实验蔗糖酶的提取精.ppt

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1、实验蔗糖酶的提取第1页，本讲稿共25页杨劲树生命科学学院416室电话：88206155E-mail:公邮：(课件/通知，密码biochem3yang)第2页，本讲稿共25页实验内容安排实验内容安排1 1、蔗糖酶的提取、蔗糖酶的提取2 2、离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶、离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶3 3、蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶蛋白含量的测定Folin-Folin-酚法酚法4 4、蔗糖酶活力测定、蔗糖酶活力测定3.53.5二硝基水杨酸法二硝基水杨酸法5 5、蔗糖酶分离纯化产物的、蔗糖酶分离纯化产物的SDSSDSPAGEPAGE检测分析及蛋白质相对检测分析及蛋白质相对分子质量测定分子质量测定6

2、 6、质粒、质粒DNADNA的微量制备及电泳检测的微量制备及电泳检测7 7、氨基移换反应及其产物的鉴定、氨基移换反应及其产物的鉴定第3页，本讲稿共25页实验所涉及的技术实验所涉及的技术破碎技术破碎技术离心技术离心技术层析技术层析技术光谱分析技术光谱分析技术电泳技术电泳技术发光分析技术发光分析技术生物大分子制备技术生物大分子制备技术第4页，本讲稿共25页实验报告写作要求实验报告写作要求1 1、实验目的和要求、实验目的和要求2 2、实验内容和原理、实验内容和原理3 3、实验材料和主要仪器、实验材料和主要仪器4 4、实验方法和步骤、实验方法和步骤5 5、实验数据记录和处理、实验数据记录和处理6 6、

3、实验结果和分析、实验结果和分析7 7、实验讨论和心得、实验讨论和心得*每人准备一本每人准备一本实验记录本实验记录本，做好实验预习、实验过程和实验原始数据的记，做好实验预习、实验过程和实验原始数据的记录。请保存好，实验结束后上交，作为实验报告成绩的一部分！录。请保存好，实验结束后上交，作为实验报告成绩的一部分！第5页，本讲稿共25页实验成绩实验成绩1 1、实验报告成绩（纸质版）、实验报告成绩（纸质版）70702 2、实验平时成绩、实验平时成绩 3030(1)(1)到课情况（签到、迟到、早退和请假）到课情况（签到、迟到、早退和请假）(2)(2)实验操作，器材、仪器使用实验操作，器材、仪器使用(3)

4、(3)值日情况值日情况(4)(4)实验预习、实验过程和实验记录（实验记录本）实验预习、实验过程和实验记录（实验记录本）第6页，本讲稿共25页学生实验管理办法学生实验管理办法 为了把学生逐渐培养成在实验室中做实验的良好习惯；同时，为了更为了把学生逐渐培养成在实验室中做实验的良好习惯；同时，为了更好地保证学生实验的正常进行，本实验室特制定以下管理办法。请在实验好地保证学生实验的正常进行，本实验室特制定以下管理办法。请在实验室做实验的同学严格按以下要求做，并请实验教师和实验技术人员协助管室做实验的同学严格按以下要求做，并请实验教师和实验技术人员协助管理。理。第7页，本讲稿共25页一一.实验器材使用实

5、验器材使用1 1学生实验时一般每人配备一套学生实验时一般每人配备一套玻璃器具玻璃器具。实验前应根据。实验前应根据“玻璃器具玻璃器具清单清单”清点器具是否齐全，有无缺损，如有缺损请及时向老师报清点器具是否齐全，有无缺损，如有缺损请及时向老师报告、登记并补足，缺损器具由上一实验班的同学负责。告、登记并补足，缺损器具由上一实验班的同学负责。2 2在实验过程中，应小心使用玻璃器具，如有破损请及时报告老在实验过程中，应小心使用玻璃器具，如有破损请及时报告老师，登记后补上，破损器具由本人负责，并按规定处理。师，登记后补上，破损器具由本人负责，并按规定处理。3 3实验结束后，应把使用过的玻璃器具清洗干净，并

6、放回自己的玻璃器具实验结束后，应把使用过的玻璃器具清洗干净，并放回自己的玻璃器具箱柜中锁好，如有缺损及时登记补足，损失由本人负责。箱柜中锁好，如有缺损及时登记补足，损失由本人负责。4 4对公用实验器材，使用时要爱护和珍惜。如有损坏，则由损坏者负责赔对公用实验器材，使用时要爱护和珍惜。如有损坏，则由损坏者负责赔偿。偿。第8页，本讲稿共25页二实验仪器使用二实验仪器使用1 1学生实验使用仪器前，应在教师讲解了学生实验使用仪器前，应在教师讲解了使用方法使用方法后，或在已学会如后，或在已学会如何使用的情况下，方可自己单独操作有关仪器；如违反操作规程，将何使用的情况下，方可自己单独操作有关仪器；如违反操

7、作规程，将仪器损坏，应由当事人按规定处理。仪器损坏，应由当事人按规定处理。2 2仪器如果仪器如果以小组为单位以小组为单位共同使用，某一同学如出现不当操作损坏仪器，共同使用，某一同学如出现不当操作损坏仪器，则以小组为单位共同赔偿损失。则以小组为单位共同赔偿损失。3 3如因教师没有讲解好仪器的使用方法等原因造成学生损坏仪器，应由如因教师没有讲解好仪器的使用方法等原因造成学生损坏仪器，应由教师负全责，并按规定处理。教师负全责，并按规定处理。4 4仪器使用结束后，请使用人及时在仪器使用结束后，请使用人及时在仪器登记本仪器登记本上记录仪器使用情上记录仪器使用情况，如仪器使用有问题应马上向教师报告。况，如

8、仪器使用有问题应马上向教师报告。第9页，本讲稿共25页三实验安全与习惯三实验安全与习惯1 1在实验中使用在实验中使用有毒、有害、腐蚀性和挥发刺激性试剂有毒、有害、腐蚀性和挥发刺激性试剂时，一定时，一定 要谨慎操作，做好防护措施，如戴手套，在通风柜中使用等。要谨慎操作，做好防护措施，如戴手套，在通风柜中使用等。2 2实验时如不慎将有毒、有害、腐蚀性试剂洒在实验桌或地上，实验时如不慎将有毒、有害、腐蚀性试剂洒在实验桌或地上，应及时处理好桌面及地面，以免影响自身和他人的安全。应及时处理好桌面及地面，以免影响自身和他人的安全。3 3对于使用过有毒、有害、腐蚀性试剂的实验器材，应及时清洗对于使用过有毒、

9、有害、腐蚀性试剂的实验器材，应及时清洗 处理，不要影响后面的实验安全。处理，不要影响后面的实验安全。4 4如在实验中使用如在实验中使用易燃易爆试剂、带有细菌的物品和放射性同位易燃易爆试剂、带有细菌的物品和放射性同位 素素，应严格按安全规定操作。，应严格按安全规定操作。5 5使用实验仪器时，应注意使用实验仪器时，应注意用电用电安全；实验仪器使用结束后，应安全；实验仪器使用结束后，应 及时关闭电源。及时关闭电源。6 6严禁在实验室吸烟。严禁在实验室吸烟。7 7禁止在实验室用电炉或明火取暖。禁止在实验室用电炉或明火取暖。8 8实验时，应保持实验时，应保持桌面桌面的整洁不乱；实验结束后，应将自己的桌的

10、整洁不乱；实验结束后，应将自己的桌 面收拾干净方可离开实验室。面收拾干净方可离开实验室。第10页，本讲稿共25页9 9在每次实验结束后，安排在每次实验结束后，安排卫生值日卫生值日的同学应自觉地完成以下的同学应自觉地完成以下 工作：工作：收理实验用试剂、器材和仪器。收理实验用试剂、器材和仪器。将实验桌上的废液缸中的废物倒掉洗净，并把桌面擦干净。将实验桌上的废液缸中的废物倒掉洗净，并把桌面擦干净。把使用过的仪器及仪器桌面擦拭干净。把使用过的仪器及仪器桌面擦拭干净。把实验室的地面扫清拖净。把实验室的地面扫清拖净。将实验室产生的实验废物和垃圾倒掉。对于不能做好值日工作将实验室产生的实验废物和垃圾倒掉。

11、对于不能做好值日工作 的同学，下次实验后应补做。的同学，下次实验后应补做。第11页，本讲稿共25页四其他四其他上实验课请不要迟到早退，如有事请向任课老师事先请假或上实验课请不要迟到早退，如有事请向任课老师事先请假或 事后说明。事后说明。在实验室里上课时不要玩电脑游戏。在实验室里上课时不要玩电脑游戏。进入实验室要衣着整洁，进入实验室要衣着整洁，要求穿实验服做实验要求穿实验服做实验，不能穿拖鞋，不能穿拖鞋 进实验室做实验。实验过程中不要随便串走，保持安静，不进实验室做实验。实验过程中不要随便串走，保持安静，不 要喧哗。要喧哗。请不要在实验室里吃零食或用膳。请不要在实验室里吃零食或用膳。第12页，本

12、讲稿共25页生物实验教学中心网址生物实验教学中心网址http:/ 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。第15页，本讲稿共25页细细胞胞破破碎碎的的常常用用方方法法机械法机械法非机械法非机械法液体剪切法液体剪切法固体剪切法固体剪切法超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法压力和研磨压力和研磨物理法、化学渗透法、酶溶法物理法、化学渗透法、酶溶法实验基本原理实验基本原理1 1、酵母细胞破碎、酵母细胞破碎 本实验采用本实验采用研磨研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶的方法。通过固体剪切法（研磨）将

13、酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。从酵母细胞中提取出来。第16页，本讲稿共25页2 2、蔗糖酶的初步分离纯化、蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用本实验采用选择性变性选择性变性（加热）、（加热）、有机溶剂有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的

14、活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。纯效果。第17页，本讲稿共25页实验材料与试剂实验材料与试剂1 1、实验材料：、实验材料：市售干酵母粉市售干酵母粉2 2、实验试剂：、实验试剂：石英砂石英砂 95%95%乙醇乙醇(-20(-20）20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液缓冲液第18页，本讲稿共25页实验器材与仪器实验器材与仪器1 1、电子天平（称量样品）、电子天平（称量样品）2 2、研砵（每组一套）、研砵（每组一套）3 3、50ml50m

15、l高速离心管（高速离心管（4 4支支/组、离心管架组、离心管架1 1个个/组）组）4 4、托盘天平（离心管平衡用）、托盘天平（离心管平衡用）5 5、高速冷冻离心机、高速冷冻离心机6 6、恒温水浴箱（、恒温水浴箱（5050）7 7、制冰机、制冰机8 8、1.5ml1.5ml离心管（留样品离心管（留样品、用）及离心管架用）及离心管架 9 9、2020冰箱冰箱第19页，本讲稿共25页实验操作方法和步骤实验操作方法和步骤 分组操作：每组分组操作：每组3 34 4人人1 1、酵母细胞破碎、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉称取市售干酵母粉10g10g，约，约3g3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可石英砂放入研

16、钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约能成细粉末状（约1515分钟），量取总体积分钟），量取总体积50ml50ml的的20mmol/L Tris-20mmol/L Tris-HCl pH7.3 HCl pH7.3 缓冲液，分缓冲液，分2 2次加在研砵内研磨次加在研砵内研磨1010分钟，使呈糊状液体；分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到将糊状液体转移到2 2支支50ml50ml离心管中，两支离心管平衡后，离心管中，两支离心管平衡后，44、12000r/min12000r/min离心离心1515分钟，分钟，收集上清液并量出体积收集上清液并量出体积V1V1（样品（样品I I）,另留另留1ml1ml上清液

17、（样品上清液（样品I I）放置）放置2020冰箱保存冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和蔗糖酶活力测定和SDS-PAGESDS-PAGE分析。分析。第20页，本讲稿共25页2 2、热处理、热处理 将上一步抽提液（样品将上一步抽提液（样品I I），迅速放入），迅速放入5050恒温水浴中，保温恒温水浴中，保温3030分分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却保温后迅速用冰浴冷却5 5分钟分钟，转移，转移至两支至两支50ml50ml离心管中，平衡后，离心管中，平衡后，4 4，1500015000r/minr/min离心

18、离心1515分钟，分钟，收集上清液并量出上清液体积收集上清液并量出上清液体积V2V2（样品（样品），另留），另留1ml1ml上清液（样品上清液（样品）放置）放置2020冰箱保存冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和活力和SDS-PAGESDS-PAGE分析。分析。第21页，本讲稿共25页3 3、有机溶剂（乙醇）沉淀：、有机溶剂（乙醇）沉淀：上清液（样品上清液（样品）加入相同体积的）加入相同体积的2020的的95%95%乙醇，冰浴中温乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置和搅动混匀，至少放置3030分钟，然后转移至两支分钟，然后转移至两支50ml50m

19、l离心管中，两离心管中，两支离心管平衡后，支离心管平衡后，44，12000r/min12000r/min离心离心1010分钟，弃去上清液，分钟，弃去上清液，沉淀沉淀放置放置2020冰箱保存冰箱保存，以备用于下周实验。，以备用于下周实验。第22页，本讲稿共25页实验步骤实验步骤研磨破碎，离心，转上清（体积），留样品（1.5ml离心管）50热处理转冰浴，离心，转上清（体积），留样品（1.5ml离心管）95%乙醇冰浴沉淀，离心，弃上清，留沉淀（原50ml离心管）第23页，本讲稿共25页下下 次次 实实 验验实验二实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶预习参考资料预习参考资料李建武等李建武等 生物化学实验原理和方法生物化学实验原理和方法 北京大学出版社北京大学出版社 赵永芳赵永芳 生物化学技术原理及应用（第三版）生物化学技术原理及应用（第三版）科学出版社科学出版社第24页，本讲稿共25页值日生值日生杨贤鹏杨贤鹏刘甲锋刘甲锋王玉宇王玉宇刘未了刘未了第25页，本讲稿共25页