药品微生物限度检查法.ppt

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1、药品微生物限度检查法吉林省食品药品检验所吉林省食品药品检验所长春长春12/4/20221l 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法，也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。检查项目包括染菌量及控制菌检查。12/4/20222微生物限度检查法起草的指导思想微生物限度检查法起草的指导思想较完善检查法：也是目前国际上常用的一种方法。是以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌、霉菌和酵母菌的菌落数。增加试验的可操作性 使方法更具科学性，保证检验结果

2、的准确性。12/4/20223检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净度10000级和局部洁净度100级单向流空气区域内进行，以防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按中华人民共和国国家标准GB/T 1629216294-1996 医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法进行洁净度验证。操作环境操作环境12/4/20224洁净级别洁净级别 尘粒数/m3浮游菌个/m2沉降菌个/0.5h微粒直径0.5um微粒直径5um1003,50005110000350,000200010031000003,500,00020,0005001012/4/20225检验量检验量检验量即一次

3、试验所用的供试品量（g、ml或 cm2）一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50cm2贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml12/4/20226供试液的制备供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液采取适宜的方法制备供试液。供试液 制备若需用水浴加温时，温度不应超过制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培。供试液从制备至加入检验用培 养基，不得超过养基

4、，不得超过1小时。小时。除另有规定外，常用的供试品制备方法除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：如下：12/4/20227非水溶性供试品取供试品5g(5ml)，加入司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化混合物（温度低于45）的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右的稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法12/4/20229特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振摇，使供试品溶解，再加入约45的稀释剂，振摇5-10分钟，萃

5、取，待油水明显分层，取其水层作为1:10供试液。十四烷酸异丙酯的灭菌方法：采用薄膜过滤法除菌，选用孔径为0.22um的脂溶性滤膜，在140干热灭菌2小时。12/4/202210特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法非水溶性膜剂供试品 取50cm2,剪碎，加适量的稀释剂（通常为每1ml或每2ml含1cm2）,浸泡，振摇，以供试品浸液作为1:10或1:20供试品。12/4/202211特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，加至100ml pH6.8磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）中或pH7.6磷酸盐缓冲液（结肠制剂），置45水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。12

6、/4/202212特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时，应消除其抑菌活性后，再依法检查。常用的方法有：培养基稀释法离心沉淀集菌法 3000转/分离心20分钟，500转/分离心5分薄膜过滤法中和法12/4/202213菌数报告规则菌数报告规则 细菌数酵母菌平均菌落数在30-300，霉菌平均菌落数在30-100 之间的稀释级作为菌数报告的依据。当仅有个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。12/4/202214菌数报告规则菌数报告规则当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除

7、以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大于5或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。12/4/202215菌数报告规则菌数报告规则当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。12/4/202216菌数报告规则菌数报告规则各各稀释级

8、菌落平均数比值菌落数报告1：10 1：102 1：103 不可计不可计不可计39240.51642952714119020466041.62.210.2164003775027100异常24051600038000270002401012/4/202217操作要点操作要点一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity,cfu）供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法（见附录）的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。12/4/202218操作要点操作要点

9、作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵菌数，并且合并计数。若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任何容器或用具。供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试液，以免造成实验误差。12/4/202219操作要点操作要点培养基的分装量不得超过容器的2/3以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。培养基配制后应在2h内灭

10、菌，避免细菌繁殖。灭菌后的培养基应保存在2-25 防止被污染，可在三周内用毕。已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再用，更不要反复加热溶化 注皿时培养基应在451，高于45时易造成细菌受损或致死，低于45时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。12/4/202220操作要点操作要点l采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤

11、膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。12/4/202221操作要点操作要点每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤或加至适量稀释剂中混匀，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同“计数方法的验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜，滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。12/4/202222操作要点操作要点 菌菌落落数数在在100100以以内内时时按按实实有有数数据据报

12、报告告。菌菌落落数数大大于于100100时时，取取两两位位有有效效数数字字报报告告，第第三三位位按数字修约规则处理。按数字修约规则处理。12/4/202223异常情况处理异常情况处理菌落蔓延：培养中由于一些菌落蔓延菌落蔓延：培养中由于一些菌落蔓延生长而影响另一些菌落生长，甚至掩盖生长而影响另一些菌落生长，甚至掩盖了另一些菌落，干扰计数。了另一些菌落，干扰计数。原因：有动力和培养环境湿度过大造原因：有动力和培养环境湿度过大造成，给动力菌造成泳动的条件，促使形成，给动力菌造成泳动的条件，促使形成蔓延菌落机会增多。成蔓延菌落机会增多。12/4/202224加TTC：于倾注培养基前，在每1000ml营

13、养琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml混匀后倾注平皿。开盖干燥：将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机1-2h后合盖，再放培养箱中 防止方法防止方法12/4/202225异常菌数报告异常菌数报告 在特殊情况下，营养琼脂培养基上生长的霉菌、酵母菌多于玫瑰红钠琼脂培养基上菌落数则以营养琼脂平板的霉菌、酵母菌菌落数报告，反之如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂平板的菌落数，则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告 12/4/202227 控制菌的检查控制菌的检查 大肠埃希菌检验程序大肠埃希菌检验程序 供试品 供试液 不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液 35371824h 取 0.2ml

14、5mlMUG培养基中 35375、24h 366nm紫外光下观察 加靛基质试剂 MUG阳性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阳性MUG阴性，靛基质 阴性 MUG阳性，靛基质 阴性 取胆盐乳糖培养液划线 报告 曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板 3611824h 阳性 阴性 镜检、适宜的生化试验 报告 12/4/202228大肠埃希菌检验程序大肠埃希菌检验程序 供试品 供试液 不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液 35371824h 取 0.2ml 5mlMUG培养基中 35375、24h 366nm紫外光下观察 加靛基质试剂 MUG阳性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阳性MUG阴性，靛基质

15、 阴性 MUG阳性，靛基质 阴性 取胆盐乳糖培养液划线 报告 曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板 3611824h 阳性 阴性 镜检、适宜的生化试验 报告 报告12/4/202229注意事项注意事项配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4否则pH值偏高，MUG分解本身则显荧光。供试品培养液接种于MUG培养基中，培养时间一般在4h、24h观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养时间至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干

16、扰等，对结果的判断亦有影响。12/4/202230注意事项注意事项观察供试品MUG管时，可与阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上生长的可疑菌落，务必挑选2-3个以上菌落分别做IMViC试验鉴别。在IMViC试验中，以灭菌接种环沾取菌苔，首先接种于枸椽酸盐琼脂斜面上，然后再接种于蛋白胨水等其它培养基上，切务将培养基带入枸椽酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。12/4/202231大肠菌群大肠菌群大大肠肠菌菌群群作作为为水水质质粪粪便便污污染染的的指指示示菌菌已已有有80多多年年历历史史。大大肠肠菌菌群群的的定定义义：是是指指37生生长长时时能能发

17、发酵酵乳乳糖糖，在在24h内内产产酸酸产产气气的的革革兰兰阴阴性性无无芽芽孢孢杆杆菌菌，符符合合上上述述定定义义的的细细菌菌除除大大肠肠埃埃希希氏氏杆杆菌菌属属外外，还还包包括括肠肠杆杆菌菌科科的的肠肠杆杆菌菌属属、枸枸椽椽酸酸菌菌属属、克克雷雷伯伯菌菌属属等等，实实际际上上基基本本包包括括人人和和了了正正常常家家畜畜肠肠道道内内的的全全部部需需氧氧的的革革兰兰阴阴性性杆杆菌菌，较较大大肠肠埃埃希希菌菌更更具具代代表表性性，且且存存活活时时间间较较长长。故故检检出出大大肠肠埃埃希希菌菌，一一般般认认为为药药品品受受粪粪便便的的近近期期污污染染；而而检检出出大大肠肠菌菌群群，则则表表示示药药品品

18、受受粪粪便便的的近近期期或或远远期期污污染染。以以大大肠肠菌菌群群作作为为口口服服药药品品微微生生物物限限度度标标准准的的控控制制菌菌，具具有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。12/4/202232操作方法操作方法取取乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管3支支，分分别别加加入入1:10供供试试液液1ml(供供试试品品量量0.1g或或0.1ml),1:100供供试试液液1ml(供供试试品品量量0.01g或或0.01ml),1:1000供供试试液液1ml（供供试试品品量量0.001g或或0.001ml），同同时时作作阴阴性性对对照照，各各管管置置361培

19、养培养18-24h,阴性对照应无菌生长。阴性对照应无菌生长。12/4/202233结果判断结果判断 乳糖胆盐发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气（或产酸不产气）报告 未检出大肠菌群；如有产酸产气，应做确证试验，将产酸产气的发酵管划线接种于EMB或麦康凯琼脂平板上培养18-24h，如平板上无菌落生长可判该管未检出大肠菌群。如平板上有菌落生长并与药典所列的菌落形态特征相符或疑似，镜检为革兰阴性无芽孢杆菌的菌落，应取上述平板上的可疑菌落4-5个各接种1支乳糖发酵管，培养2448h,凡产酸产气，革兰阴性无芽孢杆菌，判该管检出大肠菌群，反之判该管未检出大肠菌群。12/4/202234沙门菌检验程序沙

20、门菌检验程序 供试品供试品10g(10ml)200ml的营养肉汤中的营养肉汤中 35371824h 四硫磺酸盐增菌液四硫磺酸盐增菌液 35371824h DHL，EMB或或MacC 35371824h 无典型菌落无典型菌落 三糖铁琼脂（三糖铁琼脂（TSI）35371824h 报告报告 斜面未见红色（斜面黄色）斜面未见红色（斜面黄色）斜面红色（黄色）斜面红色（黄色）底层未见黄色（底层无黑色）底层未见黄色（底层无黑色）底层黄色（黑色）底层黄色（黑色）血清凝集、生化试验血清凝集、生化试验 报告报告12/4/202235注意事项注意事项 在作氰化钾试验时，应注意密封管口，夏天分装培在作氰化钾试验时，应

21、注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长生长，造成假阳性。，造成假阳性。氰化钾为剧毒品，操作时须谨慎，用后培养基每氰化钾为剧毒品，操作时须谨慎，用后培养基每管加数粒硫酸亚铁和管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾氢氧化钾0.5ml去毒，然后去毒，然后再灭菌、洗涤。再灭菌、洗涤。12/4/202236铜绿假单胞菌检验程序铜绿假单胞菌检验程序 供试品供试品 供试液供试液 BL增菌液增菌液 35371824h 溴代十六烷三甲胺平板溴代十

22、六烷三甲胺平板 35371824h 氧化酶、革兰染色镜检氧化酶、革兰染色镜检 氧化酶阴性氧化酶阴性 氧化酶阳性氧化酶阳性 非革兰阴性无芽孢杆菌非革兰阴性无芽孢杆菌 革兰阴性无芽孢杆菌革兰阴性无芽孢杆菌 绿脓菌素绿脓菌素 报告报告 绿脓菌素阳性绿脓菌素阳性 绿脓菌素阴性绿脓菌素阴性 生化试验生化试验 报告报告12/4/202237注意事项注意事项 铜绿假单胞菌污染药品后，因生产工艺和药物的影铜绿假单胞菌污染药品后，因生产工艺和药物的影响，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形态可产响，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形态可产生非典型形态。为防止漏检，在挑取疑似菌落时，生非典型形态。为防止漏检，在挑取

23、疑似菌落时，宜取宜取23个以上菌落，分别进行检验，以提高铜绿个以上菌落，分别进行检验，以提高铜绿假单胞菌的检出率。假单胞菌的检出率。做氧化酶试验时，试验菌苔必须新鲜，陈旧培养物做氧化酶试验时，试验菌苔必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠反应不可靠试验应避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种试验应避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环）（白金材料除外），挑取菌苔，否则易出针（环）（白金材料除外），挑取菌苔，否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。12/4/202238注意事项注意事项试剂试剂 宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二

24、胺氧化变色不可用。胺氧化变色不可用。该反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以该反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸没培养物，使之与空气隔绝，造成假阴性反应。免浸没培养物，使之与空气隔绝，造成假阴性反应。绿脓菌素是铜绿假单胞菌鉴定的重要特征，但色素绿脓菌素是铜绿假单胞菌鉴定的重要特征，但色素的产生受许多因素的影响，除菌株差异及变异外，的产生受许多因素的影响，除菌株差异及变异外，培养条件是重要因素，温度、培养基成分等皆可影培养条件是重要因素，温度、培养基成分等皆可影响色素产生。培养基中琼脂、蛋白胨等均应事先测响色素产生。培养基中琼脂、蛋白胨等均应事先测试，选用适宜品牌，实验时并用阳性

25、菌株作对照试试，选用适宜品牌，实验时并用阳性菌株作对照试验。验。12/4/202239金黄色葡萄球菌检验程序金黄色葡萄球菌检验程序 供试品 供试液 营养肉汤（亚碲酸钠肉汤）35371824h 卵黄氯化钠平板或甘露醇氯化钠平板 35371824h 无菌落 营养琼脂斜面 35371824h 报告 血浆凝固酶试验，革兰染色镜检12/4/202240注意事项注意事项 金黄色葡萄球菌在上述三种分离培养基上的典型菌落为金黄色。但由于受药物影响或非典型菌株存在，可呈橙黄色、柠檬色或白色。做控制菌检查，对非典型菌落也有必要进行凝固酶试验做金黄色葡萄球菌的筛查，以防漏检金黄色葡萄球菌。培养基存放时间和培养时间影

26、响色素产生，故培养基应新鲜配制。培养时间宜48h以上。做血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用旧培养物及血浆易导致假阴性反应。此外，观察结果时不宜摇动试管，因凝固初期凝块不结实易破坏，引起假阴性反应。12/4/202241梭菌的检验程序 供试液10ml 2份（1份置80水浴保温10分）100ml疱肉培养基 厌氧培养7296h 未浑浊、产气、消化碎肉、臭气 0.2ml 报告 含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板 厌氧培养 4872h 无菌生长 过氧化氢酶试验 报告 过氧化氢酶阴性、G+梭 菌有或无卵圆形或球形芽孢 报告，检出梭菌 12/4/202242注意事项注意事项 厌氧培养 是厌氧菌培养的基本

27、前提，有些厌氧菌严格厌氧，一旦在有氧存在时迅速死亡，这是导致培养失败、造成假阴性结果的主要原因之一因此检查梭菌，必须保证厌氧的培养条件。12/4/202243厌氧培养方法冷触媒法：该法是利用氢硼化钠或氢硼化钾与水反应产生氢，氢与氧气在钯催化下结合成水，从而造就了一个厌氧环境。由于在厌氧环境中加入5%-10%的二氧化碳，更有利于厌氧菌的生长。故在厌氧环境中加入柠檬酸与碳酸氢钠，由此制备CO2。取适宜容器，1个放入氢硼化钠0.22g（以厌氧容器容积1L计），1个置枸椽酸0.33g碳酸氢钠0.37g另一个置活化的钯1g，临用前与培养管、厌氧指示管一同放入备妥的装置中，取水各5ml加入前两个试剂 容器

28、内立即封闭容器，待厌氧指示管指示达到厌氧状态时，即可移入37培养箱培养。12/4/202244厌氧培养方法焦性没食子酸法：取培养皿或其他适宜容器一个，内装焦性没食子酸10g，无水碳酸钠5g（以厌氧容器容积1L计），与已经接种的培养管或平板、厌氧指示管1支同时置厌氧装置内，立即封闭容器，待厌氧指示管指示达到厌氧状态时，即可移入37培养箱培养。12/4/202245厌氧培养方法l凡士林石蜡封盖法：在已接种的培养管内注入已经灭菌并液化的1:1凡士林石蜡混合物约1cm高度，试验管经75-80水浴保温时，凡士林石蜡混合物自动熔化并严严地封住液面，待冷却后置37培养。该法的优点在于在培养过程中可随时取出培

29、养物作其他检查。缺点是仅适应于液体培养物的厌氧培养，且使用后器具难以洗涤。12/4/202246结果判断 供试品检出控制菌或其他致病菌时按一次检出结果为准不再复试。供试品细菌、霉菌、酵母菌其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果平均值报告菌数。眼用制剂检出霉菌和酵母菌时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定.若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定.12/4/202247 谢谢！12/4/202248