第十二章荧光分析法优秀PPT.ppt

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1、第十二章荧光分析法第十二章荧光分析法第一页，本课件共有50页荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理荧光定量分析方法荧光定量分析方法荧光分析仪器与技术荧光分析仪器与技术荧光分析法荧光分析法第二页，本课件共有50页荧光分析法概述&光致发光：光致发光：吸收某种波长的光后吸收某种波长的光后发射发射出出比吸比吸收波长更长的光收波长更长的光的现象。的现象。&荧光分析法荧光分析法 (fluorormetry)荧光光谱荧光光谱定性分析定性分析荧光强度荧光强度定量分析定量分析荧光分析的分类荧光分析的分类分析对象分析对象激发光波长范围激发光波长范围(荧光荧光和和磷光磷光)原子荧光分析原子荧光分析分子荧光分析分子荧光

2、分析 紫外紫外-可见荧光分析可见荧光分析红外荧光分析红外荧光分析X射线荧光分析射线荧光分析第三页，本课件共有50页荧光分析法与紫外-可见分光光度法的主要区别紫外光紫外光I0IACF(S=10-910-12g/ml)样品溶液样品溶液UV-vis(S=10-610-7g/ml)FC荧光分析法荧光分析法荧光分析法概述（续前）平行于入射光平行于入射光垂直于入射光垂直于入射光优点：优点：灵敏度高灵敏度高（吸收）（吸收）（发射）（发射）第四页，本课件共有50页1荧光分析法的基本原理q分子荧光的产生原理分子荧光的产生原理q荧光物质分子的光谱特征荧光物质分子的光谱特征q荧光强度及其影响因素荧光强度及其影响因素

3、第五页，本课件共有50页单重态与三重态&单重态单重态(siglet state,S)：总自旋量子数总自旋量子数s=1/2+(-1/2)=0;多重性多重性M=2s+1=1基态基态(S0)&三重态三重态(triplet state,T)：s=1/2+1/2=1；M=2s+1=3激发单重态激发单重态(S)激发三重态激发三重态(T)第六页，本课件共有50页激发态分子返回基态的途径 n振动弛豫振动弛豫(vibrational relexation)n内部能量转换内部能量转换(internal conversion)n n荧光荧光(fluorescence)发射发射n外部能量转换外部能量转换(extern

4、al conversion)n体系间跨越体系间跨越(intersystem crossing)n磷光发射磷光发射第七页，本课件共有50页激发态激发态激发态激发态基态途径（图）基态途径（图）基态途径（图）基态途径（图）吸收吸收基态基态(S0)第二电子第二电子激发单重激发单重态态(S2*)第一电子第一电子激发三重激发三重态态(T1*)振动弛豫振动弛豫内转换内转换荧光荧光外转换外转换体系间跨越体系间跨越磷光磷光第一电子第一电子激发单重激发单重态态(S1*)S1*(V=0)第八页，本课件共有50页振动弛豫S1*(V=n)S1*(V=0)非辐射非辐射10-12s内部能量转换（内转换）内部能量转换（内转换

5、）激发态分子返回基态的途径（续前）S1*(V=n)S2*(V=0)非辐射非辐射 E很小很小荧光发射荧光发射 S1*(V=0)S0(V=n)Sn*(V=n)内转换内转换振动驰豫振动驰豫辐射辐射&荧光：荧光：物质分子接受光能激发后，从物质分子接受光能激发后，从第一电子激第一电子激发态最低振动能级发态最低振动能级返回基态时发射出的光。返回基态时发射出的光。第九页，本课件共有50页外部能量转换（外转换）外部能量转换（外转换）S1*(V=0)S0(V=n)碰撞转移能量碰撞转移能量热平衡过程热平衡过程S1*(V=0)T1*(V=n)非辐射非辐射激发态分子返回基态的途径（续前）磷光发射磷光发射 体系间跨越体

6、系间跨越体系间跨越体系间跨越 S1*(V=0)振动驰豫振动驰豫Sn*(V=n)内转换内转换S0(V=n)辐射辐射T1*(V=0)（10-410s）T1*(V=n)振动弛豫振动弛豫T1*(V=n)S1*(V=0)非辐射非辐射第十页，本课件共有50页荧光和磷光的主要区别发光机制发光机制实验现象实验现象荧光荧光磷光磷光单重态单重态单重态单重态激发光停止照射激发光停止照射荧光立荧光立即消失即消失三重态三重态单重态单重态激发光停止照射激发光停止照射磷光仍磷光仍将延续一段时间将延续一段时间第十一页，本课件共有50页M激发光谱与发射（荧光）光谱激发波长激发波长发射波长发射波长荧光物质分子的两个特征光谱荧光物

7、质分子的两个特征光谱&激发光谱激发光谱(excitation spectrum)：F ex&荧光光谱荧光光谱(fluorescence spectrum)：F em第十二页，本课件共有50页硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱激发光谱激发光谱荧光光谱荧光光谱第十三页，本课件共有50页荧光光谱的特征斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift)荧光发射波长总是大于激发光波长荧光发射波长总是大于激发光波长（能量损失）（能量损失）荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关 激发：激发：S0(V=0)Sn*(V=n)荧光：荧光：S1*(V=0)S0(V=n)S1

8、*(V=0)S0(V=n)Sn*(V=n)内转换内转换振动驰振动驰豫豫辐射辐射第十四页，本课件共有50页荧光光谱与激发光谱呈镜像关系 蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）荧光光谱荧光光谱 S0S2*激发光谱激发光谱 S0S1*激发光谱激发光谱 第十五页，本课件共有50页激发光谱：激发光谱：S0(V=0)S1*(V=1,2,3,4)荧光光谱：荧光光谱：S1*(V=0)S0(V=1,2,3,4)蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁荧光光谱的特征（续前）第十六页，本课件共有50页M荧光寿命和荧光效率&荧光寿命荧光寿命(fluorescence lift time,f)：当

9、激发光停止照当激发光停止照射时，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的射时，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间。所需的时间。荧光物质的两个重要发光参数荧光物质的两个重要发光参数指数衰减定律：指数衰减定律：Ft=F0e-Kt (K：衰减常数：衰减常数)t=fFt=(1/e)F0 Ft/F0-t作图作图直线斜率直线斜率=1/f f=1/斜率斜率第十七页，本课件共有50页&荧光效率(fluorescence efficiency)(fluorescence efficiency)荧光量子产率(fluorescence quantum yield)物物 质质 f溶溶 剂剂荧光素

10、钠荧光素钠0.92水水荧光素荧光素0.65水水蒽蒽0.30乙醇乙醇菲菲1.00乙醇乙醇 第十八页，本课件共有50页物质分子能发射荧光的两个必要条件 有强的紫外有强的紫外-可见吸收可见吸收有一定的荧光效率有一定的荧光效率n*共轭双键共轭双键，K带强吸收，荧光效率高，带强吸收，荧光效率高，荧光强度强。荧光强度强。弱吸收，体系间跨越几率大，荧光较弱，弱吸收，体系间跨越几率大，荧光较弱，意义不大。意义不大。第十九页，本课件共有50页有机化合物分子结构与荧光的关系长共轭结构长共轭结构（芳香环、稠环或杂环）（芳香环、稠环或杂环）共轭系统共轭系统 f ex、em 第二十页，本课件共有50页 ex=327nm

11、，em=510nm 稠芳环分子的几何排列对荧光的影响稠芳环分子的几何排列对荧光的影响 含有长共轭双键的脂肪烃含有长共轭双键的脂肪烃 第二十一页，本课件共有50页分子的刚性和共平面性共轭系统的刚性和共平面性共轭系统的刚性和共平面性 f f 联苯联苯 f=0.2 芴芴 f=1.0 第二十二页，本课件共有50页金属离子络合增加分子刚性和共平面性金属离子络合增加分子刚性和共平面性 8-羟基喹啉羟基喹啉 8-羟基喹啉镁羟基喹啉镁 位阻效应和立体效应位阻效应和立体效应 f 1-二甲氨基萘二甲氨基萘-7-磺酸盐磺酸盐 1-二甲氨基萘二甲氨基萘-8-磺酸盐磺酸盐 f=0.75 f=0.03 位阻效应位阻效应第

12、二十三页，本课件共有50页取代基供电子基：供电子基：NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN f，F吸电子基：吸电子基：-NO2、-COOH、-NHCOCH3、-C=O、-NO、-SH、-X f，F，甚至荧光熄灭甚至荧光熄灭-R、-SO3H、-NH3+对对 f 无影响无影响 第二十四页，本课件共有50页影响荧光强度的外界因素温度温度TF溶剂溶剂极性极性 fF 粘度粘度分子间碰撞几率分子间碰撞几率F含重原子含重原子(CBr4、CH3CH2I)F形成氢键形成氢键S1*(V=0)分子分子FpH值值 pH13 弱酸、弱碱弱酸、弱碱兰色荧光兰色荧光 第二十五页，本课件共有50页荧光熄灭剂&荧光熄灭（荧

13、光猝灭）：荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。&荧光熄灭剂荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。为常见的荧光熄灭剂。第二十六页，本课件共有50页引起荧光熄灭的原因碰撞碰撞损失能量损失能量作用作用不

14、发光物质不发光物质重原子重原子Br/I体系间跨越体系间跨越三重态三重态溶解溶解O2荧光物质氧化荧光物质氧化/O2顺磁性顺磁性体系间跨越体系间跨越三重态三重态&荧光自熄灭：荧光自熄灭：荧光物质浓度超过荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子间碰撞几率时，增加荧光分子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。而产生的荧光熄灭现象。(浓度限量浓度限量1g1mg/ml)&荧光熄灭法荧光熄灭法(fluorescence quenching method)：利用利用荧光物质荧光荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系强度的减弱与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的测定荧光熄灭剂含量的方法。方法。

15、第二十七页，本课件共有50页种类种类瑞利光瑞利光(Reyleigh scattering light)：弹性碰撞，不弹性碰撞，不发生能量交换，仅改变光子运动方向，波长及频发生能量交换，仅改变光子运动方向，波长及频率不变。率不变。拉曼光拉曼光(Raman scattering light)：非弹性碰撞，发非弹性碰撞，发生能量交换，光子的运动方向和波长、频率均发生能量交换，光子的运动方向和波长、频率均发生改变。生改变。较长拉曼光干扰荧光测定。较长拉曼光干扰荧光测定。散射光&散射光散射光(scattering light)：由于光子与物质分子相互碰撞，由于光子与物质分子相互碰撞，使光子的运动方向发生

16、改变而向不同角度散射。使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。第二十八页，本课件共有50页硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)(a)与拉曼光谱与拉曼光谱(b)(b)荧光光谱荧光光谱拉曼光谱拉曼光谱瑞利光瑞利光320nm拉曼光拉曼光360nm拉曼光拉曼光400nm荧光荧光448nm激发激发320nm激发激发350nm瑞利光瑞利光350nm第二十九页，本课件共有50页1荧光定量分析q荧光定量分析的依据荧光定量分析的依据F与与C的关系的关系q荧光定量分析方法荧光定量分析方法q荧光分析法与荧光分析法与UV-vis定量分析的区别定量分析的区别第三十页，本课件共有50页荧光

17、强度F与浓度C的关系溶液的荧光测定溶液的荧光测定激发光源激发光源垂直方向垂直方向荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。光干扰。F=K(I0I)(I=I010-ECl)=K(I0-I010-ECl)=K I0(1-10-ECl)=K I0(1-e-2.3ECl)太劳极数展开式：太劳极数展开式：ex=1+x/1！+x2/2！+x3/3！+第三十一页，本课件共有50页ECl0.05F=2.3K I0ECl=KC荧光分析法仅适用于稀溶液的测定荧光分析法仅适用于稀溶液的测定满足定量分析条件：满足定量分析条件：ECl0.05FC降低荧光自熄灭（内部猝灭）作

18、用降低荧光自熄灭（内部猝灭）作用灵敏度高（放大信号）灵敏度高（放大信号）F与C的关系推导（续前）荧光定量分析的依据第三十二页，本课件共有50页T荧光分析法与UV-vis灵敏度差异紫外紫外-可见分光光度法定量依据：可见分光光度法定量依据：AC 检测信号：检测信号：A=-lg(I/I0)=ECl CI0/I1A0 荧光分析法定量依据：荧光分析法定量依据：FI0及及C 检测信号：检测信号：F=2.3K I0ECl CF 放大信号（检测灵敏度放大信号（检测灵敏度）I0F荧光分析灵敏度高荧光分析灵敏度高放大信号放大信号I0，II/I0不变不变UV-vis灵敏度受限，不如荧光分析灵敏度受限，不如荧光分析(

19、S=10-610-7g/ml)(S=10-910-12g/ml)第三十三页，本课件共有50页荧光定量分析方法校正曲线法校正曲线法(FC)T荧光分析法与荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别定量测定时仪器校正的区别0100%UV-vis荧光分析法荧光分析法T=0，A=关闭光闸关闭光闸，光不，光不透过，全吸收透过，全吸收T=100%，A=0空白溶液空白溶液，光全，光全透过，不吸收透过，不吸收F=0空白溶液空白溶液，不，不发射荧光发射荧光F=100%对照品溶液对照品溶液CmaxF=50%(Cmid)第三十四页，本课件共有50页比例法荧光定量分析方法（续前）适用：适用：校正曲线过原点校正曲线

20、过原点多组分混合物测定多组分混合物测定 原理：原理：荧光强度的加和性荧光强度的加和性方法：方法：解联立方程解联立方程 z空白调零降低测定的灵敏度：仪器调零空白调零降低测定的灵敏度：仪器调零 F0Fs和和Fx扣除空白扣除空白(Fs-F0、Fx-F0)计算。计算。第三十五页，本课件共有50页1荧光分析仪器与技术q荧光分析仪器类型、主要部件和校正荧光分析仪器类型、主要部件和校正q荧光分析新技术荧光分析新技术q荧光分析的应用荧光分析的应用第三十六页，本课件共有50页荧光分析仪器类型滤光片荧光计滤光片荧光计分光系统：分光系统：激发滤光片（带通型）激发滤光片（带通型）发射滤光片（截止型）发射滤光片（截止型

21、）用途：用途：可用于可用于定量分析；定量分析；不能测定光谱不能测定光谱 滤光片滤光片-单色器荧光计单色器荧光计分光系统：分光系统：激发滤光片激发滤光片+发射光栅发射光栅用途：用途：可用于测定可用于测定荧光光谱荧光光谱及及定量分析定量分析；不能测；不能测定激发光谱，定激发光谱，第三十七页，本课件共有50页930930型荧光计光路示意图型荧光计光路示意图激发滤光片激发滤光片发射滤光片发射滤光片荧光分析仪器类型（续前）第三十八页，本课件共有50页荧光分光光度计荧光分光光度计结构示意图荧光分光光度计结构示意图分光系统：分光系统：光栅光栅用途：用途：测定测定激发光谱激发光谱、荧光光谱荧光光谱及及定量分析

22、定量分析。最大激发波长最大激发波长 exmax和和最大荧光波长最大荧光波长 emmax是鉴是鉴定物质的依据和定量测定物质的依据和定量测定时最灵敏的条件。定时最灵敏的条件。激发单色器激发单色器发射单色器发射单色器荧光分析仪器类型（续前）第三十九页，本课件共有50页荧光分析仪器的主要部件激发光源：激发光源：汞灯、氙灯、氘灯、溴钨灯汞灯、氙灯、氘灯、溴钨灯分光系统：分光系统：滤光片；单色器（光栅）滤光片；单色器（光栅）样器池：样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光低荧光材料或石英材料，四面透光检测器：检测器：紫外紫外-可见（光电倍增管）可见（光电倍增管）第四十页，本课件共有50页荧光分析仪器的校正灵

23、敏度校正：灵敏度校正：对照品溶液对照品溶液Cmax F=100%Cmid F=50%硫酸喹啉硫酸喹啉:0.001g喹啉标准品喹啉标准品硫酸硫酸(0.05mol/L)C=1 g/ml波长校正：波长校正：汞灯标准谱线汞灯标准谱线激发光谱与荧光光谱的校正激发光谱与荧光光谱的校正单光束：调整光源强度一致单光束：调整光源强度一致双光束：参比光束抵消光学误差双光束：参比光束抵消光学误差第四十一页，本课件共有50页荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计光路光路光源光源仪器仪器校正校正吸收池吸收池入射光与吸入射光与吸收光同方向收光同方向入射光与

24、荧入射光与荧光垂直方向光垂直方向两种光源两种光源(紫外紫外+可见可见)一种光源一种光源(紫外紫外)空白溶液空白溶液(F=0)荧光对照品溶液荧光对照品溶液(F=100%或或50%)空白溶液空白溶液(T=100%)紫外无吸收紫外无吸收两面透光两面透光低荧光材料低荧光材料四面透光四面透光第四十二页，本课件共有50页荧光分析新技术激光荧光分析激光荧光分析时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析(time-resolved fluorometry)原理：原理：激发和检测之间延缓一段时间，具有不同荧光寿激发和检测之间延缓一段时间，具有不同荧光寿命的物质分别检测命的物质分别检测激发光源：激发光源：脉冲激光脉冲激光

25、优点：优点：优点：优点：检测时排除干扰，无需化学预处理检测时排除干扰，无需化学预处理 激发光源：激发光源：激发光源：激发光源：波长更短、强度更大的激光波长更短、强度更大的激光 优点：优点：优点：优点：提高灵敏度提高灵敏度(样品量样品量临界胶束浓度临界胶束浓度CMC)的的表面活性剂表面活性剂溶液溶液亲水基亲水基疏水基疏水基第四十四页，本课件共有50页荧光分析的应用有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析研究对象：研究对象：芳香芳香族及具有芳香结构的化合物族及具有芳香结构的化合物 有机化合物：多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、有机化合物：多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂

26、环结构的氨基酸类及蛋多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质白质药物：生物碱类药物：生物碱类(麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱及异喹啉类生物碱)；甾体类；甾体类(皮质激素及雌醇皮质激素及雌醇)；抗生素类；抗生素类(青霉素、四环素青霉素、四环素)；维生素类；维生素类(维生素维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺)中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）第四十五页，本课件共有50页荧光试剂荧光胺荧光胺荧光条件：荧光条件：ex=275、39

27、0nm，em=480nm适用：适用：脂肪族和芳香族伯胺脂肪族和芳香族伯胺第四十六页，本课件共有50页邻苯二甲醛(OPA)适用：适用：伯胺类、伯胺类、-氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸）酸）荧光条件：荧光条件：ex=340nm，em=455nm (2-巯基乙醇存在，巯基乙醇存在，pH910的缓冲溶液的缓冲溶液)3.1-二甲氨基二甲氨基-5-氯化磺酰萘氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯丹酰氯)适用：适用：伯胺、仲胺及酚基的生物碱类伯胺、仲胺及酚基的生物碱类荧光条件：荧光条件：ex=365nm，em=500nm丹酰肼丹酰肼(Dansyl-NHNH2)：可的松

28、等的羰基可的松等的羰基 荧光试剂（续前）第四十七页，本课件共有50页无机化合物的荧光分析测定方法：测定方法：与具有与具有电子共轭结构的有机化合物形成荧光电子共轭结构的有机化合物形成荧光配合物配合物 研究对象研究对象研究对象研究对象阳离子：阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr阴离子：阴离子：CN-、F-与与Al、Zr离子强烈配合离子强烈配合原有荧光配合物原有荧光配合物的荧光减弱甚至熄灭的荧光减弱甚至熄灭 荧光试剂：荧光试剂：荧光试剂：荧光试剂：P235表表12-1

29、荧光分析应用（续前）第四十八页，本课件共有50页v本章重点内容小结掌握掌握(教材教材P241242)基本概念：基本概念：荧光荧光、振动弛豫振动弛豫、内部能量转换、外、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱与荧部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱与荧光光谱光光谱基本理论：基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；条件；荧光定量分析荧光定量分析的依据、条件及方法的依据、条件及方法熟悉：熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）件）了解：了解：荧光分析仪器；荧光分析新技术荧光分析仪器；荧光分析新技术 第四十九页，本课件共有50页课后练习名词解释：荧光与磷光、弛豫振动名词解释：荧光与磷光、弛豫振动溶液荧光光谱有哪些特征？溶液荧光光谱有哪些特征？能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？件？为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？第五十页，本课件共有50页