转基因与敲除技术.ppt

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1、转基因与敲除技术转基因与敲除技术飞鱼2011-12-5转基因技术1定义与原理常用方法研究前景与运用定义定义v转基因技术：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的变化，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。转基因技术基本原理转基因技术基本原理重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化

2、体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定分子杂交分子杂交目目 录录(插插入入失失活活法法)抗抗药药性性标标记记选选择择目目 录录原原位位杂杂交交目目 录录Southern印迹印迹目目 录录常用的植物转基因方法常用的植物转基因方法v遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类:v1、需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；v2、不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法。常用的动物转基因技术常用的动物转基因技术v1核显微注射法v2精子介导的基因转移v3核移植转基因法v4体细胞核移植

3、法v过去的几千年里农作物改良的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。遗传学创立后近百年的动植物育种则是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改良。因此，转基因技术与传统技术是一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。转基因技术发展情况转基因技术发展情况v一是品种培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息学等学科的发展，目前全球转基因生物新品种已从抗虫和抗除草剂等第一代产品，向改善营养品质和提高产量的第二代产品，以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转变，多基因聚合v二是产业化应用规模迅速扩大。全球已有25

4、个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积迅速增长。v三是生态和经济效益十分显著。1996至2007年，全球转基因作物的累计收益高达440亿美元，累计减少杀虫剂使用35.9万吨。2008年，全球转基因产品市场价值达到75亿美元。v植物：抗虫、抗病、抗除草剂植物培育、改良作物品质（富含赖氨酸的玉米）v动物：提高生长速度、生产药物蛋白、器官移植、乳腺生物反应器v微生物：疫苗v基因治疗，生物治疗，基因诊断，疾病基因的发现与克隆、遗传病的预防应用应用基因敲除(knock-out)定义方法现状定义定义利用基因同源重组进行基因敲除利用基因同源重组进行基

5、因敲除v发生在同源序列间的重组称为同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。，又称基本重组。是最基本的是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。片段的交换。v同源重组需要一些重组蛋白和酶，如同源重组需要一些重组蛋白和酶，如Rec A、B、C、D及及DNA连接酶等连接酶等v最为广泛最为广泛vHolliday模型中，同源重组主要模型中，同源重组主要4个关键步骤个关键步骤：两个同源染色体两个同源染色体DNA排列

6、整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的对应的链连接，形成链连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：，分别为：内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体中间体53535353Holiday中间体中间体53

7、5353535355533355553333555533335555333355553333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片片段段重重组组体体拼拼接接重重组组体体RNA干扰引起的基因敲除干扰引起的基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除v即基因捕获法：利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。研究现状研究现状v现在基因敲除技术主要应用动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺

8、乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。文献讲解文献讲解技术原理：同源重组的基因敲除实验目的：用胚胎干细胞为基础的基因打靶技术方法，构建基因敲除（p53）的大鼠模型。位于10号染色体上，包括10个外显子，其中启动子外显子2上6.7 kb1.6 kbdark agouti(DA)rat ES-cell genomic DNAPositive selectionnegative selectionPGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A链)不参与同源重组，它的随机插入是为了减少含有随机目标媒介插入的耐抗生素型ES细胞，以富集正确的目标细胞。构建基因载体DA ES cell电穿孔法培养基中加入抗生

9、素扩增耐抗生素克隆体PCR和Southern blot analysis鉴定中靶细胞obtained 14 p53 gene-targeted DA rat ES-cell clones相差镜检法荧光影像PCRDAc8-p53-1 ES cell79 blastocysts（囊胚）显微注射嵌合体pseudo-pregnant female SpragueDawley rats转移Twenty-four live-born pups10 male pups6 female pupscollected from E4.5 Fischer 344(F344)ratsfemale SpragueDaw

10、ley rats交配over 600 offspringone carried the DA rat ES-cell genomeidentified by the appearance of agouti coat colour产24只幼鼠，其中10只公鼠和6只母鼠被着色，说明存在DAc8-p53-1。PCR genotyping results showed that this germ line animal did not inherit the gene-targeted p53 alleleFailure of mouse ES cellschromosomal abnormali

11、ties in ES cellsover 65%of the cells were polyploid（多倍体）DAc8-p53-1 ES cell 染色体组型分析whether germline competency of DAc8-p53-1 rat ES cells could be improved through subcloningAround 10%of the cells formed round and compact coloniesidentified 2 subclones with euploid chromosome numbers扩增建立亚克隆inheritance the gene-targeted p53 allele2 subclones39 F344 rat blastocysts显微注射a germline chimaera76 offspring6 germline pups公母9/12纯合子summary12