微生物学第四章 2015.ppt

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1、|微生物学第四章 2015|Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深|Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望第第四四章章微微生生物物的的生生长长第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养第二节第二节 微生物的生长繁殖微生物的生长繁殖第三节第三节 微生物生长的环境因素微生物生长的环境因素&微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养一、一、无菌技术无菌技术二、获得二、获得纯培养纯培养的方法的方法|用固体培养基分离纯培养用固体培养基分离纯培养|用液体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养|单细

2、胞单细胞(单孢子单孢子)分离分离|选择培养分离选择培养分离|二元培养物二元培养物三、三、微生物的保藏技术微生物的保藏技术 第第四四章章微微生生物物的的生生长长|无菌技术无菌技术在微生物研究及应用中，不仅需要在微生物研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂天然微生通过分离纯化技术从混杂天然微生物群中物群中分离出分离出特定微生物，且还必特定微生物，且还必须随时须随时注意保持注意保持微生物纯培养物的微生物纯培养物的“纯洁纯洁”，防止防止其他微生物的混入。其他微生物的混入。分离、转接及培养纯培养物时防止分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染的技术被称为被其他微生物污染的技术被称为无无菌技术

3、，菌技术，它是保证微生物学研究正它是保证微生物学研究正常进行的关键常进行的关键。第第四四章章微微生生物物的的生生长长微生物培养常用器具及灭菌微生物培养常用器具及灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿试管、玻璃烧瓶、平皿等是最为常等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前用的培养微生物的器具，在使用前必须必须先行灭菌先行灭菌，使容器中不含任何使容器中不含任何生物。生物。培养微生物的营养物质培养微生物的营养物质称为称为培养培养基基(culture medium)可以加到器皿可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。加到无菌的器具中。第第四四章章微微生生物物的的生生长

4、长最常用的灭菌方法是最常用的灭菌方法是高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌，它可杀灭所有生物，包，它可杀灭所有生物，包括最耐热的某些微生物的休眠括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高温干高温干热灭菌热灭菌。第第四四章章微微生生物物的的生生长长为防止杂菌，特别是空气中杂菌为防止杂菌，特别是空气中杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜塞子塞口，通常采用适宜塞子塞口，通常采用棉花塞棉花塞，也可采用各种也可采用各种金属、塑料及硅胶金属、塑料及硅胶帽帽，它们只可让空气通

5、过，而空，它们只可让空气通过，而空气中其他微生物不能通过。气中其他微生物不能通过。平皿平皿是由正反两平面板互扣而成，是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生这种器具是专为防止空气中微生物污染而设计。物污染而设计。第第四四章章微微生生物物的的生生长长接种操作接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中微生物学研究中最常用的基本操作最常用的基本操作。因打开器皿就可能引起器皿内部被环因打开器皿就可能引起器皿内部被环境中

6、的其他微生物污染，因此境中的其他微生物污染，因此微生物微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进实验的所有操作均应在无菌条件下进行行：在火焰附近进行熟练无菌操作，：在火焰附近进行熟练无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。进行操作。第第四四章章微微生生物物的的生生长长第第四四章章微微生生物物的的生生长长纯培养纯培养：微生物学把从一个细胞或同：微生物学把从一个细胞或同一个细胞群繁殖得到的子代，称纯一个细胞群繁殖得到的子代，称纯培养或纯种。培养或纯种。纯培养的类型：纯培养的类型：菌菌种种纯纯（菌菌落落纯纯）：是是分分离离菌菌落落而而得到的；得到的；菌菌株株纯

7、纯（细细胞胞纯纯）：是是分分离离单单个个细细胞得到的。胞得到的。稀释倒平板法稀释倒平板法涂布平板法涂布平板法平板划线分离法平板划线分离法稀释摇管法稀释摇管法第第四四章章微微生生物物的的生生长长用用固体培养基分离纯培养固体培养基分离纯培养|用固体培养基分离纯培养用固体培养基分离纯培养 不同微生物在特定培养基上形成的不同微生物在特定培养基上形成的菌落或菌苔一般都具稳定特征，可菌落或菌苔一般都具稳定特征，可成为对该微生物进行分类、鉴定的成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。重要依据。大多数细菌、酵母菌，大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤

8、立菌落，采用适体培养基上形成孤立菌落，采用适宜的平板分离法很易得到纯培养。宜的平板分离法很易得到纯培养。第第四四章章微微生生物物的的生生长长所谓（所谓（培养培养）平板，平板，是指熔化是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。的平皿。固体培养方法可将单个微生物固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面分离和固定在固体培养基表面或里面。或里面。第第四四章章微微生生物物的的生生长长固体培养基固体培养基，可使每个孤立活，可使每个孤立活微生物体生长、繁殖形成微生物体生长、繁殖形成菌落菌落，形成的菌落便于移植。形成的菌

9、落便于移植。最常用的分离、培养微生物的最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基固体培养基是琼脂固体培养基平板。平板。Koch建立的建立的平板分离微平板分离微生物纯培养的技术生物纯培养的技术简便易行，简便易行，100多年来一直是各种菌种分离多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。的最常用手段。第第四四章章微微生生物物的的生生长长稀释倒平板法稀释倒平板法 待分离材料用无菌水作一系列稀释，取待分离材料用无菌水作一系列稀释，取不同稀释液少许，与熔化且冷却至不同稀释液少许，与熔化且冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌培养皿中，待琼脂凝固后，制成灭

10、过菌培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌平板，保温培养一定时间，可可能含菌平板，保温培养一定时间，可能出现在平板表面的能出现在平板表面的单个菌落单个菌落，该菌落，该菌落可能是由一个菌体繁殖形成。随后挑取可能是由一个菌体繁殖形成。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便该单个菌落，或重复以上操作数次，便可可得到纯培养得到纯培养。第第四四章章微微生生物物的的生生长长涂布平板法涂布平板法 在微生物学研究中更常用的纯种分在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。离方法是涂布平板法。其做法其做法是先是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一制

11、成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。培养后挑取单个菌落。第第四四章章微微生生物物的的生生长长Pour plate Pour plate Pour plate|平板划线分离法平板划线分离法 用接种环以无菌操作沾取少许待分用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式连续行划线、扇形划线或其他形式连续划线，微生物细胞数量将随着划线划线，微生

12、物细胞数量将随着划线次数增加而减少，并逐步分散开来，次数增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜，微生物能一一分散，如果划线适宜，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌经培养后，可在平板表面得到单菌落。落。第第四四章章微微生生物物的的生生长长|稀释摇管法稀释摇管法 对厌氧性微生物，纯培养的分离对厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用则可采用稀释摇管培养法稀释摇管培养法。将一系列盛无菌琼脂培养基的试将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后，冷却并保管加热使琼脂熔化后，冷却并保持在持在50左右，梯度稀释待分离左右，梯度稀释待分离材料，试管均匀，冷凝，倾注一材料，试管均匀，冷凝，倾注一层

13、灭菌液体石蜡和固体石蜡混合层灭菌液体石蜡和固体石蜡混合物，将培养基和空气隔开。物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱中间，培养后，菌落形成在琼脂柱中间，挑取和移植单菌落。挑取和移植单菌落。第第四四章章微微生生物物的的生生长长第第四四章章微微生生物物的的生生长长液体培养基分离纯培养液体培养基分离纯培养 1)接种物在液体培养基中进行顺序稀释。接种物在液体培养基中进行顺序稀释。2)高度稀释高度稀释,一支试管分配不到一个微生物。一支试管分配不到一个微生物。3)必须在同一个稀释度的许多平等试管中，必须在同一个稀释度的许多平等试管中，大多数（大多数（95%以上）表现为不生长。以上）表现为不生长。

14、4)有微生物生长的试管得到的培养物就认有微生物生长的试管得到的培养物就认为是纯培养。为是纯培养。适适宜宜于于不不能能在在固固体体培培养养基基上上生生长长的的微微生生物物如如一一 些细胞大的细菌、些细胞大的细菌、原生原生 动物和藻动物和藻 类。类。第第四四章章微微生生物物的的生生长长较大的微生物较大的微生物，可用毛细管提取单个个体，可用毛细管提取单个个体，并在大量灭菌培养基中转移清洗几次，除去并在大量灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。可在低倍显微镜，如解较小微生物的污染。可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。剖显微镜下进行。个体相对个体相对较小的微生物较小的微生物，需采用显微操作仪。

15、，需采用显微操作仪。市售显微操作仪种类多，一般是通过机械、市售显微操作仪种类多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。对取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。对操作技术有比较高的要求，操作技术有比较高的要求，多限于多限于高度专业高度专业化的科学研究中采用。化的科学研究中采用。单细胞单细胞(单孢子单孢子)分离分离|选择培养分离选择培养分离选择培养基直接分离选择培养基直接分离 富集培养富集培养 第第四四章章微微生生物物的的生生长长|选择

16、培养分离选择培养分离没有一种培养基或一种培养没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生条件能够满足自然界中一切生物生长要求，在一定程度上所物生长要求，在一定程度上所有培养基都是选择性的。迄今，有培养基都是选择性的。迄今，能培养的微生物能培养的微生物1%，不可培，不可培养养99%。在一种培养基上接种。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才多种微生物，只有能生长的才生长，其他被抑制。生长，其他被抑制。第第四四章章微微生生物物的的生生长长第第四四章章微微生生物物的的生生长长如如果果某某微微生生物物生生长长需需要要是是已已知知的的，也也可可设设计计一一套套特特定定环环境境使使之之特特别别

17、适适合合这这种种微微生生物物的的生生长长，因因而而能能从从自自然然界界混混杂杂的的微微生生物物群群体体中中把把这这种种微微生生物物选选择择培培养养出出来来，即即使使在在混混杂杂的的微微生生物物群群体体中中这这种种微微生生物物可可能能只只占占少少数数。通通过过选选择择培培养养进进行行微微生生物物纯纯培培养养分分离离的的技技术术称称为为选选择择培培养养分分离离，是是十十分分重重要要的的，特特别别对对于于从从自自然然界界中中分分离离、寻寻找找有有用用的微生物。的微生物。第第四四章章微微生生物物的的生生长长无氮培养基无氮培养基筛出筛出固氮菌固氮菌；加刚果红或结晶紫的加刚果红或结晶紫的YMA筛出筛出根瘤

18、菌根瘤菌；无有机碳源的培养基无有机碳源的培养基筛出筛出硝化细菌硝化细菌；无无有有机机碳碳源源的的培培养养基基且且无无氧氧有有光光环环境境筛筛出出光合细菌光合细菌；高浓度高浓度NaCl的培养基的培养基筛出筛出耐盐菌株耐盐菌株;伊红伊红美蓝的培养基美蓝的培养基筛出筛出大肠杆菌大肠杆菌；青霉素的培养基青霉素的培养基筛出筛出酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌;加加某某抗抗生生素素的的平平板板筛筛出出相相应应抗抗生生素素抗抗性性菌株菌株;阳性克隆子阳性克隆子的筛选；的筛选；溶磷菌溶磷菌解钾菌解钾菌拮抗菌拮抗菌 富集培养：富集培养：主要是指利用不同主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，微生物间生命活动特点的不

19、同，制定特定的环境条件，使仅适应制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，而使其在群落中的数量大大增加，更易从自然界中分离到所需的特更易从自然界中分离到所需的特定微生物。定微生物。富集条件富集条件可据分离的微生物特点可据分离的微生物特点从物理、化学、生物及综合多个从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、方面进行选择，如温度、pH、紫、紫外线、高压、光照、氧气、营养外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。等许多方面。第第四四章章微微生生物物的的生生长长 用途：用途：富集培养是微生物学家富集培养是微生物学家最强有力的

20、技术手段之一。营养和最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽组合形式可生理条件的几乎无穷尽组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的

21、环境中生长。这种特定的环境中生长。第第四四章章微微生生物物的的生生长长例：例：采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程：（1）首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基，并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。第第四四章章微微生生物物的的生生长长（2）取少量上述培养液转移至取少量上述培养液转移至新鲜新鲜培养液培养液中重新培养，该过程经数次中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中大大提高，将物的比例在培养物中大大提高，

22、将培养液涂布于以对培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯羟基苯甲酸为唯一碳源一碳源的琼脂平板，得到的微生物的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。苯甲酸的微生物。第第四四章章微微生生物物的的生生长长（3）挑挑取取一一部部分分单单菌菌落落分分别别接接种种到到含含有有及及缺缺乏乏对对羟羟基基苯苯甲甲酸酸的的液液体体培培养养基基中中进进行行培培养养，其其中中大大部部分分在在含含有有对对羟羟基基苯苯甲甲酸酸的的培培养养基基中中生生长长，而而在在没没有有对对羟羟基基苯苯甲甲酸酸的的培培养养基基中中表表现现为为不不生生长长，说说明明通通过过该该富富集集程

23、程序序得到了欲分离的目标微生物。得到了欲分离的目标微生物。第第四四章章微微生生物物的的生生长长（4 4）通通过过富富集集培培养养使使原原本本在在自自然然环环境境中中占占少少数数的的微微生生物物的的数数量量大大大大提提高高后后，可可以以再再通通过过稀稀释释倒倒平平板板或或平平板板划划线线等等操操作作得得到到纯培养物。纯培养物。第第四四章章微微生生物物的的生生长长|二元培养物二元培养物 只有一种微生物的培养物称只有一种微生物的培养物称纯培养纯培养物物，含二种以上微生物的培养物称，含二种以上微生物的培养物称为为混合培养物混合培养物，而如果培养物中只，而如果培养物中只含有二种微生物，且是有意识地保含有

24、二种微生物，且是有意识地保持二者间特定关系的培养物称持二者间特定关系的培养物称二元二元培养物培养物。二元培养物是保存病毒的。二元培养物是保存病毒的最有效途径。对于这些生物，二元最有效途径。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能培养物是在实验室控制条件下可能达到最接近于纯培养的培养方法。达到最接近于纯培养的培养方法。第第四四章章微微生生物物的的生生长长|微生物的保藏技术微生物的保藏技术z传代培养保藏传代培养保藏z冷冻保藏冷冻保藏z干燥保藏法干燥保藏法第第四四章章微微生生物物的的生生长长菌种保藏菌种保藏就是根据菌种特性就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生及保藏目的的不同，给微生物菌株

25、以特定的条件，使其物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。存活而得以延续。保藏技术的要求保藏技术的要求(不死亡不死亡，不不会被其他微生物污染，不会会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生因发生变异而丢失重要的生物学性状物学性状)菌种或培养物保藏的菌种或培养物保藏的重要性重要性菌种保藏机构：菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)，中国典型培养物保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，美国典型菌种保藏中心美国典型菌种保藏中心(ATCC)，世界菌种保藏联合会世界菌种保藏联合会(WFGC)。第第四四章章微微生生物物的的生生长长|传代培养保藏传代培养保

26、藏常用的有常用的有琼脂斜面琼脂斜面、半固体琼半固体琼脂柱脂柱及及液体培养液体培养等。等。选择使用选择使用适宜的培养基适宜的培养基，并在，并在规定的时间内进行移种规定的时间内进行移种。传代培养十分繁琐，容易传代培养十分繁琐，容易污染污染，特别是由于菌株的特别是由于菌株的自发突变自发突变而而导致导致菌种衰退菌种衰退，使菌株的形态、使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生理特性、代谢物的产量等发生变化生变化。第第四四章章微微生生物物的的生生长长|冷冻保藏冷冻保藏使微生物处于冷冻状态，使微生物处于冷冻状态，代谢代谢作用停止作用停止以达到保藏目的。以达到保藏目的。微生物细胞对微生物细胞对低温敏感低温敏

27、感，可用，可用速冻、快速升温和添加各种保速冻、快速升温和添加各种保护剂等手段。护剂等手段。液氮保藏或液氮保藏或-70低温保藏。低温保藏。用用普通冰箱普通冰箱冷冻保存菌种的效冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注果往往远低于低温冰箱，应注意意经常检查保藏物的存活情况，经常检查保藏物的存活情况，随时转种随时转种。第第四四章章微微生生物物的的生生长长|干燥保藏法干燥保藏法水分对各种生化反应和一切水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常生物保藏技术中另一项经常采用的手段。采用的手段。沙土管保存沙

28、土管保存和和冷冻真空干燥冷冻真空干燥保藏保藏是最常用的二项微生物是最常用的二项微生物干燥保藏技术。干燥保藏技术。第第四四章章微微生生物物的的生生长长u沙土管保存沙土管保存主要适用于产孢子微生物主要适用于产孢子微生物，如芽，如芽孢杆菌、放线菌等。将菌种接种孢杆菌、放线菌等。将菌种接种培养，长出大量的孢子，洗下孢培养，长出大量的孢子，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥，抽干水分，土试管中，减压干燥，抽干水分，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便易行，并置冰箱保存。此法简便易行，并可以将微生物保藏较长时间，适可以将

29、微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。种的发酵工厂采用。第第四四章章微微生生物物的的生生长长|冷冻真空干燥保藏冷冻真空干燥保藏将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，经真空冰升华作用除水分。达到干经真空冰升华作用除水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体密闭燥的样品可在真空或惰性气体密闭环境中置低温保存，环境中置低温保存，使微生物处于使微生物处于干燥、缺氧及低温、休眠状态，干燥、缺氧及低温、休眠状态，可可达到长期保藏目的。达到长期保藏目的。冷冻真空干燥保藏冷冻真空干燥保藏是目前使用最普是目前使用最普遍，也是最重要的

30、微生物保藏方法，遍，也是最重要的微生物保藏方法，为大多数专业的菌种保藏机构均采为大多数专业的菌种保藏机构均采用。用。第第四四章章微微生生物物的的生生长长&微生物的生长繁殖微生物的生长繁殖 一、细菌的群体生长繁殖一、细菌的群体生长繁殖（一）分批培养中细菌的群体生长分批培养中细菌的群体生长繁殖繁殖（二）（二）连续培养连续培养二、微生物二、微生物群体生长的测定群体生长的测定 l计数法计数法 l重量法重量法l生理指标法生理指标法 第第四四章章微微生生物物的的生生长长|微生物生长繁殖微生物生长繁殖 微生物生长微生物生长是细胞物质有规律地、是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大不可逆增加，导致细

31、胞体积扩大的生物学过程。的生物学过程。繁殖繁殖是微生物生长到一定阶段，是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物即引起生命个体数量增加的生物学过程。学过程。第第四四章章微微生生物物的的生生长长生生长长与与繁繁殖殖是是两两个个相相互互联联系系的的概概念念。生生长长是是一一个个逐逐步步发发生生的的量量变变过过程程，繁繁殖殖是是一一个个产产生生新新生生命命个个体体的的质质变变过过程程。高高等等生生物物这这两两个个过过程程可可明明显显分分开开，但但低低等等特特别别单单细细胞胞生生物

32、物，因因个个体体微微小小，这这两两个个过过程程很很难难划划分分。因因此此在在讨讨论论微微生生物物生生长长时时，往往往往将将这这两两个个过过程程放放在在一一起起讨讨论论，这这是是微微生生物物群群体体生生长长：在在一一定定时时间间和和条条件件下细胞数量的增加。下细胞数量的增加。第第四四章章微微生生物物的的生生长长Prokaryotic Cell(Bacillus megaterium)除除某某些些真真菌菌外外，我我们们肉肉眼眼看看到到或或接接触触到到的的微微生生物物已已不不是是单单个个，而而是是成成千千上上万万个个单单个个的的微微生生物物组组成成的的群群体体。微微生生物物接接种种是是群群体体接接种

33、种，接接种种后后的的生生长长是是微微生生物群体繁殖生长物群体繁殖生长。第第四四章章微微生生物物的的生生长长分分批批培培养养：是是采采用用完完全全封封闭闭容容器器，一一次次接接种种，一一次次性性加加入入培培养养基基进进行行的的培培养养，是是实实验验室室培培养养微微生生物物最常用的方法。最常用的方法。生生长长曲曲线线：细细菌菌接接种种到到液液体体培培养养基基后后，以以裂裂殖殖繁繁殖殖，子子细细胞胞都都具具生生活活能能力力。不不补补充充营营养养物物质质或或移移去去培培养养物物，保保持持整整个个培培养养液液体体积积不不变变，以以时时间间为为横横轴轴，以以菌菌数数为为纵纵轴轴，据据不不同同培培养养时时间

34、间细细菌菌数数量量的的变变化化，作作一一条条反反映映细细菌菌在在整整个个培养期菌数的变化规律曲线培养期菌数的变化规律曲线。第第四四章章微微生生物物的的生生长长一一条条典典型型的的生生长长曲曲线线至至少少可可以以分分为为迟迟缓缓期期、对对数数期期、稳稳定定期期和和衰衰亡期亡期等四个生长时期。等四个生长时期。迟缓期迟缓期(lag phase)细细菌菌接接种种到到新新鲜鲜培培养养基基而而处处于于新新生生长长环环境境，因因此此在在一一段段时时间间里里并并不不马马上上分分裂裂，细细菌菌数数量量维维持持恒恒定定，或或增增加加很很少少。此此时时胞胞内内的的RNA、蛋蛋白白质质等等物物质质含含量量有有所所增增

35、加加，相相对对地地此此时时的的细细胞胞体体积积最最大大，说说明明细细菌菌并并不不是是处处于于完完全全静静止止的的状状态态等。等。第第四四章章微微生生物物的的生生长长产产生生迟迟缓缓期期的的原原因因，微微生生物物接接种种到到一一新新环环境境，暂暂时时缺缺乏乏足足够够能能量量和和必必需需的的生生长长因因子子，“种种子子”老老化化(即即处处于于非非对对数数生生长长期期)或或未未充充分分活活化化，接种时造成损伤等。接种时造成损伤等。第第四四章章微微生生物物的的生生长长在在工工业业发发酵酵和和科科研研中中迟迟缓缓期期会会增增加加生生产产周周期期而而产产生生不不利利的的影影响响，但但是是迟迟缓缓期期必必需

36、需，因因细细胞胞分分裂裂前前，细细胞胞各各成成分分复复制制与与装装配配等等需需时时间间，因因此此应应采采取取一一定定措措施施缩缩短短迟迟缓缓期期：通通过过遗遗传传学学方方法法改改变变种种的的遗遗传传特特性性使使迟迟缓缓期期缩缩短短；利利用用对对数数生生长长期期的的细细胞胞作作为为“种种子子”；尽尽量量使使接接种种前前后后使使用用的的培培养养基基组组成成不不相相差差太太大大；适适当当扩扩大大接接种种量量等等方方式式缩缩短短迟迟缓缓期期，克服不良影响。克服不良影响。第第四四章章微微生生物物的的生生长长 对对数数生生长长期期(log Phase)：又又称称指指数数生生长长期期。细细菌菌经经迟迟缓缓期

37、期进进入入对对数数生生长长期期，并并以以最最大大速速率率生生长长和和分分裂裂，导导致致细细菌菌数数量量呈呈对对数数增增加加，且且细细菌菌内内各各成成分分按按比比例例有有规规律律增增加加，此此期期内内细细菌菌生生长长是是平平衡衡生生长长。对对数数生生长长期期细细菌菌代代谢谢活活性性、酶酶活活性性高高而而稳稳定定，大大小小比比较较一一致致，生生活活力力强强，因因而而它它广广泛泛地地在在生生产产上上用用作作“种种子子”和和在在科科研研上上作作为为理理想想的的实实验验材材料料。生生产产上上如如以以获菌体为目的，该期最好获菌体为目的，该期最好第第四四章章微微生生物物的的生生长长 对对数数生生长长期期的的

38、生生长长速速率率可可用用代代时时表示。表示。代代时时，即即单单个个细细胞胞完完成成一一次次分分裂裂所所需需的的时时间间，亦亦即即增增加加一一代代所所需需的的时时间间(也也叫叫增增代代时时间间或或世世代代时时间间)。在在此此阶阶段段，由由于于代代时时稳稳定定，因因此此，只只要要知知道道了了对对数数期期中中任任何何两两个个时时间间的的菌菌数数，就就可可求求出出细细菌菌的的代时。代时。第第四四章章微微生生物物的的生生长长 稳稳定定生生长长期期(stationary phase)：因因营营养养物物质质消消耗耗，代代谢谢产产物物积积累累和和pH等等环环境境变变化化，逐逐步步不不适适宜宜细细菌菌生生长长，

39、导导致致生生长长速速率率降降低低直直至至零零(即即细细菌菌分分裂裂增增加加的的数数量量等等于于细细菌菌死死亡亡数数量量)，进进入入稳稳定定生生长长期期。活活细细菌菌数数最最高高并并维维持持稳稳定定。如如及及时时采采取取措措施施，补补充充营营养养物物质质或或取取走走代代谢谢产产物物或或改改善善培培养养条条件件，如如对对好好氧氧菌菌进进行行通通气气、搅搅拌拌或或振振荡荡等等可可延延长长稳稳定定生生长长期期，获获得得更更多多菌菌体体物物质质或或代代谢谢产产物物。（生生产产上上如如以以获获代代谢谢产产物为目的，该期最好）物为目的，该期最好）第第四四章章微微生生物物的的生生长长衰亡期衰亡期：营营养养物物

40、耗耗尽尽和和有有毒毒代代谢谢物物大大量量积积累累，细细菌菌死死亡亡速速率率逐逐步步增增加加和和活活细细菌菌逐逐步步减减少少，标标志志进进入入衰衰亡亡期期。该该时时期期细细菌菌代代谢谢活活性性降降低低，衰衰老老并并出出现现自自溶溶，且且死死亡亡细细菌菌量量以以对对数数方方式式增增加加，但但衰衰亡亡期期后后期期，因因部部分分细细菌菌产产生生抗抗性性也也会会使使细细菌死亡的速率降低。菌死亡的速率降低。第第四四章章微微生生物物的的生生长长 此此外外，不不同同的的微微生生物物，甚甚至至同同一一种种微微生生物物对对不不同同物物质质的的利利用用能能力力是是不不同同的的。有有的的物物质质可可直直接接被被利利用

41、用(如如葡葡萄萄糖糖等等)；有有的的需需经经过过一一定定适适应应期期后后才才能能获获得得利利用用能能力力(如如乳乳糖糖等等)。前前者者通通常常称称为为速速效效碳碳源源(或或氮氮源源)，后后者者称称为为迟迟效效碳碳源源(或或氮氮源源)。当当培培养养基基中中同同时时含含有有这这两两类类碳碳源源(或或氮氮源源)时时，微微生生物物在在生生长长过过程程中中会会产生二次生长现象。产生二次生长现象。第第四四章章微微生生物物的的生生长长第第四四章章微微生生物物的的生生长长|一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。.|连连续续培培养养：在在微微生生物物整整个个培培养养间间，以

42、以一一定定方方式式使使微微生生物物能能以以恒恒定定比比生生长长速速率率生生长长并并能能持持续续生生长长的的一一种种培培养养方方法法。根根据据生生长长曲曲线线，营营养养物物质质的的消消耗耗和和代代谢谢产产物物的的积积累累是是导导致致微微生生物物生生长长停停止止的的主主要要原原因因。因因此此在在微微生生物物培培养养过过程程中中不不断断补补充充营营养养物物质质和和以以同同样样的的速速率率移移出出培培养养物物是实现微生物连续培养基本原则。是实现微生物连续培养基本原则。第第四四章章微微生生物物的的生生长长第第四四章章微微生生物物的的生生长长|连续培养的优缺点连续培养的优缺点|最最大大优优点点：微微生生物

43、物能能在在比比较较恒恒定定的的生生长长条条件件下下以以恒恒定定的的生生长长速速度度生生长长；缩缩短短生生长长周周期期，提提高高生生产产设设备备的的利利用率，降低产品成本。用率，降低产品成本。|缺缺点点：营营养养物物质质的的利利用用率率低低；感感染染杂杂菌菌的的机机会会增增多多；菌菌体体易易老老化化，衰退。衰退。|微生物生长情况可通过测定单位时间里微生物数量或生物量的变化来评价。通过微生物生长的测定可客观评价培养条件、营养物质等对生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果，或客观地反映微生物生长的规律。因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。微生物生长的测定

44、有计数、重量和微生物生长的测定有计数、重量和生理指标等方法。生理指标等方法。第第四四章章微微生生物物的的生生长长|微生物生长的测定微生物生长的测定计数法计数法 此法通常用来测定样此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数等单细胞微生物的数量。计数法又常分为法又常分为直接计数直接计数和和间接计间接计数数两类。两类。除上述两种常用的计除上述两种常用的计数方法外，还有数方法外，还有膜过滤法膜过滤法、比比浊法浊法。第第四四章章微微生生物物的的生生长长直接计数直接计数这类方法是利用特定的这类方法是利用特定的细菌计数板或血球计数细菌计数板或血球计数板，

45、在显微镜下计算一板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。能区分死菌与活菌。每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数4000l000稀释倍数稀释倍数 第第四四章章微微生生物物的的生生长长间接计数间接计数此法又称活菌计数法，此法又称活菌计数法，其其原理原理是在高稀释度下，微生物细胞是在高稀释度下，微生物细胞充分分散，成单个细胞存在，充分分散，成单个细胞存在，每一个活的单细胞均能繁殖形每一个活的单细胞均能繁殖形成一个菌落，因而可用平皿培成一个菌落，因而可用平皿培养的方法使每个活细胞生长并养的

46、方法使每个活细胞生长并形成一个单独的菌落，通过统形成一个单独的菌落，通过统计长出的菌落数来推算待测样计长出的菌落数来推算待测样品中的活菌数。品中的活菌数。第第四四章章微微生生物物的的生生长长具体做法：具体做法：将待测样品经一系列将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，再采作用混菌法或涂布法来进液，再采作用混菌法或涂布法来进行测数。行测数。但在实际操作中难以做到但在实际操作中难以做到使所有细胞完全分开，即不能保证使所有细胞完全分开，即不能保证每个菌落都是由个细胞分裂而来，每个菌落都是由个细胞分裂而来，所以现在多用菌落形成单位（所以现在多用菌落形成单位

47、（CFU：colony forming units）来表示。来表示。第第四四章章微微生生物物的的生生长长应用应用:此法可因操作不熟练造成污染，或此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。但因该法能测出样品中微结果不稳定。但因该法能测出样品中微量菌数，仍是教学、科研和生产上常用量菌数，仍是教学、科研和生产上常用的测定细菌数的有效方法。土壤、水、的测定细菌数的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测定。但不适于测定样

48、品中丝状体微生物，定。但不适于测定样品中丝状体微生物，如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等营如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等营养体等。养体等。第第四四章章微微生生物物的的生生长长膜过滤法膜过滤法（测活菌数测活菌数）是当样）是当样品中菌数很低时，可以将一定品中菌数很低时，可以将一定体积的潮水、海水或饮用水等体积的潮水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色膜干燥、染色(活菌指示剂活菌指示剂)，并经处理使膜透明，再在显微并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上镜下计算膜上(或一定面积中或一定面积中)的细菌数的细菌数.第第四四章章微微生生物物的的生生长长比比浊浊法法

49、（测测总总菌菌数数）原原理理是是在在一一定定范范围围内内，菌菌悬悬液液中中细细胞胞浓浓度度与与混混浊浊度度成成正正比比，即即与与光光密密度度成成正正比比，菌菌越越多多，光光密密度度越越大大。因因此此可可借借助助分分光光光光度度计计，在在一一定定波波长长下下，测测定定菌菌悬悬液液的的光光密密度度，以以光光密密度度(optical density，即即O.D.)表表示示菌菌量量。实实验验测测量量时时一一定定要要控控制制在在菌菌浓浓度度与与光光密密度度成成正正比比线线性性范围内，否则不准确。范围内，否则不准确。微微生生物物计计数数法法，发发展展迅迅速速，现现有有多多种种多多样样快速、简易、自动化仪器

50、和装置等方法。快速、简易、自动化仪器和装置等方法。第第四四章章微微生生物物的的生生长长重量法重量法 此法的原理是根据每个细胞有此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。体微生物生长的测定。微生物湿重微生物湿重微生物干重微生物干重蛋白质总量蛋白质总量 DNA含量含量 第第四四章章微微生生物物的的生生长长测定菌体湿重或干重法测定菌体湿重或干重法 原原理理是是据据每每个个细细胞胞有有一一定定的的重重量量而而设设计计的的。它它可可以以用用于于单单细细胞胞、多多细细胞胞以以及及丝丝状状体体微微生生