荧光定量PCR技术.ppt

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1、SYBR Green I SYBR Green I 工作原理未结合的SYBR green I结合解离曲线识别不同的PCR产物95 15sec;60 20sec;95 15sec在60 95 之间的Ramp time设为19:59SYBR Green ISYBR Green I的特点的特点可以用于不同的模板使用方便，价格相对便宜灵敏度很高与非特异性产物结合解离曲线选择良好的引物和探针并优化反应条件 TaqMan Probes荧光素淬灭剂 与目标序列互补FAMTETJOEHEXVIC TAMRA DABCYL TaqMan Probes工作原理探针与目标序列配对时，发生 FRET光光能量转移Taq

2、游离的探针荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq发出荧光光另一波长的荧光随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系TaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等其结果都具有高特异性与高敏感性但只适合于一个特定的目标TaqMan MGB探针 荧光素非荧光淬灭基团与目标序列互补MGB(Minor Groove Binder)将探针的Tm值提高10因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成

3、功率大为提高。TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。分 子 信 标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补 淬灭剂淬灭剂 茎茎(5-7bp)环（15-30bp）FAM Texas Red 分 子 信 标 工 作 原 理探针杂交到DNA模板光发出荧光荧光基团DNA 模板淬灭剂淬灭剂 茎茎 环光淬灭分子信标能特异性地检测感兴趣的目标DNA 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 特别适用于检测点突变只能用于一个特定的目标设计困难价格较高常常 用用 的的 热热 循循 环环 仪仪 Company PCR systemSample formatMax sam

4、ple numberApplied Biosystems ABI Prism 7700 SDSGeneAmp 5700 SDSABI Prism 7900 HT SDSMicroplateTubesMicroplateTubesMicroplate969696,384Bio-Rad www.bio-iCycler iQMicroplateTubes9696Cepheid Smart CyclerTubes16Corbett Research Rotor-GeneTubesStrip tubes3272Roche Molecular Biochemicals LightCyclerCapillaries32Stratagene Mx4000 MultiplexQuantitative PCRMicroplate96ABI Prism 7700o可以在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增o一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只需要23小时o用于水解探针、双链DNA结合染料、分子信标的分析o但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析