实验六细胞器的分离与观察精.ppt

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1、实验六细胞器的分离与观察第1页，本讲稿共27页一、实验目的一、实验目的o了解细胞器的分离原理了解细胞器的分离原理o掌握差速离心和密度梯度离心技术掌握差速离心和密度梯度离心技术第2页，本讲稿共27页二、实验原理二、实验原理o细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组

2、分即从细胞中释放出来。细胞中释放出来。o细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有的方法有差速离心和密度梯度离心差速离心和密度梯度离心两种。两种。第3页，本讲稿共27页o分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包

3、括组织括组织细胞匀浆细胞匀浆、分级分离分级分离和和分析分析三步，这种方法三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。能的主要手段。第4页，本讲稿共27页 (1)(1)细胞匀浆细胞匀浆(Homogenization)(Homogenization)：低温条件下，将组：低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即即0.25mol0.25molL L蔗糖蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。物的匀浆。第5页，本讲稿共27页 (2)(

4、2)分级分离分级分离(Fractionation)(Fractionation)：由低速到高速离心逐渐沉降。：由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬得到的第一

5、次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化浮和离心加以纯化.第6页，本讲稿共27页 (3)(3)分析分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方：分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。法进行形态和功能鉴定。第7页，本讲稿共27页UnnaUnna染色法（甲基绿染色法（甲基绿-派洛宁染色）派洛宁染色）细胞核分析：细胞核分析：甲基绿甲基绿-派洛宁对派洛宁对DNADNA和和RNARNA有选择性的染色有选择性的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲基绿和派洛宁效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。

6、的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNADNA被甲基绿染成绿色，被甲基绿染成绿色，RNARNA被派洛宁染成红色，这样就能被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。使细胞中两种核酸分布显示出来。第8页，本讲稿共27页第9页，本讲稿共27页 活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的部分，主要是染料的“电化学电化学”特性起重要作用。特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子现带有阴离子，而被染的部分

7、本身也是具有阴离子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用。或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用。第10页，本讲稿共27页中性红中性红-詹纳斯绿染色詹纳斯绿染色 线粒体分析线粒体分析：詹纳斯绿（：詹纳斯绿（Janus green BJanus green B）是对线）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。由解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化酶系，能使詹纳斯绿于线粒体内具有细胞色素氧化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿色）。中性红为弱碱性染保持在

8、氧化状态（淡蓝绿色）。中性红为弱碱性染料，对液泡系料，对液泡系(即高尔基体即高尔基体)的染色有专一性，将活的染色有专一性，将活细胞中的液泡系染红色。细胞中的液泡系染红色。第11页，本讲稿共27页洋葱内表皮细胞的线粒体分布洋葱内表皮细胞的线粒体分布第12页，本讲稿共27页植物根尖液泡的中性红染色植物根尖液泡的中性红染色第13页，本讲稿共27页三、材料和试剂三、材料和试剂o材料：小鼠的肝脏材料：小鼠的肝脏o器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、EppendorfEppendorf管、管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器o

9、试剂：生理盐水、试剂：生理盐水、0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液、蔗糖溶液、0.34mol/L0.34mol/L蔗蔗糖溶液糖溶液-0.5mmol/Mg-0.5mmol/Mg（Ac)Ac)2 2溶液、溶液、0.88mol/L0.88mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液-0.5mmol/Mg0.5mmol/Mg（Ac)Ac)2 2溶液、溶液、95%95%乙醇溶液、丙酮、乙醇溶液、丙酮、PBSPBS液、液、甲基绿甲基绿-派洛宁染液、中性红派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。詹纳斯绿染液。第14页，本讲稿共27页四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤o1.1.细胞核的分离细胞核的分离 （1 1）组织匀浆

10、）组织匀浆:将饥饿将饥饿24h24h的大白鼠处死的大白鼠处死,立即剪开腹部立即剪开腹部,迅迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污洗去血污,用滤纸吸干。用滤纸吸干。称取称取0.5g0.5g肝组织肝组织,在小烧杯中剪碎在小烧杯中剪碎,用预冷的用预冷的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织倒入匀浆管中进行匀溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织倒入匀浆管中进行匀浆浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀浆完毕匀浆过程要在冰浴中进行。匀浆完毕,移入移入1.5ml1.5ml离心离心管中。管中。第15页，本讲稿共27页 （2 2）离心：低温离心机

11、（）离心：低温离心机（4 4）中进行。）中进行。每次离每次离心前一定要在天平（心前一定要在天平（托盘天平托盘天平）上将两离心管配）上将两离心管配平。第一次以平。第一次以600g(3005rpm)600g(3005rpm)离心离心10min10min。将其上清。将其上清夜移入夜移入EppendorfEppendorf管中，盖好盖子置于冰浴中，留待管中，盖好盖子置于冰浴中，留待后面使用（后面使用（分离线粒体分离线粒体）。沉淀使用）。沉淀使用1ml1ml预冷的预冷的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤蔗糖溶液离心洗涤2 2次，每次次，每次1000g(3880rpm)1000g(388

12、0rpm)离心离心10min10min。第16页，本讲稿共27页 （3 3）纯化：将沉淀用）纯化：将沉淀用5 5倍体积倍体积0.34mol/L0.34mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液-0.5mmol/Mg0.5mmol/Mg（Ac)Ac)2 2溶液混悬，用长针头注射器再混悬溶液混悬，用长针头注射器再混悬液下轻轻加入液下轻轻加入4 4倍体积倍体积0.88mol/L0.88mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液-0.5mmol/Mg0.5mmol/Mg（Ac)Ac)2 2溶液。尽量使两种溶液明显分层。溶液。尽量使两种溶液明显分层。以以1500g(4752rpm)1500g(4752rpm)离心离心151520min

13、20min。弃上清液弃上清液，沉淀，沉淀即为经过纯化的细胞核，用即为经过纯化的细胞核，用PBSPBS溶液悬浮，溶液悬浮，4 4C C保存。保存。第17页，本讲稿共27页o细胞经甲基绿细胞经甲基绿-派洛宁混合液处理后，其中的派洛宁混合液处理后，其中的DNADNA和和RNARNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力，荷的核酸对碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的的DNADNA呈蓝绿色，派洛宁染低聚分子的呈蓝绿色，派洛宁

14、染低聚分子的RNARNA呈红色。呈红色。第18页，本讲稿共27页下次实验内容：下次实验内容：（4 4）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干燥。将）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干燥。将干燥的涂片浸入干燥的涂片浸入9595乙醇溶液固定乙醇溶液固定5min5min，晾干，滴加甲，晾干，滴加甲基绿基绿-派洛宁染液染色派洛宁染液染色202030min30min，丙酮分色，丙酮分色30s30s，蒸馏，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检。水漂洗，滤纸吸干水，镜检。核核DNADNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNARNA呈红色。呈红色。第19页，本讲稿共27页六、实验报告六

15、、实验报告o1.1.线粒体提取分离过程中，为什么要在线粒体提取分离过程中，为什么要在0 044进行？进行？o2.2.要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实际体会，写鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。出操作注意事项及改进方法。o3.3.分离介质分离介质 0.34mol/L 0.34mol/L及及 0.88mol/L 0.88mol/L缓冲蔗糖溶液哪缓冲蔗糖溶液哪一种在下层一种在下层?有什么作用有什么作用?第20页，本讲稿共27页2.2.线粒体的分离线粒体的分离o(1

16、)(1)分离分离:将分离细胞核时收集的上清液以将分离细胞核时收集的上清液以10000g(12270rpm)10000g(12270rpm)离心离心10min10min。沉淀用预冷。沉淀用预冷0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液悬浮蔗糖溶液悬浮,10000g,10000g离心离心10min,10min,反复反复2 2次。次。o(2)(2)鉴定鉴定:在干净的载玻片中央滴加在干净的载玻片中央滴加1 12 2滴滴中性红中性红-詹纳斯绿染液詹纳斯绿染液,用牙签挑取沉淀物均匀涂片用牙签挑取沉淀物均匀涂片。盖上盖片盖上盖片,染色染色5min,5min,镜检镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。线粒体蓝

17、绿色，呈小棒状或圆形。第21页，本讲稿共27页五、实验结果五、实验结果o核核DNADNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNARNA呈呈红色。红色。o线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。o观察每个视野中所见完整细胞核和线粒体的观察每个视野中所见完整细胞核和线粒体的数量及纯度。数量及纯度。第22页，本讲稿共27页差速离心差速离心（differential centrifugationdifferential centrifugation）o主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起

18、始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。颗粒的目的。第23页，本讲稿共27页第24页，本讲稿共27页 沉淀沉淀 转速转速x x时间时间 内内 容容 物物 A A150g x 20min150g x 20min完整细胞完整细胞 B B1000g x 20min 1000g x 20min 细胞核，细胞碎片细胞核，细胞碎

19、片C C3000g x 6min 3000g x 6min 叶绿体叶绿体 D D10000g x20min 10000g x20min 线粒体、溶酶体、微体线粒体、溶酶体、微体 E E105000g x120min105000g x120min微粒体微粒体 F F105000g x 20min 105000g x 20min 0.26%脱氧胆酸脱氧胆酸纳纳 核糖体核糖体 第25页，本讲稿共27页密度梯度离心密度梯度离心（density gradient centrifugationdensity gradient centrifugation）o用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯

20、度，用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。场的作用使细胞分层、分离。第26页，本讲稿共27页o如果分离的颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，如果分离的颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种大小的颗粒沉降到与自身密度相得快，并且每种大小的颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种不等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种不同大小的颗粒在离心管中被分成独立的区带。同大小的颗粒在离心管中被分成独立的区带。o细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，避免细胞器的聚集。避免细胞器的聚集。第27页，本讲稿共27页