次次生生代代谢谢产物（中草药的药效成分），如：刀豆氨酸、黎豆氨酸和产物（中草药的药效成分），如：刀豆氨酸、黎豆氨酸和-氰丙氨酸。氰丙氨

15、酸。v蛋白质是由蛋白质是由2020种基本氨基酸种基本氨基酸组成的组成的。1.氨基酸的结构氨基酸的结构通式通式:2.-2.-氨基酸的构型氨基酸的构型:构型：指在立体异构体中的原子或取代基团的空间排列关构型：指在立体异构体中的原子或取代基团的空间排列关系系。不同的空间排列称为不同的构型。（构型的改变涉及到共不同的空间排列称为不同的构型。（构型的改变涉及到共价键的形成和破坏，但与氢键无关。）价键的形成和破坏，但与氢键无关。）构象构象:一个分子结构中原子沿共价键转动而产生的不同空一个分子结构中原子沿共价键转动而产生的不同空间排列间排列。(构象的改变会牵涉到氢键的形成和破坏，但不涉及构象的改变会牵涉到氢

16、键的形成和破坏，但不涉及共价键的破坏。）共价键的破坏。）氨基酸的构型分为氨基酸的构型分为D D型和型和L L型两种。即型两种。即都有手性碳原子，在都有手性碳原子，在三维空间上两种不同的排列方式，它们互为镜影。它们是与三维空间上两种不同的排列方式，它们互为镜影。它们是与甘甘油醛或乳酸油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与相比较而决定的。凡是与L L甘油醛（或甘油醛（或L L乳酸）乳酸）构型相同的，就定义为构型相同的，就定义为L L氨基酸氨基酸，反之为，反之为D D氨基酸氨基酸。生生物物体体内内组组成成蛋蛋白白质质的的AAAA都都是是L-L-型型(除除甘甘氨氨酸酸以以外外)。只只在在少数细菌细胞壁上发现

17、少数细菌细胞壁上发现D-D-型。型。1.1.按照按照R R基的化学结构基的化学结构分类分类(1)(1)脂肪族脂肪族氨基酸氨基酸:R R为为脂肪烃脂肪烃基的氨基酸（基的氨基酸（5 5种）种）a-氨基异戊酸氨基异戊酸a-氨基异氨基异己酸己酸a-氨基氨基-甲基甲基-戊酸戊酸二、氨基酸的分类氨基酸的分类GlycineAlanineValineLeucineIsoleucine脂肪烃脂肪烃基的氨基酸基的氨基酸R R基均为中性烷基，对分子酸碱基均为中性烷基，对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点（性影响很小，它们几乎有相同的等电点（6 6.00.03.00.03）GlyGly是唯一不含手性碳原子的氨

18、基酸，因此不具旋是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。光性。从从GlyGly至至IleIle，R R基团疏水性增加。基团疏水性增加。蛋蛋白白质质多多肽肽中中Gly残残基基的的存存在在将将增增加加其其结结构构区区域域的柔性。的柔性。R中含有中含有羟基和硫羟基和硫的氨基酸（共的氨基酸（共4种）种）a-氨基氨基-硫硫甲基甲基-丁酸丁酸a-氨基氨基-巯基巯基-丙酸丙酸a-氨基氨基-羟基羟基-丁酸丁酸SerineThreonineCysteineMethionineSer的的-CH2OH基（基（pKa=15）在生理条件下不解离，在大多）在生理条件下不解离，在大多数酶的活性中心都发现有数酶的活性中

19、心都发现有Ser残基存在。残基存在。Ser和和Thr的的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。往往与糖链相连，形成糖蛋白。Cys的的R中含巯基（中含巯基（-SH），具有两个重要性质：），具有两个重要性质：（1）在较高）在较高pH值条件，巯基解离。值条件，巯基解离。（2）两个）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。Cys与结石：半胱氨酸的强碱溶液是有效的溶石药物与结石：半胱氨酸的强碱溶液是有效的溶石药物Met在生物合成中是一种重要的甲基供体。在生物合成中是一种重要的甲基供体。R中含有中含有酰胺酰胺基团（基团（2种）种）酰胺基中酰胺基中的氨基易发生的氨基易发生氨

20、基转移反应氨基转移反应AsparagineGlutamineR中含有中含有酸性酸性基团（基团（2种）种）Asp、GluAsp侧链羧基侧链羧基pKa为为3.86，Glu侧链羧基侧链羧基pKa为为4.25它们是唯一在生理条件下它们是唯一在生理条件下带有带有负电荷负电荷的的两种氨基的的两种氨基酸。酸。a-氨基氨基-丁二酸丁二酸a-氨基氨基-戊二酸戊二酸AsparticacidGlutamicacidR中含中含碱性碱性基团（基团（3种）种）a，-二氨基己酸二氨基己酸a-氨基氨基-胍基胍基-戊酸戊酸a-氨基氨基-咪唑基咪唑基-丙酸丙酸Lys侧链氨基的侧链氨基的pKa为为10.53，生理条件下，生理条件下

21、，Lys侧链侧链带有一个正电荷（带有一个正电荷（NH3+），侧链的氨基反应活性增大。），侧链的氨基反应活性增大。Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，最强的有机碱，pKa值为值为12.48，生理条件下完全质子化。，生理条件下完全质子化。His是是pKa值最接近生理值最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中值的一种（游离氨基酸中为为6.00，在多肽链中为，在多肽链中为7.35），是在生理，是在生理pH条件下唯一条件下唯一具有缓冲能力具有缓冲能力的氨基酸。的氨基酸。His在酶的酸碱催化机制中起重要作用在酶的酸碱催化机制中起重要作用(2)

22、芳香族芳香族氨基酸（氨基酸（3种）种）a-氨基氨基-苯基苯基-丙酸丙酸a-氨基氨基-对羟苯基对羟苯基-丙酸丙酸a-氨基氨基-吲哚基吲哚基-丙酸丙酸(3)杂环杂环族氨基酸族氨基酸(1种种)(4)杂环亚氨基酸（杂环亚氨基酸（1种）种）四氢吡咯四氢吡咯-2-羧酸羧酸Pro残残基的存基的存在将会在将会增加蛋增加蛋白质结白质结构区域构区域的刚性。的刚性。ProlineHistidine 2.2.根据氨基酸根据氨基酸R R基侧链的基侧链的极性极性，可将氨基酸分为：可将氨基酸分为：疏水性氨基酸（非极性氨基酸疏水性氨基酸（非极性氨基酸）亲水性氨基酸（极性氨基酸）亲水性氨基酸（极性氨基酸）不带电荷的极性氨基酸不

23、带电荷的极性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸带负电荷的酸性氨基酸带负电荷的酸性氨基酸AspGluLysArgHisSerThrTyrAsnGlnCysAlaValIleLeuProMetPheTrpGly 3.3.根据生物体的根据生物体的需要需要，可将氨基酸分为：可将氨基酸分为：必需氨基酸必需氨基酸半必需氨基酸半必需氨基酸非必需氨基酸非必需氨基酸其余氨基酸其余氨基酸ArgHisLysValIleLeupheMetTrpThr 近年来的研究发现，原先被认为仅用作近年来的研究发现，原先被认为仅用作终止信号的无义终止信号的无义密码子密码子在某些情况下可重新诠释，编码特定的氨基酸，在揭在

24、某些情况下可重新诠释，编码特定的氨基酸，在揭示了示了硒代半胱氨酸由硒代半胱氨酸由UGA编码编码后，最近的研究还表明，在某后，最近的研究还表明，在某些古细菌和真细菌中，些古细菌和真细菌中，无义密码子无义密码子UAG可重新诠释，编码组可重新诠释，编码组成蛋白质的成蛋白质的第第2222种天然氨基酸吡咯赖氨酸种天然氨基酸吡咯赖氨酸。哺乳动物体内的硒主要以硒代半胱氨酸的形式参与蛋白哺乳动物体内的硒主要以硒代半胱氨酸的形式参与蛋白组成，组成，硒代半胱氨酸硒代半胱氨酸也因其重要性被称作第也因其重要性被称作第2121个氨基酸个氨基酸。第第2121、2222种蛋白质氨基酸种蛋白质氨基酸硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸硒

25、代半胱氨酸、吡咯赖氨酸胱氨酸胱氨酸非编码氨基酸非编码氨基酸羟脯氨酸与羟赖氨酸羟脯氨酸与羟赖氨酸存于纤维蛋白、胶原蛋白存于纤维蛋白、胶原蛋白及植物细胞壁的糖蛋白中及植物细胞壁的糖蛋白中胶原蛋白胶原蛋白三、氨基酸的理化性质三、氨基酸的理化性质(一一)氨基酸的一般物理性质氨基酸的一般物理性质 a-a-氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同。氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同。1.1.熔点熔点:氨基酸氨基酸 熔点较高，一般在熔点较高，一般在200200300300C C。2.2.溶解度溶解度:氨基酸的溶解度差别很大，溶于稀酸稀碱，但不能氨基酸的溶解度差别很大，溶于稀酸稀碱，但不能溶解于

26、有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。3.3.味感味感:各种氨基酸有不同的味感各种氨基酸有不同的味感:甜、鲜、苦、无味。甜、鲜、苦、无味。谷氨酸谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分4.4.旋光性：旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（）表示，右旋者用（+)+)表示。表示。5.光吸收：光吸收：芳香族氨基酸芳香族氨基酸在在pH8pH8时紫外吸收光谱（时紫外吸收光

27、谱（280nm280nm）20种基本氨基酸在可见光区没有光吸收，但在远紫外区种基本氨基酸在可见光区没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。在在280nm处，处，Trp吸收最强，吸收最强，Tyr次之，次之，Phe最弱。最弱。280nm处处光吸收光吸收的测定，是定量蛋白质浓的测定，是定量蛋白质浓度最常用的方法。度最常用的方法。紫外吸收性受溶液紫外吸收性受溶液pH的影响的影响氨基酸在水溶液和结晶都是以氨基酸在水溶液和结晶都是以两性离子两性离子形式存在

28、。形式存在。(二二)氨基酸的酸碱性质（两性解离）氨基酸的酸碱性质（两性解离）正离子正离子两性离子两性离子负离子负离子氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质酸碱性质，是一类两性电是一类两性电解质解质。（1 1）氨基酸的）氨基酸的等电点等电点 pI：1.等电点：等电点：pI(等电点等电点)：指两性电解质所带正负电荷相等时溶液的：指两性电解质所带正负电荷相等时溶液的pH值。值。pI是是pK1和和pK2的算术平均数，的算术平均数，即两性离子两侧的基团的两性离子两侧的基团的pK值之和

29、的一半值之和的一半：pI=（pK1+pK2）/2例例:加入酸或碱使加入酸或碱使Ala净电荷等于净电荷等于0时的时的pH值就是丙值就是丙氨酸氨酸等电点。等电点。pIAla=(2.34+9.69)/2=6.02k1k2Ala+Ala+Ala+/AlaAlaAla-Ala/Ala-2 氨基酸的每一功能基团都能被酸碱所滴定，可根据氨氨基酸的每一功能基团都能被酸碱所滴定，可根据氨基酸的基酸的滴定曲线滴定曲线来推算来推算pKpK值：值：滴定中点时的滴定中点时的pHpH。（2）氨基酸的可解离基团的）氨基酸的可解离基团的pK值。值。pK值为某个可解离基团、值为某个可解离基团、侧链基团侧链基团的解离常的解离常数

30、的负对数。数的负对数。两性离子两侧的两性离子两侧的pK之和的一半之和的一半中性的中性的AA：pI=(pK1+pK2)/2酸性酸性AA:Glu、AsppI=(pK1+pKR)/2碱性碱性AA:Arg、Lys、HispI=(pK2+pKR)/22.AA2.AA等电点的计算等电点的计算中性氨基酸：以中性氨基酸：以GlyGly为例为例 H+2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97GlyK1=GlyH+Gly+K2=Gly-H+GlypIpI时，时，Gly+=Gly-GlyH+K1=GlyK2H+酸性氨基酸，以酸性氨基酸，以AspAs

31、p为例：为例：Asp+Asp-Asp=Asp+碱性氨基酸，以碱性氨基酸，以Lys为例：为例：Lys+结论：结论：在等电点时，氨基酸主要以两性离子存在，在等电点时，氨基酸主要以两性离子存在，但也但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。量的中性分子。pH=pI时时,等电点时的等电点时的pH，氨基酸净电荷为，氨基酸净电荷为零零；pHpI时时，等电点以上的任何等电点以上的任何pH，氨基酸带净氨基酸带净负负电荷，在电场中将向正极移动；电荷，在电场中将向正极移动；pHpI时时，低于等电点的任何低于等电点的任何pH，氨基酸带净氨基酸带净正

32、正电荷，在电场中将向负极移动。电荷，在电场中将向负极移动。在一定在一定pH范围内，氨基酸溶液的范围内，氨基酸溶液的pH离等电点愈离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈多。远，氨基酸所携带的净电荷愈多。1 1、与茚三酮反应、与茚三酮反应-氨基酸与茚三酮试氨基酸与茚三酮试剂共热，可发生反应剂共热，可发生反应生成生成蓝紫色化合物蓝紫色化合物(570nm处测定处测定AA的的含量含量)。蓝紫色化合物蓝紫色化合物(三三)氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质氨氨基基酸酸的的化化学学反反应应 茚三酮反应与茚三酮反应与脯氨酸和羟脯氨酸反应则生脯氨酸和羟脯氨酸反应则生成成黄色化合物黄色化合物，其结构如下所示：，其结构如

33、下所示：反应生成的化合物的反应生成的化合物的颜色深浅程度颜色深浅程度以及以及COCO2 2生成量生成量，均可作为，均可作为氨基酸定量分析依据氨基酸定量分析依据(440nm(440nm处测定脯氨酸处测定脯氨酸和羟脯氨酸含量和羟脯氨酸含量)。2、与亚硝酸反应、与亚硝酸反应含含游离游离-氨基氨基的氨基酸能与亚硝酸起反应，定量地的氨基酸能与亚硝酸起反应，定量地放出放出氮气氮气，氨基酸被氧化成，氨基酸被氧化成羟酸羟酸。在标准条件下测定生。在标准条件下测定生成的成的N2的体积，即可计算的体积，即可计算氨基酸的量氨基酸的量。Van Slyke Van Slyke 氨基氮测定法氨基氮测定法就是根据此反应原理。

34、就是根据此反应原理。蛋白质被水解时，蛋白质被水解时，a a氨基不断增多，与亚硝酸氨基不断增多，与亚硝酸反应放出的氮气量也随之增加。而蛋白质所含的总氮反应放出的氮气量也随之增加。而蛋白质所含的总氮量是不变的。因此通过水解过程中的量是不变的。因此通过水解过程中的a a氨基氮量的氨基氮量的变化以及总氮量的比例关系可以判断蛋白质的水解程变化以及总氮量的比例关系可以判断蛋白质的水解程度。度。含含亚氨基亚氨基的脯氨酸则不能与亚硝酸反应。的脯氨酸则不能与亚硝酸反应。3、Sanger反应（反应（酰基化）酰基化）与与DNFB的反应的反应2,4-二二硝硝基基氟氟苯苯(DNFB)在在弱弱碱碱溶溶液液中中发发生生亲亲

35、核核芳芳香香环环取取代代反反应应生生成成黄黄色色的的2,4-二二硝硝基基苯苯基基氨氨基基酸酸（DNP氨氨基基酸酸），英英国国的的Sanger用用这这个个反反应应来来鉴鉴定定多多肽肽N-未未端端的的氨氨基基酸酸，从从而而测测定定多多肽肽或或蛋蛋白白质质的的AA排序排序。-NH2上上的的N是是一一个个亲亲核核中中心心,能能发发生生亲亲核核取取代代反反应应。H原原子子可可被被酰酰基基、羟羟基基取取代代。多多肽肽的的人人工工合合成成中中被用作氨基保护。被用作氨基保护。DNFBDNP-氨基酸（黄色）氨基酸（黄色）2,4-二硝基苯基氨基酸二硝基苯基氨基酸-氨氨基基酸酸与与异异硫硫氰氰酸酸苯苯酯酯(PITC

36、)（苯苯异异硫硫氰氰酸酸）在在弱弱碱碱条条件件下下形形成成相相应应的的苯苯氨氨基基硫硫甲甲酰酰氨氨基基酸酸(PTC-氨氨基基酸酸)（苯苯异异硫硫氰氰氨氨基基酸酸），与与酸酸发发生生环环化化生生成成苯苯硫硫乙乙内内酰酰脲脲（PTH）。这这是是著著名名的的Edman降降解解，进进行多肽链行多肽链N-未端氨基酸的测定。未端氨基酸的测定。现现在在根根据据此此原原理理设设计计出出了了“蛋蛋白白质质顺顺序序测测定定仪仪”。4、Edman反应反应与苯异硫氰酸（酯）的反应与苯异硫氰酸（酯）的反应与苯异硫氰酸（酯）的反应与苯异硫氰酸（酯）的反应 PITCPTC-氨基酸氨基酸PTH-氨基酸氨基酸异硫氰酸苯酯异硫氰

37、酸苯酯苯异硫氰氨基酸苯异硫氰氨基酸苯氨基硫甲酰苯氨基硫甲酰(PTC)(PTC)衍生物衍生物层析法分离后层析法分离后显色显色，多，多肽链肽链N-N-未端氨基酸的测定未端氨基酸的测定氨基乙内酰苯硫脲氨基乙内酰苯硫脲5、与丹黄酰氯的反应与丹黄酰氯的反应:氨基酸与氨基酸与5一二甲氨基萘磺酰氯（简称丹黄酰氯，一二甲氨基萘磺酰氯（简称丹黄酰氯，dansylchloride,或用或用DNS-Cl表示）反应，生成丹黄酰表示）反应，生成丹黄酰氯的衍生物。氯的衍生物。具有很强的荧光，可用于微量分析或肽具有很强的荧光，可用于微量分析或肽链氨基末端氨基酸顺序分析。链氨基末端氨基酸顺序分析。6、与甲醛反应：与甲醛反应：

38、氨基酸在溶液中有如下平衡氨基酸在溶液中有如下平衡：甲醛滴定法：甲醛滴定法：NHNH3+3+是一个弱酸，完全电离是的是一个弱酸，完全电离是的pHpH约在约在12121313，用一般的指示剂很难准确判断其滴定的终点，一般不能直，用一般的指示剂很难准确判断其滴定的终点，一般不能直接用酸碱滴定法来定量测定氨基酸。在中性接用酸碱滴定法来定量测定氨基酸。在中性 pHpH和常温下甲醛能和常温下甲醛能很快与氨基酸的很快与氨基酸的a-a-氨基结合，产生羟化物。羟基诱导电子使氮氨基结合，产生羟化物。羟基诱导电子使氮上的电子密度降低，氮不再吸引质子，质子游离出来，使平衡上的电子密度降低，氮不再吸引质子，质子游离出来

39、，使平衡向右移动，促使向右移动，促使NHNH3+3+释放出质子，使溶液酸性增加，滴定的终释放出质子，使溶液酸性增加，滴定的终点移动到点移动到pH9pH9左右，这时可用酚酞作指示剂，用氢氧化钠滴定。左右，这时可用酚酞作指示剂，用氢氧化钠滴定。每放出一个质子就相当于一个氨基酸。每放出一个质子就相当于一个氨基酸。二羟二羟 甲醛滴定法甲醛滴定法不仅用于不仅用于测定氨基酸含量测定氨基酸含量，也常用来，也常用来测定测定蛋白质水解程度蛋白质水解程度。7 7、与荧光胺反应、与荧光胺反应 氨基酸可与荧光胺反应，产生氨基酸可与荧光胺反应，产生荧光产物荧光产物，可用可用荧光分光光度计测定氨基酸含量荧光分光光度计测定

40、氨基酸含量。AA的的-羧基：羧基：成盐和成酯反应成盐和成酯反应：在在HCl（干燥）存在下与无水甲醇（乙醇）（干燥）存在下与无水甲醇（乙醇）作用即生成氨基甲酯（乙酯）作用即生成氨基甲酯（乙酯）（保护羧基，突出氨基）（保护羧基，突出氨基）。氨基氨基酸与酸与NaOH反应即得到氨基钠盐。反应即得到氨基钠盐。脱羧基反应脱羧基反应:AAAA在在生生物物体体内内经经AAAA脱脱羧羧酶酶作作用用，放放出出二二氧氧化化碳碳并并生成相应的一级胺。生成相应的一级胺。成酰胺反应成酰胺反应:AA与与氨氨作作用用可可形形成成氨氨基基酸酸的的酰酰胺胺，为为生生物物体体储储NH3的主要反应。的主要反应。动、植物体内的动、植物

41、体内的Gln、Asn可以由这种反应形成。可以由这种反应形成。成肽反应成肽反应:-羧基、羧基、-氨基氨基侧链侧链R基参加的主要反应基参加的主要反应:-SH的氧化还原的氧化还原;酚基的酚基的Millon反应反应(Tyr+米伦试剂产生红米伦试剂产生红色色);Folin一酚反应一酚反应(Tyr或或Trp+磷钼酸磷钼酸蓝色蓝色)等等1 1.纸层析法：分配系数纸层析法：分配系数2.2.薄层层析法：定性。薄层层析法：定性。原理因所用薄层的原料而不同。用氧化铝原理因所用薄层的原料而不同。用氧化铝等吸附剂则是吸附层析；若用纤维素或硅藻土则属分配层析等吸附剂则是吸附层析；若用纤维素或硅藻土则属分配层析3 3.离子

42、交换柱层析法：电荷离子交换柱层析法：电荷 5 5.纸电泳纸电泳 四、氨基酸的分离与分析四、氨基酸的分离与分析 在蛋白质组成分析、氨基酸顺序分析，水解制备氨基酸在蛋白质组成分析、氨基酸顺序分析，水解制备氨基酸或微生物发酵生产氨基酸时要进行氨基酸的分离、分析和纯或微生物发酵生产氨基酸时要进行氨基酸的分离、分析和纯化。主要根据被分析样品的（如化。主要根据被分析样品的（如aaaa混合物）混合物）分配系数、所带分配系数、所带电荷、分子大小等电荷、分子大小等不同而达到分离的目的不同而达到分离的目的 ：4 4.高效液相层析法：电荷、分配系数高效液相层析法：电荷、分配系数柱柱固定相装于柱内固定相装于柱内纸固定

43、相是液体，吸附在固定相是液体，吸附在滤纸上，将上，将样品品点在点在纸上，用流上，用流动相展开相展开薄薄层将有适当粘度的固定相涂在薄板上将有适当粘度的固定相涂在薄板上薄膜薄膜与与纸层析相似，析相似，纸用其它高分子有机吸附用其它高分子有机吸附剂代替代替层析按支持物分：层析按支持物分：吸附吸附固体固体吸附能力不同吸附能力不同分配分配液体液体分配系数不同分配系数不同离子交离子交换 离子交离子交换剂亲和性不同和性不同凝胶凝胶多孔凝胶多孔凝胶通通过速度不同速度不同亲和和固定相只能与一种固定相只能与一种组分分结合，合，分开其它无分开其它无亲和力的和力的组分分 固定相固定相 各组分对固定相各组分对固定相按层析

44、原理分按层析原理分：分配柱层析分配柱层析填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、淀粉、硅胶等，收集的组分用茚三酮淀粉、硅胶等，收集的组分用茚三酮显色定量。显色定量。纸层析：纸层析：固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，用流动相展开。用流动相展开。单向纸层析图单向纸层析图RfRf值值 薄层层析：薄层层析：将有适当粘度的固定相涂在薄板上将有适当粘度的固定相涂在薄板上 离子交换层析离子交换层析 原理原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离离子交换树脂上的活性基团子交

45、换树脂上的活性基团与与溶液中的离子溶液中的离子进行进行交换反应交换反应，由于各，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低离子交换

46、剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。值。阳离子交换树脂：活性基团是酸性的阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基，如磺酸基-SOSO3 3H H强酸型）强酸型），羧基，羧基-COOHCOOH（弱酸型）弱酸型）阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：活性基团是碱性的活性基团是碱性的，如季胺基，如季胺基-N N+(CH(CH3 3)3 3OHOH-离子交换层析离子交换层析高效液相层析（高效液相层析（highperformance(pressure)liguidchromato

47、graphy,HPLC）HPLC的特点的特点:HPLC分离氨基酸的灵敏度高，可达到10-12mol水平固相支持物颗粒小，比表面积大溶剂系统采用高压，洗脱速度快洗脱速度快适于各种类型的支持物的柱层析HPLC常用的层析柱：反相柱和正向柱两种常用的层析柱：反相柱和正向柱两种五、氨基酸的制备五、氨基酸的制备氨氨基基酸酸在在生生物物体体内内具具有有重重要要的的生生理理功功能能：组组成成蛋蛋白白质质；充充当当化化学学信信号号分分子子：5-5-羟羟色色胺胺、褪褪黑黑激激素素，都都是是神神经经递递质质；甲甲状状腺腺素素（TyrTyr衍衍生生物物），吲吲哚哚乙乙酸酸（TrpTrp衍衍生生物物）都都是是激激素素；

48、许许多多含含N N分分子子的的前前体体物物：含含氮氮碱碱基基、血血红红素素、叶叶绿绿素素的的合合成成都都需需要要AAAA；是是重重要要的的代代谢谢中中间间物物：精精氨氨酸酸、瓜瓜氨氨酸酸、鸟鸟氨氨酸酸是是尿尿素素循循环环的的中中间间物物；特特殊殊的的生生理理作作用用，参参与与代代谢谢作作用用，治治疗疗疾疾病病；用用于于食食品品加加工工：强强化化剂剂、调调味味剂剂、着着色色剂剂、甜甜味味剂剂和和增增味味剂剂；饲饲料料添添加加剂剂；调调节节皮皮肤肤pHpH和和保护皮肤保护皮肤的功能的功能。制备氨基酸有制备氨基酸有4 4种途径：种途径：从蛋白质水解液中分离提取；从蛋白质水解液中分离提取；应用发酵法生

49、产应用发酵法生产；应用酶的催化反应生成氨基酸应用酶的催化反应生成氨基酸；有机合成法有机合成法。适宜于中适宜于中小规模的生产小规模的生产可大规模可大规模生产生产2.3 2.3 肽肽l肽的基本概念肽的基本概念l肽命名肽命名l动植物体内重要的肽动植物体内重要的肽谷胱甘肽谷胱甘肽（简称（简称GSHGSH）l肽类的应用和发展前景肽类的应用和发展前景一、肽的基本概念一、肽的基本概念1.1.肽肽:一一分分子子氨氨基基酸酸的的-羧羧基基与与另另一一氨氨基基酸酸的的-氨氨基基脱脱水水缩合而成的化合物叫做肽。缩合而成的化合物叫做肽。蛋蛋白白质质是是多多个个氨氨基基酸酸分分子子通通过过酰酰胺胺键键（蛋蛋白白质质化化

50、学学中中将这类酰胺键专称为肽键）连接而成的生物大分子。将这类酰胺键专称为肽键）连接而成的生物大分子。肽键肽键 -CO-NH-CO-NH-肽键的肽键的特点：特点：是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的肽键中的C-NC-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。在大多数情况下，以反式结构存在。在细胞内环境条件下，肽键相对稳定在细胞内环境条件下，肽键相对稳定2.2.几个相关的概念几个相关的概念氨基酸残基氨基酸残基(amino