生化大实验实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳.ppt

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1、纯度检测：1.SDS-PAGE测定LDL纯度2.双向免疫扩散测定LDL纯度含量测定：1.Folin-酚试剂法测定LDL含量 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分聚丙烯酰胺凝胶电泳分析析LDL纯度纯度一、目的要求一、目的要求1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质技术电泳概述：电泳：电泳：带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，如带正电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。影响电泳的主要因素：影响电泳的主要因素：1）电泳介质的pH 2）缓冲液的离子强度 3）电场强度 4）电渗作用5）对支持物的选择 6）温度对电泳的影响 电泳分类：电泳

2、分类：按原理分：区带电泳、移界电泳、等速电泳、聚焦电泳二、二、原理原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(APS)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的区带电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，

3、且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA)104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6聚丙烯酰

4、胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3图2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝6.上贮槽 7.冷凝系统 图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 3.短玻璃板 4.凹形橡胶框 返回不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-H

5、C1。分离胶是由APS催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。不连续凝胶分离蛋白质原理：（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解

6、离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应 图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。图5 不连续系统浓缩效应示意图 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状

7、无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。SDS的作用 SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷和形状的影响，电泳速度只与蛋白质的分子量有关。蛋白质染色常用蛋白质染色的几种方法：常用蛋白质染色的几种方法：1）氨基黑10B2）考马斯亮蓝R2503）考马斯亮蓝 G2504）固绿5）荧光染料：（l）丹磺酰氯

8、（2，5-二甲氨基萘磺酰氯，简称DNS-Cl）：（2）荧光胺：（3）2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮（MDPF）：（4）1-苯胺基-8-萘磺酸（简称 ANS）：6）银染色法常用脂蛋白染色方法：常用脂蛋白染色方法：1）油红）油红O染色染色2）苏丹黑苏丹黑 B三、试剂与器材三、试剂与器材试剂：10%SDS、分离胶胶贮液（30ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9TrisHCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH6.7TrisHCl 缓冲液）、10%过硫酸铵（APS)、1%四基乙二胺（TEMED）及原液、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、0.0

9、5考马斯亮兰R250染色液、脱色液、水饱和正丁醇、50%丙三醇器材：稳压稳流电泳仪、脱色摇床、垂直板电泳槽、电泳槽配件（玻板、T型条、十孔梳、棕色梳、加样指示板）、烧杯、试管、微量移液器、微量进样器五、五、操作方法操作方法1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)旋松固定螺丝并打开电泳槽，仰放在桌面上。(2)在长、短玻璃板间加T型条，短玻璃板在下放入硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。(3)将电泳槽两侧固定螺丝以对角线的方式旋紧。(4)竖直电泳槽，在长短玻璃板间加蒸馏水检漏。2.配胶：SDS-不连续体系凝胶配制20ml分离胶（7.5%）所需试剂用量（ml）分离胶胶贮液30ACr-0.8%Bi

10、s 5.00分离胶缓冲液 pH8.9TrisHCl 2.5010%SDS 0.201%TEMED 2.00双蒸水 10.210%过硫酸铵（APS)0.105%浓缩胶所需试剂用量（ml）分离胶胶贮液30ACr-0.8%Bis 0.65浓缩胶缓冲液 pH6.7TrisHCl 1.0010%SDS 0.08TEMED原液 0.00550%丙三醇 2.3010%过硫酸铵（APS)0.063.制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度依据电泳槽标记，约7ml。并在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层水饱和正丁醇(约34 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60

11、 min凝胶完全聚合，因聚合过程析出水，可看到胶面增加一条界面线。将凝胶表面的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.2 cm处，轻轻加入样品槽模板即十孔梳。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，拔出梳子，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，即可加样。4.样品的处理及加样 将样品按0.51 mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。用微量进样器取25 l上述混合液，通过缓冲液

12、，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。5.电泳盖上电泳槽盖子，将电泳仪的正极与电泳槽红色连线连接，负极与黑色连线连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。6.染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用棕色梳撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，加入染色液染色1 h，再用脱色液脱色过夜，直至蛋白质区带清晰，即可观察蛋白质纯度或计算相对迁移率。7.结果观察与处理：量出加样端距电泳溴酚兰前沿的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:相对迁

13、移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)六、注意事项六、注意事项（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝（对角旋紧），避免缓冲液渗漏。（2）上层浓缩胶聚合快，加入10%APS后快速混匀，及时转移至玻板之间，并快速插入十孔梳，以免样品孔变形。（3）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。七、复习题七、复习题影响电泳的主要因素有哪些？影响电泳的主要因素有哪些？什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳？聚丙烯酰胺凝胶聚合时自由基的引发有哪两种方聚丙烯酰胺凝胶聚合时自由基的引发有哪两种方法？法？不连续凝胶电泳的分离原理。不连续凝胶电泳的分离原理。请说出常用蛋白质染色的几种方法请说出常用蛋白质染色的几种方法。请说出常用脂蛋白染色方法。请说出常用脂蛋白染色方法。SDS在在SDS-PAGE中的作用。中的作用。请叙述一下血浆载脂蛋白请叙述一下血浆载脂蛋白B-100的分离纯化过程。的分离纯化过程。蛋白质含量测定方法有哪些？简述其原理。蛋白质含量测定方法有哪些？简述其原理。双向免疫扩散测定LDL纯度原理。