色谱法基本理论.ppt

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1、色谱法基本理论色谱法基本理论4-1色谱流出曲线及相关术语色谱流出曲线及相关术语4-2 色谱基本理论色谱基本理论4-3分离度及色谱分离方程分离度及色谱分离方程4-4 色谱法的定性与定量方法色谱法的定性与定量方法4-1 色谱流出曲线及相关术语色谱流出曲线及相关术语色谱流出曲线（色谱图色谱流出曲线（色谱图）以气相色谱为例以气相色谱为例色谱流出曲线色谱流出曲线进样进样基线（噪音）基线（噪音）h/峰高（定量）峰高（定量）A/峰面积（定量）峰面积（定量）保留值保留值进样进样空气峰空气峰组分峰组分峰重要重要定性定性指标指标柱温柱温/相相区域宽度区域宽度用于衡量用于衡量柱效柱效及反映色谱及反映色谱操作条件下的

2、操作条件下的动力学动力学因素因素实际色谱峰是不对称的，通常是拖尾峰，也存在前伸峰实际色谱峰是不对称的，通常是拖尾峰，也存在前伸峰从色谱流出曲线上可以得到什么信息？从色谱流出曲线上可以得到什么信息？根据根据色谱峰个数色谱峰个数可以判断样品中所含可以判断样品中所含组分的最小个数组分的最小个数根据色谱峰的根据色谱峰的保留值保留值可以进行可以进行定性定性分析分析根据色谱峰高或者根据色谱峰高或者峰面积峰面积可以进行可以进行定量定量分析分析根据色谱峰根据色谱峰保留值保留值和和区域宽度区域宽度可评价色谱柱可评价色谱柱分离效率分离效率可以通过两个色谱峰的可以通过两个色谱峰的距离距离评价评价固定相（流动相）固定

3、相（流动相）的的选择是否合适选择是否合适4-2 色谱基本理论色谱基本理论完全分离的条件：完全分离的条件：两组份峰间距足够远两组份峰间距足够远由各组份在两相间的由各组份在两相间的分配系数分配系数决定，即色谱过程的决定，即色谱过程的热热力学力学性质决定。性质决定。每个组份峰宽足够小每个组份峰宽足够小由组份在色谱柱中的由组份在色谱柱中的传质和扩散传质和扩散决定，即色谱过程决定，即色谱过程动动力学力学性质决定。性质决定。因此研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两因此研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。方面进行。色谱过程热力学色谱过程热力学色谱分离的热力学本质色谱分离的热力学本质样品

4、中各组份在两相中进行了不同程度的样品中各组份在两相中进行了不同程度的作用作用。作用表现形式：作用表现形式：范德华力、静电引力等范德华力、静电引力等作用体现形式作用体现形式分配系数、分配比分配系数、分配比描述样品与两相作用的参数（描述样品与两相作用的参数（1）分配系数（分配系数（Distribution constant，K）:描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附脱附过程的参数。过程的参数。组分一定时，组分一定时，只与只与两相两相和温度有关和温度有关!描述样品与两相作用的参数（描述样品与两相作用的参数（2）分配比（分配比（Retention

5、factor or capacity factor/k）容量容量因子因子反映了组分在柱中的迁移速率，又称反映了组分在柱中的迁移速率，又称保留因子保留因子；液相色谱中常用液相色谱中常用k 表示表示K 与与 k 的关系的关系填充柱：填充柱：=635毛细管柱：毛细管柱：=60600 越大，越容易分离，越大，越容易分离，=1，分离不能实现，分离不能实现热力学提出了分离的基本条件热力学提出了分离的基本条件色谱过程动力学色谱过程动力学在满足热力学分离基本条件的情况下，如何从动在满足热力学分离基本条件的情况下，如何从动力学角度优化分离条件，从而实现分离？力学角度优化分离条件，从而实现分离？塔板理论塔板理论速

6、率理论速率理论塔板理论（塔板理论（Plate theory）（1）詹姆斯詹姆斯/马丁（马丁（1941）小室小室1小室小室2小室小室3小室小室4小室小室1小室小室2小室小室3小室小室4四点假设四点假设k=1.0的样品经数次平衡后的结果的样品经数次平衡后的结果阶段阶段1阶段阶段2阶段阶段3阶段阶段4阶段阶段5小室小室1小室小室2小室小室3小室小室4小室小室50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 塔板序号塔板序号溶质溶质/gk=0.33and3.00的二组经多次分配后的结果的二组经多次分配后的结果17次基本分离次基本分离 5次次 9次次 17次次塔板

7、数塔板数n理论塔板数理论塔板数理论板高理论板高有效塔板数有效塔板数有效板高有效板高有关塔板数的说明有关塔板数的说明说明说明柱效柱效时，必须注明该柱效是针对时，必须注明该柱效是针对何种物质何种物质、固定液种类固定液种类及其及其含量含量、流动相种类流动相种类及及流速流速、操操作条件作条件等；等；应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命柱寿命塔板理论（塔板理论（Plate theory）（2）贡献贡献用热力学的观点阐明了溶质在色谱柱中的分配平衡和用热力学的观点阐明了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程分离过程解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置解释了流出

8、曲线的形状及浓度极大值的位置提出了计算和评价柱效的参数提出了计算和评价柱效的参数不足不足不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素不能说明同一溶质为什么在不同的流速下，可以测得不能说明同一溶质为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数不同的理论塔板数速率理论速率理论吸收了塔板理论中的吸收了塔板理论中的板高板高H概念，考虑了组分在两相间的概念，考虑了组分在两相间的扩散扩散和和传质传质过程从过程从动力学动力学角度很好地解释了影响板高（柱角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！（效）的各种因素！（以以GC为例讲述为例讲述）Van Deemte

9、r/1956H：单位柱长色谱峰形展宽的程度单位柱长色谱峰形展宽的程度A：涡流扩散项涡流扩散项B：分子扩散项系数分子扩散项系数C：传质阻力项系数传质阻力项系数涡流扩散项涡流扩散项A（多途路径项）多途路径项）减小减小A的途径：的途径：使用粒度小并且均匀的柱料并均匀填充使用粒度小并且均匀的柱料并均匀填充毛细管柱？毛细管柱？分子扩散项分子扩散项B/U（纵向扩散项）纵向扩散项）柱料均匀柱料均匀 柱温柱温 Dg ；柱压；柱压 Dg 流动相分子量流动相分子量，Dg u,（B/u）LC中中Dm 较小，较小，B项可勿略项可勿略球状颗粒球状颗粒低温低温短柱短柱大分子量流动相大分子量流动相适当增加流速适当增加流速传

10、质阻力项传质阻力项CU物质系统由于物质系统由于浓度不均匀浓度不均匀而发生的而发生的物质迁移物质迁移过程，过程，称为称为传质传质。影响这个过程进行速度的阻力称为。影响这个过程进行速度的阻力称为传传质阻力质阻力。因传质阻力的存在，使分配不能因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。达至平衡，因此产生峰形展宽。流动相传质阻力系数流动相传质阻力系数固定相传质阻力系数固定相传质阻力系数气液色谱传质阻力项气液色谱传质阻力项小粒度填充物小粒度填充物+小分子量载气小分子量载气降低固定液含量（但是降低固定液含量（但是k也减小）；采用比表面积大也减小）；采用比表面积大的载体（吸附，导致峰

11、脱尾）；提高柱温（增大的载体（吸附，导致峰脱尾）；提高柱温（增大Dl，但是减小但是减小k）流动相流动相气液界面气液界面固定液固定液组分分子组分分子ClCg液液色谱传质阻力项液液色谱传质阻力项 smCm：小粒度大孔固定相、增加组分在固定相和流动相中：小粒度大孔固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数的扩散系数DCs：与气液色谱中的表述相同与气液色谱中的表述相同流动相线速对板高的影响流动相线速对板高的影响板高板高Hcm固定相粒度大小对板高的影响固定相粒度大小对板高的影响粒度越细，板高越小，受线速度影响亦小粒度越细，板高越小，受线速度影响亦小4-3 分离度及色谱分离方程（分离度及色谱分离方程（1

12、）塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度：实际分离程度：即柱效为多大时，相邻两组份能即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离够被完全分离?色谱分离中的四种情况如图所示：色谱分离中的四种情况如图所示：n较较高，高，较大，完全分离较大，完全分离n较较高，高，较小，基本分离较小，基本分离n较小较小，较大，分离不好较大，分离不好n、均小，无法均小，无法分离分离分离度（分离度（1）难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：因素的综合影响：保留值之差保留值之差色谱过程的色谱过程的热力学热力学因素

13、因素区域宽度区域宽度色谱过程的色谱过程的动力学动力学因素因素分离度表达式：分离度表达式：分离度（分离度（2）R=1.5R=0.75R=1.0保留时间保留时间 t/min互含互含4%互含互含0.3%不能分离不能分离响应信号响应信号完全分离之标准完全分离之标准4-3 分离度及色谱分离方程（分离度及色谱分离方程（2）R的定义并未反映影响分离度的各种因素，的定义并未反映影响分离度的各种因素，既未与影响其大小的因素：既未与影响其大小的因素：柱效柱效n、选择因选择因子子 和保留因子和保留因子k联系起来联系起来.色谱分离方程色谱分离方程对于难分离物质，可以合理的认为对于难分离物质，可以合理的认为W1=W2=

14、W、k2=k1=k分离度与柱效的关系分离度与柱效的关系增加柱长，可提高分离度，但延长了分析时间，增加柱长，可提高分离度，但延长了分析时间，因此降低板高，提高柱效，才是提高分离度的因此降低板高，提高柱效，才是提高分离度的好方法。好方法。分离度与选择因子的关系分离度与选择因子的关系当当=1时，时，R=0，无法分离两组分；增大，无法分离两组分；增大，是改，是改善分离度的有效手段善分离度的有效手段GC通过选择合适的固定相和降低柱温来增大通过选择合适的固定相和降低柱温来增大 LC通过改变固定通过改变固定/流动相的性质和组成，可有效增大流动相的性质和组成，可有效增大 对一个复杂混合物的分离条件的选择，主要

15、是提对一个复杂混合物的分离条件的选择，主要是提高最难分离物质对的高最难分离物质对的 值值分离度与容量因子分离度与容量因子k的关系的关系考虑分离度和分析时间，容量因考虑分离度和分析时间，容量因子一般控制在子一般控制在210为宜为宜对于对于GC，增加固定液的用量，增加固定液的用量或提高柱温，选择合适的或提高柱温，选择合适的k值。值。对于对于LC，改变流动相的组成，改变流动相的组成，有效的控制有效的控制k值值分离度与分析时间的关系分离度与分析时间的关系可见，分析时间与可见，分析时间与R，k、H/u等参数有关，等参数有关，R增加增加1倍，分析时间则是原来的倍，分析时间则是原来的4倍。实际工作中，倍。实

16、际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析。分析。例：例：在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为为85 s和和100 s，计算达到完全分离时所需的有效塔，计算达到完全分离时所需的有效塔板数；若填充柱的有效塔板高度为板数；若填充柱的有效塔板高度为0.1 cm，柱长是柱长是多少？多少？解：解：例：例：用一根柱长为用一根柱长为1 m的色谱柱分离的色谱柱分离A、B两种物质，其两种物质，其保留时间分别为保留时间分别为14.4和和15.4 min，对应的峰底宽分别为，对应的峰底宽分别为1.07 min和和1

17、.16 min（死时间为（死时间为4.2 min），试计算：），试计算：物质物质A的理论塔板数的理论塔板数 分离度分离度R 选择性因子选择性因子 完全完全分离所需的柱长分离所需的柱长 完全分离所需的时间完全分离所需的时间解：解：4-4 色谱法定性及定量色谱法定性及定量定性定性用已知纯物质对照定性用已知纯物质对照定性相对保留值相对保留值r2,1根据经验公式定性根据经验公式定性保留指数（保留指数（Kovats）定性定性与其它方法结合与其它方法结合定量定量归一化法归一化法外标法外标法内标法内标法用已知纯物质对照定性用已知纯物质对照定性醇溶液定性色谱图醇溶液定性色谱图A：甲醇甲醇B：乙醇乙醇C：正丙醇

18、正丙醇D：正丁醇正丁醇E：正戊醇正戊醇也可以通过在样品中加也可以通过在样品中加入标准物，看试样中哪入标准物，看试样中哪个峰增加来确定个峰增加来确定根据经验公式定性根据经验公式定性碳数规律：碳数规律：在一定温度下，同系物的调整保留时间在一定温度下，同系物的调整保留时间tr 的对数与分子中碳数的对数与分子中碳数n成正比：成正比：知道两种或以上同系物的调整保留值便可求出常知道两种或以上同系物的调整保留值便可求出常数数A和和C。未知物的碳数则可从色谱图查出未知物的碳数则可从色谱图查出tr 后，以后，以上式求出。上式求出。沸点规律：沸点规律：同族具相同碳数的异构物，其调整保留时同族具相同碳数的异构物，其

19、调整保留时间间tr 的对数与分子中沸点的对数与分子中沸点n成正比成正比相对保留值相对保留值r2,1相对保留值相对保留值r21仅与仅与柱温柱温和和固定液固定液性质有关。在性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。保留数据，可以用来进行定性鉴定。在样品和在样品和标准中分别加入同一种基准物标准中分别加入同一种基准物s，将样品的将样品的ri,s和标准物的和标准物的ri,s相比较来确定样品中是否含有相比较来确定样品中是否含有 i 组分，可消除两次进样引起的误差。组分，可消除两次进样引起的误差。保留指数（保留指数（Kovat

20、s）定性定性重现性最佳，固定液和柱温一定时，定性不需要标准物重现性最佳，固定液和柱温一定时，定性不需要标准物GC专有专有与其它方法（如与其它方法（如MS）结合）结合绿麦隆绿麦隆?莠去津莠去津?44685896132 138158172215200104质荷比质荷比6080100120140160180200220波长波长(nm)峰质谱分析峰质谱分析（MS）峰光谱分析（峰光谱分析（UV）峰面积的测量方法峰面积的测量方法对称形峰面积的测量对称形峰面积的测量峰高乘半峰宽法峰高乘半峰宽法不对称峰面积的测量不对称峰面积的测量峰高乘平均峰宽法峰高乘平均峰宽法自动积分仪法自动积分仪法剪纸称重法剪纸称重法定量

21、校正因子定量校正因子绝对校正因子绝对校正因子相对校正因子相对校正因子TCD：苯苯FID：正庚烷正庚烷常用的定量计算方法常用的定量计算方法归一化（归一化（NORM）：）：全部组分都出峰全部组分都出峰外标法（外标法（ESTD）：分析条件和进样量必须重现分析条件和进样量必须重现内标法（内标法（ISTD）：内标物是样品中不存在的组分，内标物是样品中不存在的组分，其保留时间和定量校正因子应该与待测物尽可能接近，其保留时间和定量校正因子应该与待测物尽可能接近，且完全分离。且完全分离。同系物同系物几种定量方法的比较几种定量方法的比较 方法方法项目项目归一化法归一化法内标法内标法外标法外标法计算公式计算公式由

22、工作曲线直接查由工作曲线直接查得得称重配样称重配样不需要不需要需要需要不需要不需要进样量进样量不需准确不需准确不需准确不需准确需准确需准确操作条件稳定性操作条件稳定性一次分析过程中条件一次分析过程中条件需稳定需稳定一次分析过程中条件需一次分析过程中条件需稳定稳定全部过程中条件需全部过程中条件需严格不变严格不变对组分出峰的要求对组分出峰的要求全部组分全部组分内标物及所测组分内标物及所测组分所测组分所测组分校正因子校正因子需全部组分的校正因需全部组分的校正因子子需内标及所测组分的校需内标及所测组分的校正因子正因子(没有亦可没有亦可)不需要不需要使用检测器使用检测器通用型检测器通用型检测器选择性检测器有时不适选择性检测器有时不适用用选择性检测器选择性检测器适用范围适用范围多组分试样中各组分多组分试样中各组分含量的分析含量的分析微量组分的精确定量微量组分的精确定量日常控制分析和大日常控制分析和大量同类样品的分析量同类样品的分析