微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量.ppt

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1、微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、实验目的一、实验目的l掌握微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量的原理掌握微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量的原理和操作技术。和操作技术。二、实验原理二、实验原理l天然含氮有机化合物（如蛋白质）与浓硫酸共热时分天然含氮有机化合物（如蛋白质）与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在克氏定氮仪中解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在克氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸

2、气加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（进行滴定，滴定所用无机酸的量（molmol）相当于被测样）相当于被测样品中氨的量（品中氨的量（molmol），根据所测得的氨量即可计算样品），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。的含氮量。l因为蛋白质含氮量通常在因为蛋白质含氮量通常在16%16%左右，所以将克氏定左右，所以将克氏定氮法测得的含氮量乘上系数氮法测得的含氮量乘上系数6.256.25，便得到该样品，便得到该样品的蛋白质含量。的蛋白质含量。l 整个反应过程可分为消化

3、、蒸馏及滴定三整个反应过程可分为消化、蒸馏及滴定三大步骤。大步骤。l 样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，氮转变出的氨，进一步与硫酸作用生成碳和水，氮转变出的氨，进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程通常称之为硫酸铵，此过程通常称之为“消化消化”。l但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以加快反应速度。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下：以加快反应速度。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下：CH3

4、NH2COOH+3H2SO4 3CO2+3SO2+4H2O+NH3 CH3NH2COOH+3H2SO4 3CO2+3SO2+4H2O+NH3 （1 1）2NH3+H2SO4 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4(NH4)2SO4 （2 2）(NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 (NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 （3 3）l 反应（反应（1 1）、（）、（2 2）在克氏定氮烧瓶中完成。反应）在克氏定氮烧瓶中完成。反应（3 3）在克氏定氮仪内进行。）在克氏定氮仪内进行。l浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨。借水蒸气将浓碱可使消化液

5、中的硫酸铵分解，游离出氨。借水蒸气将产生的氨蒸馏到定量、定浓度的硼酸溶液中，氨与溶液中产生的氨蒸馏到定量、定浓度的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。后用标准无机酸滴定至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。三、实验器材l1 1微量克氏定氮仪：参见图微量克氏定氮仪：参见图5-15-1，1 1套套/组。组。l2 2克氏定氮烧瓶：克氏定氮烧瓶：2 2只只/组。组。3取样器：

6、，5mL、1 mL各1只/组。使用指南：接好套头（不漏气）使用指南：接好套头（不漏气）通过旋钮调节容量（如通过旋钮调节容量（如500500表示表示5mL5mL）用活塞第一挡吸液用活塞第一挡吸液用活塞第一挡和第二用活塞第一挡和第二挡放液挡放液换套头换套头继续使用。注意，平时取样器应挂在架继续使用。注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。l4 4电炉：公用。电炉：公用。l5 51 1微量滴定管（微量滴定管（5 mL5 mL）：）：1 1只只/2/2组。组。l6 6酒精灯：酒精灯：1 1只只/组。组。l7 7锥形瓶（

7、锥形瓶（100 mL100 mL）：）：4 4只只/组。组。l8 8铁架台、十字夹、龙爪、打火机、表面皿、吸管、量铁架台、十字夹、龙爪、打火机、表面皿、吸管、量筒等。筒等。五、实验操作五、实验操作l.消化：将两个消化：将两个50mL50mL的克氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口的克氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加附近），一只烧瓶内加1.0mL1.0mL蒸馏水，作为空白。另一蒸馏水，作为空白。另一只烧瓶内加入只烧瓶内加入1.0mL1.0mL样液（卵清蛋白液）。然后用取样样液（卵清蛋白液）。然后用取样器各加浓硫酸器各加浓硫酸2mL2mL（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤

8、上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾硫酸铜混也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾硫酸铜混合物约合物约20mg20mg（不必称重，一点点即可），所有试剂要（不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到克氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗尽量加到克氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，参见图参见图5-35-3，注意先启动抽风机。消化时间为，注意先启动抽风机。消化时间为2 24h4h。在消化时可以同时进行第二步。在消化时可以同时进行第二步。消化装置l.蒸馏：取蒸馏：取100mL100mL锥形瓶锥形瓶3 3只，洗

9、涤干净，用取样器各加只，洗涤干净，用取样器各加入入2%2%硼酸溶液硼酸溶液5.0mL5.0mL，加入几滴指示剂，溶液显紫色，用，加入几滴指示剂，溶液显紫色，用l表面皿盖好备用。如锥形瓶内液体呈绿色，需重新洗涤。表面皿盖好备用。如锥形瓶内液体呈绿色，需重新洗涤。l安装好微量克氏定氮仪。微量克氏定氮仪实际上是一套蒸安装好微量克氏定氮仪。微量克氏定氮仪实际上是一套蒸馏装置，注意保证每个夹子夹紧而不漏气，保证加样口馏装置，注意保证每个夹子夹紧而不漏气，保证加样口的小漏斗口朝上并斜靠在定氮仪上（这可以通过调整其下的小漏斗口朝上并斜靠在定氮仪上（这可以通过调整其下方夹子的方位来实现）。方夹子的方位来实现）

10、。la)a)蒸馏瓶的洗涤蒸馏瓶的洗涤l l参见图参见图5-65-6，将自来水由，将自来水由5 5经经7 7注入到蒸馏瓶夹层注入到蒸馏瓶夹层2 2（即蒸汽（即蒸汽发生室）中，使水面达到蒸馏瓶颈部的转弯处。把装有蒸发生室）中，使水面达到蒸馏瓶颈部的转弯处。把装有蒸馏水的锥形瓶馏水的锥形瓶9 9置于冷凝器置于冷凝器4 4下方，并将冷凝器下方的导管下方，并将冷凝器下方的导管1212下端插入锥形瓶液面以下，再将少量蒸馏水由漏斗下端插入锥形瓶液面以下，再将少量蒸馏水由漏斗3 3注注入到蒸馏瓶的反应室入到蒸馏瓶的反应室1 1中，把所有夹子夹紧，打开冷凝水。中，把所有夹子夹紧，打开冷凝水。用酒精灯用酒精灯11

11、11将蒸馏瓶夹层将蒸馏瓶夹层2 2内的水煮沸，然后移去火源，内的水煮沸，然后移去火源，锥形瓶锥形瓶9 9中的蒸馏水就会从冷凝器下方的导管中的蒸馏水就会从冷凝器下方的导管 12 12倒流到蒸倒流到蒸馏瓶的反应室馏瓶的反应室1 1内，再倒流至蒸馏瓶的夹层内，再倒流至蒸馏瓶的夹层2 2中，由废液排中，由废液排出口出口8 8排出。按照上述方法将仪器洗涤排出。按照上述方法将仪器洗涤2 23 3次。最后，反次。最后，反应室应室1 1中的余液可以按下法清空：把所有夹子夹紧，将蒸中的余液可以按下法清空：把所有夹子夹紧，将蒸馏瓶夹层馏瓶夹层2 2内的水煮沸，先移去锥形瓶内的水煮沸，先移去锥形瓶9 9，然后移去火

12、源，然后移去火源，反应室反应室1 1中余液将倒流至夹层中余液将倒流至夹层2 2中，由中，由7 7排出。以后每次在排出。以后每次在做下一次蒸馏之前都要先将蒸馏瓶洗涤做下一次蒸馏之前都要先将蒸馏瓶洗涤2 23 3次，并将反应次，并将反应室室1 1清空。清空。lb)b)空白和样品的蒸馏空白和样品的蒸馏 把装有把装有5.0mL5.0mL的的2%2%硼酸溶液的锥形瓶硼酸溶液的锥形瓶9 9置于冷凝器的下方，将冷凝器下置于冷凝器的下方，将冷凝器下方的导管方的导管1212下端插入液面以下，锥形瓶内须事先加入指示剂（注意此下端插入液面以下，锥形瓶内须事先加入指示剂（注意此时的颜色，它将是后面滴定终点的颜色）。先

13、将克氏烧瓶中消化好了时的颜色，它将是后面滴定终点的颜色）。先将克氏烧瓶中消化好了的空白消化液由小漏斗的空白消化液由小漏斗3 3注入到蒸馏瓶的反应室注入到蒸馏瓶的反应室1 1中，用蒸馏水洗涤克中，用蒸馏水洗涤克氏烧瓶氏烧瓶2 2次（每次约次（每次约2mL2mL），洗涤液皆由漏斗），洗涤液皆由漏斗3 3注入反应室注入反应室1 1。用取样器。用取样器取取40%40%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液10mL10mL，注入小漏斗（小漏斗必须始终保持口朝上，注入小漏斗（小漏斗必须始终保持口朝上的状态），放松夹子，使其缓缓流入反应室的状态），放松夹子，使其缓缓流入反应室1 1。当小漏斗内仍有少量。当小漏斗内仍有少量

14、NaOHNaOH溶液时，立即夹紧夹子（以上操作勿将溶液时，立即夹紧夹子（以上操作勿将NaOHNaOH溶液溅到衣物和皮肤溶液溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上）。再加约上，也不要洒到实验桌上）。再加约3mL3mL蒸馏水于小漏斗内，同样缓蒸馏水于小漏斗内，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。把所有夹子夹紧，打开缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。把所有夹子夹紧，打开冷凝水，开始用酒精灯加热，将蒸馏瓶夹层冷凝水，开始用酒精灯加热，将蒸馏瓶夹层2 2内的水煮沸。注意，在内的水煮沸。注意，在样品蒸馏的整个过程中，要保持火苗的稳定，严禁中途移去火源，以样品蒸馏的整个过程中，要保持火苗的稳定

15、，严禁中途移去火源，以防倒吸。从蒸馏瓶内的水溶液沸腾开始计算时间，大约防倒吸。从蒸馏瓶内的水溶液沸腾开始计算时间，大约10min10min即可蒸即可蒸馏完毕。将导管馏完毕。将导管1212的下端抽出液面，继续蒸馏的下端抽出液面，继续蒸馏1min1min，使导管内的余液，使导管内的余液落回锥形瓶落回锥形瓶9 9中，移开锥形瓶，用表面皿盖好等待滴定。移去火源，中，移开锥形瓶，用表面皿盖好等待滴定。移去火源，反应室反应室1 1中的残液将会倒流至夹层中的残液将会倒流至夹层2 2中，由中，由8 8排出。将蒸馏瓶洗涤排出。将蒸馏瓶洗涤2 23 3次，并将反应室次，并将反应室1 1清空，按空白蒸馏的方法进行样

16、品蒸馏。清空，按空白蒸馏的方法进行样品蒸馏。改良式微量克氏定氮仪各部示意图 l.滴定：参见图滴定：参见图5-65-6，将微量，将微量滴定管先后用蒸馏水和滴定管先后用蒸馏水和0.01mol/L0.01mol/L的的HClHCl溶液润洗，用溶液润洗，用洗耳球将洗耳球将0.01mol/L0.01mol/L的的HClHCl溶液溶液吸入微量滴定管中，滴定锥形吸入微量滴定管中，滴定锥形瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色（也就是前面加了指示剂后的（也就是前面加了指示剂后的标准硼酸溶液的颜色）。记录标准硼酸溶液的颜色）。记录所耗所耗HClHCl溶液毫升数。溶液毫升数。l.再次将蒸馏瓶洗涤干净

17、，拆卸克氏定氮仪装置，清洗再次将蒸馏瓶洗涤干净，拆卸克氏定氮仪装置，清洗所使用过的所有玻璃仪器，清洗取样器套头，整理好桌面所使用过的所有玻璃仪器，清洗取样器套头，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。实验报告当场交给老师。l计算计算 样品含氮量（）样品含氮量（）0.014 0.014（A A-B B）100100 A A：滴定滴定样品用去的样品用去的HClHCl溶液毫升数；溶液毫升数；B B：滴定空白用去的滴定空白用去的HClHCl溶液毫升数；溶液毫升数；样品中蛋白质含量（）样品中蛋白质含量（）=样品含氮量（）样品含氮量（）/0.16/0.16 记录与计算汇总记录与计算汇总 A（mL）B（mL）含氮量（）蛋白质含量（）