荧光定量PCR技术讲座.ppt

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1、北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司实时荧光定量PCRRealTimeQuantitativePCR内内容容rmiRNA的特点及检测的特点及检测r荧光定量荧光定量PCR检测检测microRNA长度2024nt 单链小分子RNA与目标基因3端非编码区的识别位点相结合导致目标基因mRNA分子稳定性下降，半衰期变短，或mRNA分子结构变化（5脱帽），从而表达水平下降。3AAAAAAAA5capmiRNA作用靶点编码区编码区mRNAmicroRNA分子功能分子功能microRNA的来源的来源miRNA前体与成熟体靶点识别靶点识别不严格互补配对不严格互补配对一个miRNA可调节多个基

2、因一个基因可受多个miRNA调控60%人类蛋白基因受miRNA调控miRNA 与 siRNA的异同分子形式无区别，都是由分子形式无区别，都是由Dicer产生的产生的22nt小分子小分子分子功能近似，都导致目标基因表达水平分子功能近似，都导致目标基因表达水平下降，但通常下降，但通常siRNA效果更剧烈效果更剧烈产生来源不同产生来源不同miRNA有其基因，内源性表达有其基因，内源性表达siRNA多数情况下为人工外源导入多数情况下为人工外源导入miRNA siRNAmiRNA 与 siRNA的异同miRNA 检测与定量经典方法:放射标记Northern杂交miRNA芯片基因表达谱 基本原理：某物种全

3、部已知miRNA集中于一张芯片，点杂交检测各miRNA丰度所回答的问题：哪些miRNA是你所应该关注的优点：高通量，全景观察缺点：敏感度、特异性均有限，适用于初筛需后续验证：荧光定量PCRPre-miRNA检测必要性：不排除miRNA从前体到成熟体，从核内转运到核外的过程中存在调控机制的可能。Specific miRNA quantification by real time PCR way to go关键难点丰度低解决办法:小RNA提取太短解决办法:加长序列高度相似miRNA之间难以区分解决办法:特殊设计的检测方法；小心设计引物与反应优化解决miRNA丰度难题 基本原理影响RNA分子与硅胶柱

4、结合的因素 离液剂chaotropic agent，如盐酸胍 离子强度，如NaCl 小分子有机溶剂，如乙醇精心调整各组份配比，达成大、小RNA与硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量RNA，富集小分子量RNA小小RNARNA提取提取 M 1 2 3M：Marker#1：康为柱式分离的小片段：康为柱式分离的小片段RNA#2：康为柱式分离的总：康为柱式分离的总RNA#3：沉淀法得到的总：沉淀法得到的总RNA提取小分子量RNA成熟成熟miRNAqPCR检测检测-Poly(A)加尾法加尾法优点：简单直接，高效。一次逆转录获得的cDNA可用于多个目标分子的检测。成熟成熟miRNAqPCR检测检测茎环法茎

5、环法优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测检测方法选择依样本特性，检测目标多寡而定康为技术服务经验举例：复旦大学某客户miRNA芯片提示10个miRNA在病人与正常人之间有显著差异表达要求从66个外周血RNA样本中检测这10个miRNA加尾法，5个目标获得良好检测茎环法，4个目标获得良好检测1个目标的检测很难，尝试多种引物设计，调整反应体系康为康为miRNA产品产品小小RNA提取试剂盒提取试剂盒加尾法加尾法 miRNA cDNA第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒miRNA荧光定量荧光定量PCR检测试剂盒检测试剂盒 CW0627 CW2

6、141 CW2142康为康为miRNA检测服务检测服务全套全套miRNA检测：从生物样本到数据检测：从生物样本到数据茎环法茎环法miRNA检测引物：定制检测引物：定制(RealtimeQuantitativePCR)rmiRNA的特点及检测的特点及检测r荧光定量荧光定量PCR检测检测内内容容PCR：伟大的天才发明 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrologyPCR：理想与现实起点定量起点定量终点定量终点定量起点定量检测起点定量检测：-起点量是样本中未经起点量是

7、样本中未经PCRPCR放大放大之前的模板量之前的模板量-具有重现性，误差小具有重现性，误差小-“加入了加入了500500个拷贝个拷贝”终点定量检测终点定量检测：-终点产物量经过终点产物量经过PCRPCR放大的放大的DNADNA量量-不恒定，误差大不恒定，误差大-“生成了生成了500500，00000000，00000000个拷贝个拷贝”扩增曲线扩增曲线-Ct值：值：q模板模板DNA量越多，量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，越少，即即Ct值越小。值越小。确定模板初始数量？Real-time PCR:检测原理非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：SYBR

8、Green I 特异性荧光标记：特异性荧光标记：水解探针：水解探针：TaqMan非水解探针：非水解探针：Molecular beacon RQReporterQuencherRQ5353SGSGSGSG5353SGSGSGSGEmissionExcitationlSYBR Green I SYBR Green I 是一种与双链是一种与双链DNADNA小沟结合的荧光染料。小沟结合的荧光染料。lSYBR Green ISYBR Green I只与双链只与双链DNADNA结合才能发出荧光。结合才能发出荧光。l荧光信号的强度与反应体系中所有双链荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNADNA分子成正比。

9、分子成正比。SYBRGreenI工作原理工作原理 Taqman工作原理工作原理 在退火过程中，探针与靶序列结合在退火过程中，探针与靶序列结合探针被探针被TaqTaq酶的酶的5 5-3-3 外切酶活性剪切成片断外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离在延伸过程中，探针部分与靶序列分离荧光信号强度与结合探针的荧光信号强度与结合探针的DNADNA分子成正比。分子成正比。染料法与探针法染料法与探针法 对比对比探针法探针法特异性高特异性高-与探针与特异靶序列结合与探针与特异靶序列结合对模板有选择性对模板有选择性-可进行多重可进行多重PCRPCR反应反

10、应成本高成本高-不同靶基因需要合成不同不同靶基因需要合成不同探针探针染料法染料法通用性好通用性好-对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性使用方便，成本低使用方便，成本低-仅需设计两个引物仅需设计两个引物有假阳性现象有假阳性现象-通过融解曲线判断通过融解曲线判断Real-time PCR 应用应用基因表达分析基因表达分析-相对定量：相对定量：基因表达量的差异基因表达量的差异-绝对定量：绝对定量：样本中核酸的量（拷贝数、微克）样本中核酸的量（拷贝数、微克）基因型分析基因型分析-SNP-SNP检测检测 等位基因检测等位基因检测 甲基化检测甲基化检测 基因表达分析检测基因表达分析检测testsa

11、mple处理样本处理样本targetgene目的基因目的基因referencegene内参基因内参基因totalRNAcDNAcalibratorsample对照样本对照样本targetgene目的基因目的基因referencegene内参基因内参基因qPCR以各自样本中内参基因为标杆，以各自样本中内参基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度。比较两样本中目的基因的相对丰度。数据分析数据分析qPCRcDNAtotalRNA 内参基因的选择特点特点选择内参基因选择内参基因内参基因内参基因beta-actinbeta-actin、GAPDHGAPDH、18S rRNA18S rRNA、28S r

12、RNA28S rRNA等等-文献检索文献检索-实验筛选实验筛选选择多个备选内参基选择多个备选内参基因，以备选内参基因因，以备选内参基因的几何平均数作为均的几何平均数作为均一化标准一化标准内参基因内参基因HousekeepingGene-RNA-RNA抽提、反转录为抽提、反转录为cDNAcDNA的效率不同，用于定量分析的的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。样本初始浓度不同。对样本初始浓度差异进行均一化校正。对样本初始浓度差异进行均一化校正。不同环境，不同器不同环境，不同器官、组织、细胞类官、组织、细胞类型之间，表达量相型之间，表达量相对恒定。对恒定。Housekeeping Gene 康

13、为产品康为产品不同丰度：不同丰度：高丰度高丰度 ACTBACTB、GAPDHGAPDH中等丰度中等丰度 beta2Mbeta2M低丰度低丰度 HPRT1HPRT1不同物种：不同物种：人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗鸡、斑马鱼、甘蔗 等等基因表达分析检测基因表达分析检测样本处理与样本处理与RNA提取提取cDNAqPCR内参基因内参基因(housekeepinggene)选择选择样本处理与样本处理与RNARNA提取提取外界刺激外界刺激 1010分钟分钟 可检测的表达改变可检测的表达改变样品离开定义环境样品离开定义环境 2 2分钟内分钟内 固定、裂解细胞固定、

14、裂解细胞RNARNA样本保存液样本保存液 Trizol Trizol 超纯超纯RNARNA提取试剂盒提取试剂盒RNARNA的评价与鉴定的评价与鉴定 -完整性完整性 -纯度纯度 小心小心DNADNA污染！污染！-使用使用DNaseDNase -引物设计引物设计 -以以RNARNA作作PCRPCR阴性对照阴性对照 CW0580 CW0592 CW0581 CW2090A RT-qPCR一步法还是两步法？一步法还是两步法？两步法：两步法：步骤多但灵活多样。步骤多但灵活多样。cDNAcDNA可长期可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。化。推荐：工作的初期阶段

15、，以及单个样本多个靶基因检测。推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。一步法：一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。误差和污染。每次只能做一个基因。推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。逆转录逆转录逆转录引物选择逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？下游应用：是否检测其它基因？Abundant RNAAbundant RNA的干扰：的干扰：mRNA or total RNAmRNA or total RNA？检测灵敏度是否足够？检测灵敏度是否足够？逆转录

16、酶逆转录酶SuperRT SuperRT 逆转录酶（逆转录酶（RNase HRNase H-）HiFi-MMLVHiFi-MMLV逆转录酶（逆转录酶（RNase HRNase H-）引物引物特异性特异性反应效率反应效率Oligo dTOligo dT中中低低Random hexmerRandom hexmer低低中中Specific primerSpecific primer高高高高 CW0741 CW0743总原则与普通总原则与普通PCRPCR相同：相同：l避免引物二聚体，避免二级结构避免引物二聚体，避免二级结构l扩增片段长度（扩增片段长度（80 80 300 bp)300 bp)l推荐做跨

17、推荐做跨intronintron设计设计引物设计原则引物设计原则EXON 1EXON 2INTRON 2DNADNAEXON 1EXON 2RNARNA反应条件优化反应条件优化内参基因内参基因 目的基因目的基因 -融解曲线：融解曲线：单一特异性产物单一特异性产物-扩增曲线：扩增曲线：CtCt值值-标准曲线：标准曲线：扩增效率尽量高，目的基因扩增效率尽量高，目的基因尽可能接近内参基因尽可能接近内参基因反应条件优化反应条件优化融解曲线分析融解曲线分析-单一特异性产物单一特异性产物 将温度对荧光强度的变化求导将温度对荧光强度的变化求导 图图2 2EffciencyEffciencyslopeslop

18、e内参基因内参基因100%100%-3.32-3.32目的基因目的基因Primer 2Primer 278%78%-4.00-4.00 图图1 1EffciencyEffciencyslopeslope内参基因内参基因100%100%-3.32-3.32目的基因目的基因Primer 1Primer 195.36%95.36%-3.43-3.43标准曲线分析标准曲线分析-扩增效率尽量高扩增效率尽量高-目的基因尽可能接近内参基因目的基因尽可能接近内参基因 10%10%以内以内反应条件优化反应条件优化反应条件优化反应条件优化扩增曲线分析扩增曲线分析-Ct-Ct值值 Master Mix的应用-热启动

19、酶热启动酶化学修饰，化学修饰，常温下完全没有聚合酶活性，热复活需常温下完全没有聚合酶活性，热复活需95951010分钟分钟 -GoldStarGoldStar、HotStarHotStar非化学修饰非化学修饰（OligoOligo修饰、抗体修饰、修饰、抗体修饰、MgMg2+2+螯合物）螯合物）热复活仅需热复活仅需9595几十秒几十秒 -FastStarFastStar-Buffer-Buffer反应增强剂反应增强剂 -减少引物二聚体，进一步提高反应特异性减少引物二聚体，进一步提高反应特异性 -对于复杂模板，提高反应效率对于复杂模板，提高反应效率稳定剂稳定剂-dNTPdNTPMaster Mix

20、的应用的应用ROX Passive ReferenceROX Passive Reference不参与、不干扰不参与、不干扰PCRPCR反应反应恒定发射荧光信号恒定发射荧光信号用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。的系统误差。需参照仪器要求选择。需参照仪器要求选择。误差控制误差控制使用使用Master mixMaster mix配置预混体系配置预混体系设置生物学重复设置生物学重复 （不同个体）（不同个体）技术性重复（复孔）技术性重复（复孔）阴性对照阴性对照 荧光定量荧光定量PCRPCR体系体系2-Ct法法满足条件：满足条件：1 1）内参

21、基因和目标基因的扩增效率接近）内参基因和目标基因的扩增效率接近-正负正负10%10%2 2）内参基因和目标基因的扩增效率基本为）内参基因和目标基因的扩增效率基本为90%-110%90%-110%相对定量数据分析1 1、目标基因的、目标基因的CTCT值值-内参基因的内参基因的CTCT值值2 2、待测样本的、待测样本的CTCT值值-对照样本的对照样本的CTCT值值3 3、计算表达水平比率：、计算表达水平比率：2 2 CTCT=表达量的比值表达量的比值2 2-Ct-Ct 法法目的目的基因基因内参内参基因基因目的基因目的基因-内参基因内参基因CtCt待测样本待测样本-对照样本对照样本CtCt倍数值倍数

22、值foldfold2 2-Ct-Ct 对照样本对照样本30.48530.48523.62523.6256.866.860 01 1待测样本待测样本27.02527.02522.6622.664.3654.365-2.495-2.4955.637285.63728Trouble shooting 常常常常见问题见问题见问题见问题 可能原因可能原因可能原因可能原因 解决方法解决方法解决方法解决方法Housekeeping geneHousekeeping gene无信号无信号RNARNA降解降解用新用新鲜组织鲜组织提取提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping g

23、ene 有信号有信号而目而目标标基因无信号基因无信号1.1.目的基因表达低。目的基因表达低。逆逆转录转录效率不高效率不高2.PCR2.PCR引物不良引物不良1.1.富集富集mRNA mRNA 2.2.在逆在逆转录转录中中尝试尝试不同引物，如特异引物。不同引物，如特异引物。3.3.尝试尝试不同不同PCRPCR引物。减小引物。减小产产物大小，改物大小，改换换目目标标 区段，考区段，考虑虑不同剪接体。不同剪接体。4.4.尝试尝试不同不同热热循程序，降低复性温度。循程序，降低复性温度。Housekeeping geneHousekeeping gene反反应应效率正常效率正常,但但目目标标基因放大效率

24、不高基因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新重新设计设计引物，减小引物，减小产产物大小，改物大小，改换换目目标标区段，区段，考考虑虑不同剪接体不同剪接体目目标标基因表达丰度在基因表达丰度在样样本之本之间间异常一致异常一致RNARNA被基因被基因组组DNADNA污污染染1.1.使用跨使用跨intronintron 引物引物2.2.用用DNaseDNase处处理理RNARNA3.3.确保确保RNARNA阴性阴性对对照表照表现现阴性阴性溶解曲溶解曲线线出出现杂现杂峰峰1.1.出出现现非特异非特异PCRPCR产产物物2.2.出出现现引物二聚体引物二聚体1.1.尝试尝试不同不同PCRPCR引物引

25、物2.2.尝试尝试不同不同热热循程序，升高复性温度循程序，升高复性温度3.3.修改修改仪仪器器设设置，将置，将检测检测温度温度设设定在在引物二聚定在在引物二聚体解体解链链温度与温度与PCRPCR特异特异产产物解物解链链温度之温度之间间。阴性阴性对对照在照在3030个循个循环环以内出以内出现现信号信号试剂试剂被被污污染染1.1.注意区分信号是来自引物二聚体注意区分信号是来自引物二聚体还还是是PCRPCR产产物物 查查找，替找，替换污换污染染试剂试剂2.2.使用使用UNGUNG系系统统。荧光定量产品荧光定量产品-染料法染料法FastSYBRMixtureUltraSYBRMixturelGoldS

26、tarTaql特异性强特异性强l灵敏度高灵敏度高lCt值更低值更低l线性范围更广线性范围更广l定量更准确定量更准确l反应速度快反应速度快l比普通反应可节比普通反应可节省约省约40分钟分钟l适合于普通和快适合于普通和快速定量速定量PCR程序程序荧光定量产品荧光定量产品-染料法染料法某其它品牌某其它品牌康为康为UltraSYBR-cDNAcDNA用内参用内参actinactin引物进行扩增，产引物进行扩增，产物片段物片段100bp100bp。-模板浓度进行模板浓度进行1010倍稀释，稀释倍稀释，稀释6 6个梯个梯度。度。康为世纪产品康为世纪产品RNARNA-Trizol -Trizol -超纯超纯

27、RNARNA提取试剂盒提取试剂盒-动物组织动物组织RNA -RNA -植物植物RNA -RNA -血液血液RNA-RNA-病毒病毒RNARNA 逆转录逆转录-SuperRT/HiFi-MMLV-SuperRT/HiFi-MMLV逆转录酶逆转录酶 -cDNA-cDNA第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒 -RT-PCR-RT-PCR 一步法、两步法试剂盒一步法、两步法试剂盒荧光定量荧光定量PCRPCR-UltraSYBR Mixture -FastSYBR Mixture-UltraSYBR Mixture -FastSYBR Mixture-GoldStar Taqman Mixture-Gold

28、Star Taqman MixturePCRPCR-GoldStar DNA Polymerase-GoldStar DNA Polymerase-Taq/Es Taq DNA Polymerase -Taq-Taq/Es Taq DNA Polymerase -Taq/EsTaqMaster MixMaster Mix外包服务外包服务Housekeepinggene引物序列？反应条件？引物序列？反应条件？目标基因目标基因引物序列？反应条件？引物序列？反应条件？选择试剂，摸索条件，优化参数选择试剂，摸索条件，优化参数两个月？两个月？CoWin解决方案一：解决方案一：Primerassay客户指

29、定：物种，客户指定：物种，housekeepinggene，目标基因，目标基因客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，MasterMix客户下游工作：客户下游工作：Real-timePCR数据获取数据获取CoWin解决方案二：全套解决方案二：全套qPCR服务服务客户指定：物种，客户指定：物种，housekeepinggene，目标基因，目标基因客户提供：生物样本客户提供：生物样本客户得到：数据报告，剩余样品。客户得到：数据报告，剩余样品。客户下游工作：写论文客户下游工作：写论文;得诺贝尔奖得诺贝尔奖北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司总机：总机：免费电话：免费电话：4006-222-3604006-222-360网址：网址：E-mail:E-mail: