植物细胞培养11.ppt

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1、第二章第二章 植物组织与细胞培养植物组织与细胞培养2.1 植物组织与细胞培养区别植物组织与细胞培养区别n n组织培养概念：组织培养概念：指从机体内取出组织或细胞，指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。之生存或生长成组织。n n细胞培养概念：细胞培养概念：植物细胞在体外条件下的存植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。活或生长，此时细胞不再形成组织。2.2 2.2 植物组织的发展简史植物组织的发展简史l探索阶段（本世纪初探索阶段（本世纪初 3030年代中）年代中）19021902年，德国植物生理学

2、家年，德国植物生理学家HaberlancltHaberlanclt首次进行了细首次进行了细胞培养实验胞培养实验 奠基阶段（奠基阶段（3030 5050年代）年代）19341934年，年，WhiteWhite 等用番茄根尖的组织培养，建立了第一等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。个活跃生长的无性繁殖系。1943 1943 1943 1943年年年年WhiteWhite正式提出植物细胞具有全能性学说，即单正式提出植物细胞具有全能性学说，即单细胞经过人工培养，通过细胞分裂能恢复完整植株。细胞经过人工培养，通过细胞分裂能恢复完整植株。19341934年，年，White White

3、 和和WentWent 等分别发现等分别发现B B族维生素和吲哚乙族维生素和吲哚乙酸（酸（IAAIAA）对培养的离体根生长具有重要作用。）对培养的离体根生长具有重要作用。1937-19381937-1938年，年，GautheretGautheret、NobecourtNobecourt 培养胡萝卜根培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖。置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖。WhiteWhite、GautheretGautheret、NobecourtNobecourt

4、等科学家被誉为植物等科学家被誉为植物组织培养的奠基人组织培养的奠基人 19571957年年SkoogSkoog和和MillerMiller提出了植物激素控制器官形成提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通过改变培养基中生长素和细胞分裂素的概念，指出通过改变培养基中生长素和细胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生长素和细胞分裂的比率，可以控制器官的分化，即生长素和细胞分裂素高促进根的分化，低促进茎和芽的分化。素高促进根的分化，低促进茎和芽的分化。19581958年，施图尔德从胡萝卜愈伤组织获得单细胞，并年，施图尔德从胡萝卜愈伤组织获得单细胞，并经诱导形成了胚状体再生了植株，是世界上首次证明经诱

5、导形成了胚状体再生了植株，是世界上首次证明植物细胞的全能性。植物细胞的全能性。迅速发展阶段（迅速发展阶段（6060年代后）年代后）1 1、原生质体培养和细胞融合。、原生质体培养和细胞融合。2 2、微繁技术、微繁技术2.3 2.3 植物组织培养植物组织培养重要概念和理论基础重要概念和理论基础l植物组织培养：植物组织培养：在无在无菌条件下，将离体的菌条件下，将离体的植物器官、组织、细植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体，胞、胚胎、原生质体，培养在人工配制的培培养在人工配制的培养基上，给予适宜的养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的

6、植等，或长成完整的植株，统称为植物组织株，统称为植物组织培养培养 。n植物组织培养理论基础n n一、细胞全能性一、细胞全能性n n二二.细胞分化细胞分化 n n三三.离体培养中细胞的脱分化、再分化离体培养中细胞的脱分化、再分化l全能性：全能性：任何有完整的细胞核的植物细胞任何有完整的细胞核的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的遗传信息，拥有形成一个完整植株所必需的遗传信息，理论上都能发育成为一棵植株。理论上都能发育成为一棵植株。l 植物组织培养是建立在细胞具有全能性的植物组织培养是建立在细胞具有全能性的理论基础上的，除受精卵能发育成胚外，理论基础上的，除受精卵能发育成胚外，植物的体细胞，雌配子

7、、雄配子体都能发植物的体细胞，雌配子、雄配子体都能发育成胚。育成胚。n n植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱强到弱:n n营养生长中心营养生长中心 形成层形成层 薄壁细胞薄壁细胞 厚厚壁细胞壁细胞(木质化细胞木质化细胞)特化细胞特化细胞(筛管、筛管、导管细胞导管细胞)；n n根据细胞所处的组织不同从强到弱为：根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织顶端分生组织 居间分生组织居间分生组织 侧生分侧生分生组织生组织 薄壁组织薄壁组织(基本组织基本组织)厚角组厚角组织织 输导组织输导组织 厚壁组织。厚壁组织。n n 脱分化脱分化 再分化再分化 外植体

8、外植体愈伤组织愈伤组织 体细胞胚体细胞胚 根、茎、叶根、茎、叶n n 等器官等器官再分化时，可经过两条途径 完整植株n n外植体：外植体：植物组织培养中用来进行离体无植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞或原生质体。细胞或原生质体。n n愈伤组织：愈伤组织：由外植体组织增生的细胞产生由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。n n二、细胞分化二、细胞分化n n分化：细胞的这种在形态结构和功能上发分化：细胞的这种在形态结构和功能上发生永久性（不可逆转性）适度变化的过程。生永久性（

9、不可逆转性）适度变化的过程。n n分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴随的是细胞的分化成熟与组织的形成，是随的是细胞的分化成熟与组织的形成，是植物根、茎、叶、花、果实和种子的形成，植物根、茎、叶、花、果实和种子的形成，是一个成熟植物体的出现。是一个成熟植物体的出现。n n三三.离体培养中细胞的脱分化、再分化离体培养中细胞的脱分化、再分化n n脱分化：由失去分裂能力的细胞回复到分脱分化：由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团即愈伤组织的现象。团即愈伤组织的现象。n n再分化：由无分化的愈伤组织的细

10、胞再转再分化：由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能变成为具有一定结构，执行一定生理功能的组织，构成一个完整的植物体或植物器的组织，构成一个完整的植物体或植物器官的现象官的现象n一个已分化细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织和细胞培养所要达到的目的。n n影响细胞脱分化、再分化的因素影响细胞脱分化、再分化的因素n nA A、激素、激素 生长素能促进维管组织形成生长素能促进维管组织形成 细胞细胞分裂素与木质部的发生有关分裂素与木质部的发生有关n nb b、蔗糖浓度、蔗糖浓度 n nC C、光照与温度、光照与温度光照对于维管组织的分化具有促进

11、作用，光照对于维管组织的分化具有促进作用，适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。n n再分化时，可经过两条途径再分化时，可经过两条途径 1、器官发生途径、器官发生途径2、体细胞胚胎发生途径、体细胞胚胎发生途径1、器官发生途径、器官发生途径n n植物的离体器官的发生：植物的离体器官的发生：植物的离体器官的发生：植物的离体器官的发生：n n培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。成不定根、不定芽等器官的过

12、程。成不定根、不定芽等器官的过程。成不定根、不定芽等器官的过程。n n离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上有离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上有离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上有离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上有四种方式：四种方式：四种方式：四种方式：n nA:A:A:A:先芽后根先芽后根先芽后根先芽后根；如小麦，芦荟、苹果；如小麦，芦荟、苹果；如小麦，芦荟、苹果；如小麦，芦荟、苹果 n nB:B:B:B:先根后芽先根后芽先根后芽先根后芽；如枸杞、苜蓿；如枸杞、苜蓿；如枸杞、苜蓿；如枸杞、苜蓿n nC:C:C:C:在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维在愈伤组织的不

13、同部位形成芽和根，再通过维在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株管组织的联系形成完整植株管组织的联系形成完整植株管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石刁柏。如胡萝卜、石刁柏。如胡萝卜、石刁柏。如胡萝卜、石刁柏 n nD:D:D:D:仅有根或芽再生，形成无芽的根或无根的芽。仅有根或芽再生，形成无芽的根或无根的芽。仅有根或芽再生，形成无芽的根或无根的芽。仅有根或芽再生，形成无芽的根或无根的芽。n n器官分化的过程器官分化的过程器官分化的过程器官分化的过程:n n愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段愈伤组织再分化器官一般要经过三个

14、生长阶段愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段1.1.1.1.外植体经过诱导形成愈伤组织。外植体经过诱导形成愈伤组织。外植体经过诱导形成愈伤组织。外植体经过诱导形成愈伤组织。2.2.2.2.生长中心的形成。生长中心的形成。生长中心的形成。生长中心的形成。当把愈伤组织转移到有利于当把愈伤组织转移到有利于当把愈伤组织转移到有利于当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟

15、分现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟分现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟分现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟分生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。3.3.3.3.器官原基及器官形成。器官原基及器官形成。器官原基及器官形成。器官原基及器官形成。生长中心形成后，按照生长中心形成后，按照生长中心形成后，按照生长中心形成后，按照其已确立的极性，某些细胞开始分化形成不同的其已确立的极性，某些细胞开始分化形成不同的其已确立的极性，某些细胞开始分化形成不同的其已确立的极性，某

16、些细胞开始分化形成不同的器官原基，进而分化出相应的组织和器官。器官原基，进而分化出相应的组织和器官。器官原基，进而分化出相应的组织和器官。器官原基，进而分化出相应的组织和器官。愈伤组织分化不定芽愈伤组织分化期愈伤组织分化期2、体细胞胚胎发生途径、体细胞胚胎发生途径n胚状体发生途径形成植株的特征胚状体发生途径形成植株的特征n1 1、具有两极性、具有两极性n 细胞发育早期阶段，从其相反的两端分化出芽端与根端，细胞发育早期阶段，从其相反的两端分化出芽端与根端，而不定芽和不定根都是单向极性。而不定芽和不定根都是单向极性。n2 2、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上、胚状体的维管组织与外植体

17、的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组的联系，而不定芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系织相联系n3 3、胚状体的维管组织的分布是独立的、胚状体的维管组织的分布是独立的“”形，而不定形，而不定芽和不定根的维管组织无此现象。芽和不定根的维管组织无此现象。n4 4、发育过程与合子胚相似。并具有与合子胚类似的形态、发育过程与合子胚相似。并具有与合子胚类似的形态结构，可独立萌发形成小苗。结构，可独立萌发形成小苗。2.4 2.4 植物组培的实验条件植物组培的实验条件l准备室：准备室：进行一切与实验有关的准备工作：器皿进行一切与实验有关的准备工作：器皿洗涤、培养基

18、配制与分装、培养基和培养器皿的洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等灭菌、培养材料的预处理等要求：要求：2020平方米左右。要求宽敞明亮平方米左右。要求宽敞明亮设备：清洗区，干燥箱，工作台，水箱，天平，设备：清洗区，干燥箱，工作台，水箱，天平，灭菌锅等。灭菌锅等。无菌操作室：无菌操作室：也叫接种室，进行材料的立体无菌也叫接种室，进行材料的立体无菌操作，是植物离体培养研究或生产中最关键的一操作，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。步。要求：要求：10-2010-20平方米即可，封闭性好，干燥清洁，平方米即可，封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌能较长时间保持无菌

19、.设备：超净工作台，紫外灯和空调设备：超净工作台，紫外灯和空调 培养室：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养进行控制条件下的培养要求：约需要求：约需10-2010-20平方米左右。基本要求是能够控制平方米左右。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，光照和温度，并保持相对的无菌环境，设备：培养架、光照培养箱或人工气候箱、温湿度设备：培养架、光照培养箱或人工气候箱、温湿度计、空调等。计、空调等。缓冲间：缓冲间：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换体从外

20、界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。培养室。要求：缓冲间需要求：缓冲间需3-53-5平方米，可建在准备室外或无菌平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用墙顶用1-21-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。设备：设备：1-21-2盏紫外灯、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。盏紫外灯、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。基本

21、实验室准备室n n培养室培养室2.5 植物组织培养步骤植物组织培养步骤n n植物组织培养两个步骤：植物组织培养两个步骤：植物组织培养两个步骤：植物组织培养两个步骤：n n1 1 1 1、植物细胞或组织脱分化，形成愈伤组织。、植物细胞或组织脱分化，形成愈伤组织。、植物细胞或组织脱分化，形成愈伤组织。、植物细胞或组织脱分化，形成愈伤组织。n n2 2 2 2、愈伤组织形成分生细胞团，再分化成不同的器、愈伤组织形成分生细胞团，再分化成不同的器、愈伤组织形成分生细胞团，再分化成不同的器、愈伤组织形成分生细胞团，再分化成不同的器官。官。官。官。有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤有的情况下，组织细

22、胞经脱分化后，不形成愈伤有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官 n到底通过哪个途径再生，取决于培养材料和培养到底通过哪个途径再生，取决于培养材料和培养基，尤其培养基中添加激素的种类、浓度及配比基，尤其培养基中添加激素的种类、浓度及配比1 1、培养材料的采集、培养材料的采集n选择具全能性细胞：受精卵、分生组织细胞、雌雄配子及单倍体细胞n常用植物茎尖、下胚轴、幼叶作为外植体。n考虑因素：材料的来

23、源、外植体年龄、产地、外植体的大小、形状、生理部位。n n（1 1 1 1）最常用的组培材料：）最常用的组培材料：）最常用的组培材料：）最常用的组培材料：茎尖、茎段、皮层、表皮、维管组织、块茎、花茎尖、茎段、皮层、表皮、维管组织、块茎、花茎尖、茎段、皮层、表皮、维管组织、块茎、花茎尖、茎段、皮层、表皮、维管组织、块茎、花瓣、根、叶、子叶、胚珠、花药等。瓣、根、叶、子叶、胚珠、花药等。瓣、根、叶、子叶、胚珠、花药等。瓣、根、叶、子叶、胚珠、花药等。茎尖：形态已建成，繁殖率高，不易产生变异。茎尖：形态已建成，繁殖率高，不易产生变异。茎尖：形态已建成，繁殖率高，不易产生变异。茎尖：形态已建成，繁殖率

24、高，不易产生变异。茎尖最先端为无病毒区。通常为茎尖最先端为无病毒区。通常为茎尖最先端为无病毒区。通常为茎尖最先端为无病毒区。通常为0.5cm0.5cm0.5cm0.5cm，无病毒区，无病毒区，无病毒区，无病毒区为为为为0.1mm0.1mm0.1mm0.1mm。缺点：数量少，取材有限。缺点：数量少，取材有限。缺点：数量少，取材有限。缺点：数量少，取材有限。茎段：一般为茎段：一般为茎段：一般为茎段：一般为0.50.50.50.51cm1cm1cm1cm长，取材方便。长，取材方便。长，取材方便。长，取材方便。缺点：所获得的愈伤组织来源不一，有异质性，缺点：所获得的愈伤组织来源不一，有异质性，缺点：所

25、获得的愈伤组织来源不一，有异质性，缺点：所获得的愈伤组织来源不一，有异质性，再生植株易产生变异。再生植株易产生变异。再生植株易产生变异。再生植株易产生变异。叶：取材方便，再生能力强叶：取材方便，再生能力强 。花器官：取材包括花托、花瓣、花药、子花器官：取材包括花托、花瓣、花药、子房等。房等。种子（果实）：无菌种子发芽后可作外植种子（果实）：无菌种子发芽后可作外植体。子叶和下胚轴也可培养。体。子叶和下胚轴也可培养。n n2、培养材料消毒n nA:自来水冲洗、蒸馏水冲洗、无菌滤纸吸干。n nB:无菌操作将材料放入70%酒精浸泡30-60sn nC:将材料移入Naclo饱和液或0.01%升汞消毒8-

26、10min。n nD:取出无菌水冲洗。n n3 3 3 3、制备外植体：、制备外植体：、制备外植体：、制备外植体：n n用消毒过的器械无菌操作将外植体置于培养皿上。用消毒过的器械无菌操作将外植体置于培养皿上。用消毒过的器械无菌操作将外植体置于培养皿上。用消毒过的器械无菌操作将外植体置于培养皿上。切取外植体为适当大小，一般切取外植体为适当大小，一般切取外植体为适当大小，一般切取外植体为适当大小，一般0.2-0.5cm0.2-0.5cm0.2-0.5cm0.2-0.5cm。n n4 4 4 4、接种和培养、接种和培养、接种和培养、接种和培养n n诱导培养基成分一般为基本培养基诱导培养基成分一般为基

27、本培养基诱导培养基成分一般为基本培养基诱导培养基成分一般为基本培养基+细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素+生生生生长素长素长素长素+附加成分附加成分附加成分附加成分,基本培养基一般选择基本培养基一般选择基本培养基一般选择基本培养基一般选择MSMSMSMS配方配方配方配方（1 1 1 1）接种：每瓶约）接种：每瓶约）接种：每瓶约）接种：每瓶约4 4 4 410101010个个个个 （2 2 2 2）封口）封口）封口）封口 （3 3 3 3）培养条件：温度为）培养条件：温度为）培养条件：温度为）培养条件：温度为25+2 25+2 25+2 25+2 光照为光照为光照为光照为100010001

28、00010004000lx 4000lx 4000lx 4000lx pH pH pH pH值常为值常为值常为值常为5.65.65.65.66.0 6.0 6.0 6.0 培养室的相对湿度要常保持在培养室的相对湿度要常保持在培养室的相对湿度要常保持在培养室的相对湿度要常保持在7070707080%80%80%80%。n n5 5 5 5、增殖、增殖、增殖、增殖 把在诱导培养基上分化出的幼芽继代培养。把在诱导培养基上分化出的幼芽继代培养。把在诱导培养基上分化出的幼芽继代培养。把在诱导培养基上分化出的幼芽继代培养。转到增殖培养基上进行培养转到增殖培养基上进行培养转到增殖培养基上进行培养转到增殖培养

29、基上进行培养,这是使幼芽快速增这是使幼芽快速增这是使幼芽快速增这是使幼芽快速增殖的关键环节。殖的关键环节。殖的关键环节。殖的关键环节。n n6 6 6 6、根的诱导、根的诱导、根的诱导、根的诱导 继代培养的不定芽或侧芽需要生根培养，在生根继代培养的不定芽或侧芽需要生根培养，在生根继代培养的不定芽或侧芽需要生根培养，在生根继代培养的不定芽或侧芽需要生根培养，在生根培养基中培养一个月左右方可获得根系。培养基中培养一个月左右方可获得根系。培养基中培养一个月左右方可获得根系。培养基中培养一个月左右方可获得根系。n n7 7 7 7、组培苗的练苗移栽、组培苗的练苗移栽、组培苗的练苗移栽、组培苗的练苗移栽

30、炼炼苗苗与与移移栽栽切取切取2.6 2.6 愈伤组织形成的过程愈伤组织形成的过程 n n外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期n n诱导期n n分裂期n n形成期n n1 1、诱导期：细胞分裂的准备期、诱导期：细胞分裂的准备期 n n诱导期是细胞准备进行分裂，需加入诱导剂或细诱导期是细胞准备进行分裂，需加入诱导剂或细胞分裂素。胞分裂素。n n2 2、分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期、分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期 。n n分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组

31、织的结构，维持其不分化的结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。状态。n n3 3、分化期：从愈伤组织、分化期：从愈伤组织到器官发生到器官发生 。其间受很多。其间受很多因素影响。因素影响。愈愈 伤伤 组组 织织 的的 形形 态态愈愈 伤伤 组组 织织 的的 颜颜 色色n n愈伤组织的种类愈伤组织的种类 1 1、胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构、胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。紧凑、细胞小、再生力强。胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。为胚性愈伤组织。2 2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结、非胚性愈伤组织：表面

32、粗糙、组织结构疏松、细胞大。构疏松、细胞大。复复 习习n n愈伤组织再分化经历两个途径：器官发生愈伤组织再分化经历两个途径：器官发生方式再生植株的三种方式再生植株的三种 途径：途径：可能先长芽后长根（常见）。可能先长芽后长根（常见）。形成根，根上再长出芽（少见）。形成根，根上再长出芽（少见）。在愈伤组织不同部位分别形成根和芽。在愈伤组织不同部位分别形成根和芽。n n胚状体形成途径胚状体形成途径 胚状体：指在植物组织培养中起源于一个非胚状体：指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结构。合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结构。n n体细胞胚与合子胚发育过程相似：体细胞胚与合子

33、胚发育过程相似：原胚原胚 球形胚球形胚 心形胚心形胚 鱼雷形胚鱼雷形胚 子叶型胚子叶型胚胚胚状状体体发发生生途途径径外外 植植 体体 高高浓度生度生长素（素（2,4-D2,4-D）脱脱 分分 化化 愈愈伤组织 高（高（细胞分裂素胞分裂素/生生长素）素）再再 分分 化化 形形 成成 芽芽 低（低（细胞分裂素胞分裂素/生生长素）素）分分 化化 根根 完整植株完整植株激激 素素 控控 制制 器器 官官 分分 化化 模模 式式 图图植物组织培养举例植物组织培养举例n n一、材料和培养基一、材料和培养基n nl0-l5cm高的芦荟幼苗;n n愈伤组织诱导培养基为MS+(1一6mg/L)BA+(0.1一0

34、.5mg/L)NAA;n n分化培养基为MS+(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA;n n生根培养基为MS+(0.1一0.5mg/L)IBA+(2一5mg/L)PP33。n n二、繁殖方法二、繁殖方法 n n(一一)愈伤组织培养愈伤组织培养 n n将准备好的芦荟幼苗在清水中冲洗数次，剪去叶片和大部分将准备好的芦荟幼苗在清水中冲洗数次，剪去叶片和大部分茎段，取茎尖部分，再冲洗茎段，取茎尖部分，再冲洗1-21-2次，淋干。在超净台上，先次，淋干。在超净台上，先用用75%75%的乙醇将茎尖浸泡的乙醇将茎尖浸泡30-60s30-60s，再用升汞浸，再用升汞浸5-l0min5-l0m

35、in，最后，最后用无菌水冲洗数次。用解剖刀取出包括茎尖生长点的组织切用无菌水冲洗数次。用解剖刀取出包括茎尖生长点的组织切块，块，接种到愈伤组织诱导培养基上接种到愈伤组织诱导培养基上。大约。大约15-25d15-25d后，试管中后，试管中接种的外植体就可以膨大，形成愈伤组织。愈伤组织的形成接种的外植体就可以膨大，形成愈伤组织。愈伤组织的形成标志着接种的外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新标志着接种的外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。愈伤组织形成恢复分生能力。愈伤组织形成1 1周后，就可将愈伤组织转管周后，就可将愈伤组织转管进行继代培养或分化培养。进行继代培养或分化培养。n

36、 n(二二)继代培养继代培养 将愈伤组织在无菌条件下，用解剖刀将愈伤将愈伤组织在无菌条件下，用解剖刀将愈伤块切成数个小块，再接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角块切成数个小块，再接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，在与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天瓶中，在与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后，小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继代培养。通过后，小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继代培养。通过愈伤组织的继代培养，原来接种的愈伤组织的继代培养，原来接种的1 1个芦荟茎尖组织可繁殖个芦荟茎尖组织可繁殖出大量的新接种材料来，用于分化培养。出大量的新接种材料来，用于分化培养。n

37、n(三三)分化培养分化培养 将愈伤组织在无菌条件下，从试管或三角将愈伤组织在无菌条件下，从试管或三角瓶中取出，用无菌水洗净，切成小接种块，接种到装有分瓶中取出，用无菌水洗净，切成小接种块，接种到装有分化培养基的三角瓶中，分化培养的条件同愈伤组织培养。化培养基的三角瓶中，分化培养的条件同愈伤组织培养。大约大约30-50d30-50d后，愈伤组织就可分化出芽，并继续长出小叶后，愈伤组织就可分化出芽，并继续长出小叶片。当分化出的幼苗长到一定高度或分化出一定数量后，片。当分化出的幼苗长到一定高度或分化出一定数量后，将这些小幼苗在无菌条件下取出，进行生根培养或重新诱将这些小幼苗在无菌条件下取出，进行生根

38、培养或重新诱导分化。导分化。n n(四四)生根培养生根培养 当三角瓶中的幼苗叶片长到当三角瓶中的幼苗叶片长到3cm3cm左右时，将左右时，将幼苗在无菌条件下取出，放入装有生根培养基的三角瓶中幼苗在无菌条件下取出，放入装有生根培养基的三角瓶中培养，培养条件同分化培养。大约半个月后，幼苗即可生培养，培养条件同分化培养。大约半个月后，幼苗即可生根。根。n n(五五)炼苗炼苗 当幼苗的根长到一当幼苗的根长到一 定长度，幼苗形体已显健壮定长度，幼苗形体已显健壮时。将幼苗取出，在清水中洗除附着在根上的培养基时。将幼苗取出，在清水中洗除附着在根上的培养基(注注意意:一定要严格洗净，否则会烂根一定要严格洗净，

39、否则会烂根)。n n(六六)移栽移栽 炼苗后，将幼苗移栽入由蛭石组成的驯化苗圃炼苗后，将幼苗移栽入由蛭石组成的驯化苗圃中驯化，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约中驯化，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15-20d15-20d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。n n1 1、在植物育种上的应用、在植物育种上的应用 n n突变育种：突变育种：无论是愈伤组织培养还是细胞培养，无论是愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界压力的影响而产生诱变，从中可以筛选出和外界压力的影响而产生诱

40、变，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。对人们有用的突变体，从而育成新品种。n n原生质体融合和细胞杂交：原生质体融合和细胞杂交：可部分克服有性杂交可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种或不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种或育成优良品种育成优良品种。n n单倍体育种：单倍体育种：利用花药培养诱导花粉形成单倍体，利用花药培养诱导花粉形成单倍体，在试管培养中通过秋水仙素处理，使染色体加倍，在试管培养中通过秋水仙素处理，使染色体加倍，而成为纯合二倍体植物，从而缩短新品种育种的而成为纯合二倍体植物，从而缩短新品种育种的时间，还有利于突变中隐性突变的分离。时间，还

41、有利于突变中隐性突变的分离。2.7 植物组织培养的应用植物组织培养的应用n n2、在植物脱毒和快速繁殖上的应用n n植物脱毒植物脱毒和离体快速繁殖离体快速繁殖是目前植物组织培养应用最多、最有效的一个方面。很多农用物都带有病毒，特别是无性繁殖植物，但是，患病植株并非每个部位都带有病毒，利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养，再生的植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒苗，再用脱毒苗进行繁殖，则种植的作物就不会或极少发生病毒。马马铃铃薯薯脱脱病病毒毒试试管管苗苗n n由于组织培养法繁殖作物的突出特点是快速，因此，对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”作物品种的繁殖，意义更大。对于

42、脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖，同时可不受地区、气候的影响，比常规方法快数万倍到数百万倍的速度扩大繁殖，及时提供大量优质种薯和种苗。n n3 3、在植物种质资源保存和交换上的应用、在植物种质资源保存和交换上的应用n n 由于自然灾害和生物之间的竞争以及人类活动由于自然灾害和生物之间的竞争以及人类活动对大自然的影响，已有相当数量的植物物种在地对大自然的影响，已有相当数量的植物物种在地球上消失或正在消失。具有独特遗传性状的生物球上消失或正在消失。具有独特遗传性状的生物物种的绝迹是一种不可挽回的损失。利用植物组物种的绝迹是一种不可挽回的损失。利

43、用植物组织和细胞法低温保存种质，给保存和抢救有用基织和细胞法低温保存种质，给保存和抢救有用基因带来了希望。例如胡萝卜和烟草等植物的细胞因带来了希望。例如胡萝卜和烟草等植物的细胞悬浮物，在悬浮物，在-20-20至至-196-196的低温下贮藏数月，尚的低温下贮藏数月，尚能恢复生长，再生成植株。能恢复生长，再生成植株。2.8 人工种子人工种子n2.8.1 人工种子理论基础n胚状体：n 是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结构，又称体细胞胚。A:体细胞胚胎发生特点n1、是离体培养的产物n2、起源于非合子细胞n3、发育过程与合子胚相似，也经历球形期、心形期、鱼雷期和子叶期阶

44、段。nB:体细胞胚胎发生途径n n 胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生，大致分为五种：直接从器官外植体上发生愈伤组织发生悬浮培养细胞发生单倍体细胞发生原生质体发生2.8.2 2.8.2 人工种子概念人工种子概念人工种子概念人工种子概念n n利用人工种皮包被体细胞胚可以制造人工种子。利用人工种皮包被体细胞胚可以制造人工种子。人工种子的结构人工种子的结构人工种子的结构人工种子的结构n n农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、胚乳和胚三部分构成。胚乳和胚三部

45、分构成。胚乳和胚三部分构成。胚乳和胚三部分构成。n n目前研制的人工种子的结构目前研制的人工种子的结构目前研制的人工种子的结构目前研制的人工种子的结构:体细胞胚体细胞胚体细胞胚体细胞胚 人工种皮人工种皮人工种皮人工种皮 人工胚乳人工胚乳人工胚乳人工胚乳n n2.8.3 人工种子的基本制作流程人工种子的基本制作流程 外植体的选择和消毒外植体的选择和消毒 愈伤组织的诱愈伤组织的诱导导体细胞胚的诱导体细胞胚的诱导 体细胞胚的体细胞胚的同步化同步化体细胞胚的分选体细胞胚的分选体细胞胚体细胞胚的包裹的包裹(人工胚乳人工胚乳)包裹外膜包裹外膜发芽发芽成苗试验成苗试验体细胞胚变异程度与农艺研体细胞胚变异程度

46、与农艺研究。究。n n人工种子制作过程中，包埋是最重要环节n n包括包埋介质的选择，主要是人工胚乳和人工种皮的选择n n人工胚乳一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成,养分包括矿质元素、维生素、碳源以及激素等 n n对于人工胚乳包埋介质的要求：对于人工胚乳包埋介质的要求：n n首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。和种植操作中的安全。n n同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。以供繁

47、殖体发芽的需要。n n此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。菌剂。n n海藻酸钠作包埋剂海藻酸钠作包埋剂 2.8.4 人工种子优点：n n第一，它同微繁殖技术一样，培养条件可以人为第一，它同微繁殖技术一样，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素，且具控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素，且具有省地省工可直接在田间播种等优点。有省地省工可直接在田间播种等优点。n n第二，在人工种子制作中，可加入营养物质、植第二，在人工种子制作中，可加入营养物质、植

48、物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，这是微繁殖物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，这是微繁殖难以达到的。难以达到的。n n第三，用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生第三，用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率。物反应器大规模培养，大大提高了效率。n n第四，一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒第四，一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。用于生产。2.9 2.9 植物细胞培养植物细胞培养n n2.9.1 2.9.1 n n概念：概念：离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的离体条件下，

49、将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养。得到分散组织置于液体培养基中进行振荡培养。得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖。成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖。从而获得大量细胞群体的一种技术。从而获得大量细胞群体的一种技术。n n方法：方法：n n根据对象：单细胞培养、单倍体培养、原生质体根据对象：单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养。培养。n n按培养系统：悬浮培养、液体培养、固体培养、按培养系统：悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养固定化培养n n图图3-73-72.9.2 植物单细胞培养植物单细胞培养n n1、单细胞制备方法n n由完整的植物器官分离单

50、细胞由培养组织由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞中分离单细胞A:机械法：通过机械磨碎、切割植物体获得游离单细胞。B:酶解法：采用水解酶去除细胞壁，释放出细胞，用来制备原生质体。n叶片是分离单细胞的最好材料叶片是分离单细胞的最好材料 机械法机械法机械法机械法露出叶肉细胞露出叶肉细胞用用解剖刀刮下细胞解剖刀刮下细胞撕去下撕去下表皮表皮加加果胶酶果胶酶过滤、离心过滤、离心Takebe等（等（1968）最早报道：用果）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞n nC:愈伤组织诱导法：先获得愈伤组织，在通过震荡获得单个细胞n n步骤：n n(1)诱导产生愈