第十一章荧光分析法优秀PPT.ppt

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1、第十一章荧光分析法第一页，本课件共有46页荧光荧光*http:/ 用荧光来进行定性定量的分析方法用荧光来进行定性定量的分析方法荧光分析法。荧光分析法。光照光照 分子基态分子基态 激发态激发态 辐射跃迁辐射跃迁 荧光荧光可见可见-紫外光源紫外光源 分子荧光分析分子荧光分析 由荧光波长可确定物质分子结构由荧光波长可确定物质分子结构 由荧光强度可测物质的含量由荧光强度可测物质的含量 第三页，本课件共有46页 1 1 荧光分析法基本原理荧光分析法基本原理 一、分子荧光一、分子荧光（一）、分子荧光的产生（一）、分子荧光的产生 分子在辐射能的照射下，电子跃迁至分子在辐射能的照射下，电子跃迁至单重激发态单重

2、激发态，并以，并以无无辐射弛豫方式辐射弛豫方式回到回到第一第一单重激发态的单重激发态的最低振动能级最低振动能级，由此，由此再跃回再跃回基态或基态中其它振动能级时基态或基态中其它振动能级时所发出的光。所发出的光。第四页，本课件共有46页 基态和激发态基态和激发态 单重态和三重态单重态和三重态 辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）激发单重态：激发单重态：用用S表示，表示，受激电子的自旋方向不变，与受激电子的自旋方向不变，与基态电子自旋方向相反。基态电子自旋方向相反。激发三重态：激发三重态：用用T表示，表示，受激电子自旋反转，与基态电受激电子自旋反转，与基态电子自旋方向平

3、行。子自旋方向平行。概概 念念单重基态单重基态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态第五页，本课件共有46页单线态与三线态 Mg的基态与第一激发态的基态与第一激发态3s3p单线态单线态S0 单线态单线态S1 三线态三线态T1 S1S0 荧光辐射荧光辐射 T1S0 磷光辐射磷光辐射禁阻跃迁，改变自旋后S1T1S0S0第六页，本课件共有46页激发单重态激发单重态S与激发三重态与激发三重态T的不同点：的不同点：1.能量高能量高2.激发单重态激发单重态平均寿命短平均寿命短，tS=10-8s,3.基态单重态到激发单重态的基态单重态到激发单重态的激发为激发为允许允许跃迁跃迁1.能量低能量低2.激发三重态

4、激发三重态平均寿命长平均寿命长，tS=10-4-1s,3.基态单重态到激发三重态的基态单重态到激发三重态的激发为激发为禁阻禁阻跃迁跃迁激发单重态激发单重态S激发三重态激发三重态T第七页，本课件共有46页第八页，本课件共有46页荧荧 光光 形形 成成 机机 制制单重态单重态第第二二激激发发态态第第一一激激发发态态三重态三重态荧荧光光磷磷光光内转换内转换体系跨体系跨越越振振动动弛弛豫豫基基态态振振动动弛弛豫豫第九页，本课件共有46页荧光产生荧光产生过程过程荧光的产生荧光的产生eeee第十页，本课件共有46页荧光荧光磷光磷光处于处于第一电子激发单重第一电子激发单重态最低振动能级的分子态最低振动能级的

5、分子发射光量子回到基态各发射光量子回到基态各振动能级振动能级，这一过程，这一过程为荧光发射为荧光发射处于第一电子激发处于第一电子激发三重三重态态最低振动能级的分最低振动能级的分子发射光量子回到基子发射光量子回到基态各振动能级，这一态各振动能级，这一过程为磷光发射。过程为磷光发射。不同点不同点起源不同起源不同波长不同波长不同寿命不同寿命不同第十一页，本课件共有46页吸收吸收峰峰磷磷光光峰峰荧光峰荧光峰第十二页，本课件共有46页 激发激发 光源光源 单色器单色器 样品池样品池 It F 单色器单色器 检测器检测器 发射发射 记录记录I0透过光透过光(二二)、荧光的激发和发射光谱、荧光的激发和发射光

6、谱荧光的检测荧光的检测第十三页，本课件共有46页荧光光谱固定发射波长固定发射波长，改，改变激发波长，测荧变激发波长，测荧光强度和激发光波光强度和激发光波长的关系。长的关系。固定激发波长，固定激发波长，（为最大激发波为最大激发波长），长），测不同波测不同波长时的荧光强度。长时的荧光强度。荧光的激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱第十四页，本课件共有46页200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱第十五页，本课件共有46页第十六页，本课件共有46页Stokes位移：位移：荧光波长一般比激发

7、波长要长荧光波长一般比激发波长要长(前者能量较低前者能量较低)荧光光谱形状与激发波长无关；荧光光谱形状与激发波长无关；荧光光谱与激发光谱形状相似，呈镜像对称。荧光光谱与激发光谱形状相似，呈镜像对称。第十七页，本课件共有46页镜像对称规则镜像对称规则 通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（激激发发光光谱谱）成成镜镜像像对对称关系。称关系。荧光光谱特征荧光光谱特征第十八页，本课件共有46页 荧光产生的必要条件荧光产生的必要条件 有吸收结构有吸收结构有高的有高的荧光效率荧光效率二、二、荧光与分子结构荧光与分子结构第十九页，本课件共有46页（一）（一）、荧光效率（、荧光效率（f

8、luorescence efficiencyfluorescence efficiency）第二十页，本课件共有46页分子结构与荧光的关系长共轭结构长共轭结构分子的刚性取代基类型共轭高荧共轭高荧光效率高光效率高刚性平面使刚性平面使荧光效率高荧光效率高1、给电子基团使荧光增强-OH,-OCH3,-NH2,-CN,-NR2;2、吸电子基团使荧光减弱-COOH,-NO2,-SH,-C=O,-X;3、-R,-SO3H,-NH3+等基团对荧光影响不明显。第二十一页，本课件共有46页第二十二页，本课件共有46页第二十三页，本课件共有46页第二十四页，本课件共有46页三、影响荧光强度的外部因素 A A、温度

9、影响、温度影响 温度上升，荧光减弱温度上升，荧光减弱 B B、溶剂的影响、溶剂的影响 增大溶剂的极性使荧光增强增大溶剂的极性使荧光增强 含重原子的溶剂（含重原子的溶剂（e.g.CBre.g.CBr4 4）使荧光减弱）使荧光减弱溶剂粘度降低荧光强度减弱溶剂粘度降低荧光强度减弱 C C、酸度的影响、酸度的影响 D D、荧光熄灭剂、荧光熄灭剂 激激发发分分子子与与溶溶剂剂分分子子或或其其它它溶溶质质分分子子的的相相互互 作作用用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消失。使能量转移，荧光强度减弱甚至消失。E E、散射光、散射光第二十五页，本课件共有46页第二十六页，本课件共有46页散射光干扰及消除散射光：当

10、一束平行光投射在液体试样上，大部分被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的光。散射光包括瑞利散射光和拉曼光瑞利散射光：无能量的交换，散射激发拉曼光：有能量转移，散射 激发第二十七页，本课件共有46页第二十八页，本课件共有46页干扰的消除干扰的消除1）改变激发光的波长；2）更换溶剂；CCL4的拉曼光与激发光波长相近，其拉曼光几乎不干扰荧光测定。第二十九页，本课件共有46页2 荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系 I0 I F 在在ECl0.05时时，F=K C,溶液的荧光强度与溶液中荧光物溶液的

11、荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；质的浓度呈线性关系；在在ECl0.05，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈线性关系；线性关系；荧光分析法的测定灵敏度高。荧光分析法的测定灵敏度高。第三十页，本课件共有46页泰勒级数展开即吸收的强度入射的出射的A=kbc定量关系第三十一页，本课件共有46页通常 A0.05If与A 的关系A与c正比，低浓度泰勒级数展开，仅取一项，x越小越符合定量关系第三十二页，本课件共有46页二、定量分析法二、定量分析法校正曲线法校正曲线法比例法比例法 第三十三页，本课件共有46页 F=F=K K（I I0 0-I-I）=K

12、=K（I I0 0-I-I）=K =K（1-101-10ECLECL）=K=K（1-e1-e2.3ECL2.3ECL）=2.3K =2.3KI I0 0ECLECL =KC =KC ECLECL0.050.050.05时，荧光强度同浓度的线性关系将向浓度轴偏离。荧光强度与物质浓度的关系第三十四页，本课件共有46页分光法与荧光法定量比较 UV-VISUV-VIS分光法分光法 荧光法荧光法定量基础定量基础 A=lgI A=lgI0 0/I F/I F C C灵敏度灵敏度 与与 有关有关 与与 有关有关检测限检测限 10 10-6-6-10-10-9-9 10 10-9-9-10-10-12-12

13、灵敏度高选择性好灵敏度高选择性好第三十五页，本课件共有46页光源单色器1样品池单色器2检测器放大与记录垂直方向3 荧光光度计 第三十六页，本课件共有46页 与分光光度计的主要差别与分光光度计的主要差别 垂直测量方式垂直测量方式,消除透射光影响消除透射光影响 两个单色器两个单色器，激发和发射，常用光栅，激发和发射，常用光栅荧光仪特点荧光仪特点第三十七页，本课件共有46页 1 1 光源光源 A A、白炽灯：钨灯、卤钨灯、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B B、气体放电灯：氢、氙、汞，、气体放电灯：氢、氙、汞，常用常用氙氙灯（波长：灯（波长：250-700nm 250-700nm）C C、激光光源、激光光源

14、2 2 单色器单色器 闪耀光栅闪耀光栅3 3 检测器检测器 光电倍增管光电倍增管 第三十八页，本课件共有46页4 分子荧光分析法的在药学中的应用1.1.无机阳离子发生荧光的很少，但很多能与一些有机试剂形成无机阳离子发生荧光的很少，但很多能与一些有机试剂形成荧光络合物而被测定；荧光络合物而被测定；2.2.一些阴离子能使荧光减弱，可利用荧光猝灭法测定；一些阴离子能使荧光减弱，可利用荧光猝灭法测定；3.3.脂肪族有机物分子能发生荧光的也不多，可与某些有机试剂脂肪族有机物分子能发生荧光的也不多，可与某些有机试剂反应后生成会发射荧光的衍生物加以测定；反应后生成会发射荧光的衍生物加以测定；第三十九页，本课

15、件共有46页4.4.芳香族化合物因有共轭结构，多数能发射荧光；芳香族化合物因有共轭结构，多数能发射荧光；5.5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成强荧光衍生物以提高测量灵敏度。强荧光衍生物以提高测量灵敏度。故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚广。广。第四十页，本课件共有46页1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？荧光和磷光在产生机制上有什么不同？2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？何谓荧光量子效率

16、？哪些结构物质有较高荧光效率？3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（以下物质中可能有最强荧光的物质是（）。）。思思 考考 题题第四十一页，本课件共有46页4.荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是().A.激发光激发光;B.磷光磷光;C.拉曼光拉曼光;D.容器表面产生的散射光容器表面产生的散射光5 测量荧光强度时测量荧光强度时,要在与入射光成直角的方向测量要在与入射光成直角的方向测量,这是因为这是因为().A.只有在与入射光成直角的方向上才有荧光只有在与入射光成直角的方向上才有荧光;B.在成直角方向测量可以避免散射光的影响在成直角方向测量可以避免散射光的影响;C.在成

17、直角方向测量可免除透射光的影响在成直角方向测量可免除透射光的影响;D.荧光的强度比入射光强荧光的强度比入射光强6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。7.荧光光谱的特征？荧光光谱的特征？第四十二页，本课件共有46页1.所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光射光()。A.波长长的光线波长长的光线 B.波长短的光线波长短的光线 C.能量大的光线能量大的光线 D.频率高的光线频率高的光线2.下列说法正确的是下列说法正确的是()A 荧光发射波长永远大于激发波

18、长荧光发射波长永远大于激发波长 B 荧光发射波长永远小于激发波长荧光发射波长永远小于激发波长 C 荧光光谱形状与激发波长无关荧光光谱形状与激发波长无关 D 荧光光谱形状与激发波长有关荧光光谱形状与激发波长有关3荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是()A.单色光单色光 B.ECl0.05 C.入射光强度入射光强度I0一定一定 D.样品池厚度一定样品池厚度一定第四十三页，本课件共有46页判断题判断题1荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂中具有相同的荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂中具有相同的荧光

19、光谱。荧光光谱。2荧光光谱的形状与激发光谱的形状常形成镜像对称。荧光光谱的形状与激发光谱的形状常形成镜像对称。3在一定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关系。即：在一定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关系。即：4.荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光光谱。荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光光谱。5荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光 路为一条直线。路为一条直线。第四十四页，本课件共有46页未经任何处理即可用于细胞标记未经任何处理即可用于细胞标记第四十五页，本课件共有46页用量子点检测肿瘤细胞用量子点检测肿瘤细胞第四十六页，本课件共有46页