生物大分子的分离纯化和鉴定精.ppt
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1、生物大分子的分离纯化和生物大分子的分离纯化和鉴定鉴定第1页,本讲稿共15页 生物大分子通常是指在生物体内存在的或生物体生物大分子通常是指在生物体内存在的或生物体生物大分子通常是指在生物体内存在的或生物体生物大分子通常是指在生物体内存在的或生物体代谢产生的具有特殊生物学功能的高分子化和物,主代谢产生的具有特殊生物学功能的高分子化和物,主代谢产生的具有特殊生物学功能的高分子化和物,主代谢产生的具有特殊生物学功能的高分子化和物,主要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。生物材料的选择与处理 一、选
2、择生物材料原则:一、选择生物材料原则:一、选择生物材料原则:一、选择生物材料原则:有效成分含量高,稳定,来源丰富,保持新鲜,提取有效成分含量高,稳定,来源丰富,保持新鲜,提取有效成分含量高,稳定,来源丰富,保持新鲜,提取有效成分含量高,稳定,来源丰富,保持新鲜,提取工艺简单,成本低。如:用酵母提工艺简单,成本低。如:用酵母提工艺简单,成本低。如:用酵母提工艺简单,成本低。如:用酵母提RNARNARNARNA,用牛奶提酪蛋白,用,用牛奶提酪蛋白,用,用牛奶提酪蛋白,用,用牛奶提酪蛋白,用大蒜提大蒜提大蒜提大蒜提SOD(SOD(SOD(SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶超氧化物歧化
3、酶)二、生物材料处理:二、生物材料处理:二、生物材料处理:二、生物材料处理:1 1 1 1、动物脏器:冰冻:、动物脏器:冰冻:、动物脏器:冰冻:、动物脏器:冰冻:-10-10-10-10冰库(短期保存)冰库(短期保存)冰库(短期保存)冰库(短期保存)-70 -70 -70 -70低温冰箱(数月)低温冰箱(数月)低温冰箱(数月)低温冰箱(数月)干燥:可长期保存干燥:可长期保存干燥:可长期保存干燥:可长期保存第2页,本讲稿共15页2 2、植物组织:、植物组织:1010小时内置小时内置-4-30-4-30冰箱储藏备用冰箱储藏备用3 3、微生物:胞外产物(如发酵液),低温短时储藏。、微生物:胞外产物(
4、如发酵液),低温短时储藏。胞内产物,则应收集菌体或细胞,制成冻干粉于胞内产物,则应收集菌体或细胞,制成冻干粉于44保存(数月不变质)保存(数月不变质)除了体液和微生物胞外的某些蛋白质和多肽以外除了体液和微生物胞外的某些蛋白质和多肽以外,大多数生物大分子都存在于大多数生物大分子都存在于细胞之内细胞之内.细胞破碎细胞破碎 1 1 1 1、酶学破碎法:外加酶制剂、自溶法。、酶学破碎法:外加酶制剂、自溶法。、酶学破碎法:外加酶制剂、自溶法。、酶学破碎法:外加酶制剂、自溶法。2 2 2 2、机械破碎法:高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法、机械破碎法:高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法、机械破碎法:高速捣
5、碎法、高速均浆法、高速磨珠法、机械破碎法:高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法 3 3 3 3、物理破碎法:温差法、压差法、超声波、物理破碎法:温差法、压差法、超声波、物理破碎法:温差法、压差法、超声波、物理破碎法:温差法、压差法、超声波 4 4 4 4、化学破碎法:有机溶剂法、表面活性剂(、化学破碎法:有机溶剂法、表面活性剂(、化学破碎法:有机溶剂法、表面活性剂(、化学破碎法:有机溶剂法、表面活性剂(SDS SDS SDS SDS 等)等)等)等)金属螯合剂(金属螯合剂(金属螯合剂(金属螯合剂(MgMgMgMg2+2+2+2+、CaCaCaCa2+2+2+2+、EDTAEDTAEDTAEDTA
6、)、化学变性剂。)、化学变性剂。)、化学变性剂。)、化学变性剂。第3页,本讲稿共15页蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 依据蛋白质在溶液中的性质不同(溶解度、电荷、相依据蛋白质在溶液中的性质不同(溶解度、电荷、相对分子质量的大小,特异亲和力等)确立的蛋白质和酶的分对分子质量的大小,特异亲和力等)确立的蛋白质和酶的分离方法离方法.其性质包括其性质包括:。(1 1 1 1)利用溶解度差别的分离方法)利用溶解度差别的分离方法)利用溶解度差别的分离方法)利用溶解度差别的分离方法1 1 1 1、等电点沉淀:、等电点沉淀:、等电点沉淀:、等电点沉淀:蛋白质在等电点时溶解度最小。当蛋白质混合液的蛋白质在等电
7、点时溶解度最小。当蛋白质混合液的PHPH值被调到值被调到其中某一种成分的其中某一种成分的PIPI时,该种成分蛋白质将会沉淀下来,这种时,该种成分蛋白质将会沉淀下来,这种沉淀出来的蛋白质保持着天然构象(活性)能再溶解。高于或沉淀出来的蛋白质保持着天然构象(活性)能再溶解。高于或低于该低于该PIPI的蛋白质留在溶液。的蛋白质留在溶液。如:如:GluGlu的生产也是利用此性质进行的,的生产也是利用此性质进行的,Glu PI 3.22 Glu PI 3.22。第4页,本讲稿共15页2 2 2 2、盐析、盐析、盐析、盐析 高浓度的盐(常用硫酸铵)可以降低蛋白质的溶解度。因高浓度的盐(常用硫酸铵)可以降低
8、蛋白质的溶解度。因为高浓度盐争夺了蛋白质分子的水膜层,降低了环境中水的相为高浓度盐争夺了蛋白质分子的水膜层,降低了环境中水的相对浓度,还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷对浓度,还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和度由低到高逐次增加,如血清中加入度由低到高逐次增加,如血清中加入50%50%饱和度的饱和度的(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4可使可使球蛋白析出,加入球蛋白析出,加入100%100%饱和度饱和度(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4可使清蛋白析出,达
9、到可使清蛋白析出,达到分级分离的目的分级分离的目的.盐析后必须脱盐。盐析后必须脱盐。盐析后必须脱盐。盐析后必须脱盐。脱盐最常见的方法是透析法,也可以用凝胶层析(葡聚糖凝脱盐最常见的方法是透析法,也可以用凝胶层析(葡聚糖凝胶胶SephadexG25SephadexG25脱盐)、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点沉脱盐)、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点沉淀法相结合使用。脱盐是否彻底,要经常进行检查。如除去淀法相结合使用。脱盐是否彻底,要经常进行检查。如除去(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4可用可用10%BaCl10%BaCl2 2检查;除去检查;除去NaClNaCl可用可用10%AgNO10
10、%AgNO3 3检查,直到检查,直到透析液中检测不出透析液中检测不出BaSOBaSO4 4或或AgClAgCl为止,透析完成。为止,透析完成。第5页,本讲稿共15页3 3、有机溶剂分级法、有机溶剂分级法 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数,水是高介电常数(20时,80),有机溶剂是低介电常数物质(20时,甲醇33,乙醇24,丙酮21.4),因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样,蛋白质分子表面的可解离基团的离子化程度减弱,水化程度降低,因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似,与蛋白质争夺水化(膜)水,致使蛋白质聚集体的
11、形成并沉淀。有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。第6页,本讲稿共15页(二)根据分子大小不同的分离方法:1 1、透析和超过滤:即利用蛋白质分子不能通过半、透析和超过滤:即利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质(如无机盐、透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质(如无机盐、单糖、水)等分开。单糖、水)等分开。第7页,本讲稿共15页2 2、密度梯度(区带)离心:、密度梯度(区带)离心:蛋白质颗粒在具有密度梯度介质中离心时,每种蛋白质蛋白质颗粒在具有密度梯度介质中离心时,每种蛋白质颗粒降到与自身密度相近的密度梯度时停止不前
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