实验一收集动物组织的活细胞—RH.ppt

《实验一收集动物组织的活细胞—RH.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验一收集动物组织的活细胞—RH.ppt（28页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、实验一实验一 收集动物组织的活收集动物组织的活细胞并计数和测定成活率细胞并计数和测定成活率问问 题题如何知道每升血液中红细胞、白细胞、血小板如何知道每升血液中红细胞、白细胞、血小板的数量？的数量？如何知道水样中某小型生物的数量？如何知道水样中某小型生物的数量？如何知道发酵液中啤酒酵母的密度？如何知道发酵液中啤酒酵母的密度？如何知道生物制剂生产罐中细胞的密度？如何知道生物制剂生产罐中细胞的密度？实验目的实验目的学习机械分离法获得动物组织的活细胞学习机械分离法获得动物组织的活细胞学会使用学会使用血球计数板血球计数板测定细胞悬液的细胞密度测定细胞悬液的细胞密度掌握活细胞和死细胞的鉴别方法掌握活细胞和

2、死细胞的鉴别方法收集动物组织的活细胞收集动物组织的活细胞 从组织中分离单细胞的方法有多种：从组织中分离单细胞的方法有多种：对于较为柔软的组织（如肝脏、脾脏），可以采对于较为柔软的组织（如肝脏、脾脏），可以采用用机械研磨机械研磨的方法分离细胞，但这会造成一些细的方法分离细胞，但这会造成一些细胞的损伤而降低细胞的成活率；胞的损伤而降低细胞的成活率；对于比重差异较大的细胞，可以采用对于比重差异较大的细胞，可以采用离心离心的方法的方法来分离，例如血液中各种血细胞的分离；来分离，例如血液中各种血细胞的分离；对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股冲洗股骨腔骨腔的方法

3、获得。的方法获得。实验材料实验材料小鼠小鼠小鼠的抓法：小鼠的抓法：从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。纸上。小鼠的处死：颈椎脱位法小鼠的处死：颈椎脱位法右手（左手）右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉抓住鼠尾用力向后拉，同时左手，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实大量的肌肉活动。

4、经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。验动物对痛觉不再敏感。脾脏淋巴细胞悬液的制备脾脏淋巴细胞悬液的制备1.1.机械分离法机械分离法 用镊子将脾脏置于尼龙布上，用注射器推棒轻轻用镊子将脾脏置于尼龙布上，用注射器推棒轻轻挤压组织，使细胞分散。将尼龙布置于玻璃漏斗挤压组织，使细胞分散。将尼龙布置于玻璃漏斗中，用中，用D-HankD-Hanks s 液冲洗尼龙布，收集细胞悬液液冲洗尼龙布，收集细胞悬液于离心管中。于离心管中。2.2.低渗溶解红细胞（红细胞溶血）低渗溶解红细胞（红细胞溶血）0.87%NH0.87%NH4 4Cl Cl 溶液溶液 股骨骨髓细胞悬液的制备股骨骨髓细胞悬液的制备冲洗

5、骨髓腔冲洗骨髓腔 ：用剪刀剪开股骨的用剪刀剪开股骨的一端一端，将注射器针头插入股骨开，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端另一端，用，用D-HankD-Hanks s液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中。D-HANKS液液(无钙镁离子的无钙镁离子的HANKS液液)配方配方NaCl 80.0NaCl 80.0克克NaNa2 2HPOHPO4 42H2H2 2O 0.6O 0.6克克 （如为（如为12H12H2 2O O，则需，则需1.21.2克）克）KCl 4.0KCl 4.0克克KHKH2 2POPO4 4

6、 0.6 0.6克克双蒸水双蒸水 10001000毫升毫升 原液稀释原液稀释1010倍即为使用液倍即为使用液-D-Hank-D-Hanks s液液细胞计数和细胞存活率细胞计数和细胞存活率利用单细胞悬液进行实验研究时，通常需要确定细利用单细胞悬液进行实验研究时，通常需要确定细胞悬液的细胞密度和活细胞的数量，这就要进行细胞悬液的细胞密度和活细胞的数量，这就要进行细胞计数和细胞存活率的测定。胞计数和细胞存活率的测定。细胞计数一般用细胞计数一般用血球计数板血球计数板，细胞存活率的测定，细胞存活率的测定一般采用一般采用染色法染色法。细胞密度：细胞密度：每每mlml细胞悬液中的细胞数细胞悬液中的细胞数细胞

7、成活率：细胞成活率：总细胞中活细胞所占的百分比总细胞中活细胞所占的百分比 血球计数板的结构血球计数板的结构血球计数板是特制的厚载玻血球计数板是特制的厚载玻片，中央区域有四条凹槽片，中央区域有四条凹槽而形成三个平台，中间平而形成三个平台，中间平台较宽，它又被一短横槽台较宽，它又被一短横槽分隔为两部分，每一部分分隔为两部分，每一部分均有一个方格网。均有一个方格网。v每一方格网可分为每一方格网可分为九个大方格九个大方格。v四四角角4 4个个大大方方格格分分别别被被分分为为1616个个中中方方格。格。v中央大方格分为中央大方格分为2525个中方格，每个中个中方格，每个中方格又可分为方格又可分为1616

8、个个小方格。中央大方小方格。中央大方格共含有格共含有400400个小个小方格。方格。双线分隔双线分隔双线分隔双线分隔血球计数板的原理血球计数板的原理白白细细胞胞计计数数法法采采用用四四角角4 4个个大大方方格格的的区区域域，适适用用于于细胞较大数量较少的样品细胞较大数量较少的样品红红细细胞胞计计数数法法采采用用中中央央大大方格的区域方格的区域血球计数板的原理血球计数板的原理 计数室大方格边长为计数室大方格边长为1mm1mm，面积为，面积为1mm1mm2 2，中间平台与，中间平台与盖玻片之间的距离（高）为盖玻片之间的距离（高）为0.1mm0.1mm，所以每个大方格，所以每个大方格的固定容积为的固

9、定容积为0.1mm0.1mm3 3。血盖片血盖片血盖片血盖片计数室计数室计数室计数室血球计数板的计数公式血球计数板的计数公式1 1每个大方格的总体积为每个大方格的总体积为0.1mm0.1mm3 3 1 ml=1000 mm 1 ml=1000 mm3,3,0.1 mm 0.1 mm3 3=10=10-4-4 mlml 每角大方格的细胞数每角大方格的细胞数10000=10000=细胞数细胞数/ml/ml 4 4角大方格中细胞总数角大方格中细胞总数细胞密度细胞密度=10104 4 4 4 稀释倍数稀释倍数=细胞数细胞数/ml/ml悬液悬液计数规则计数规则v位位于于格格线线上上细细胞胞只只计计上上边

10、边线线和和左左边边线线上上的的，即即“数数上上不不数数下下，数数左左不不数数右右”v由由两两个个以以上上细细胞胞组组成成的的细细胞胞团团，应应按按单个细胞计算。单个细胞计算。注意事项注意事项v向向血血球球计计数数板板加加样样前前，须须将将细细胞胞悬悬液液充充分分摇摇匀匀；v加加样样过过程程中中，应应避避免免将将细细胞胞悬悬液液滴滴在在盖盖玻玻片片（血血盖盖片片）上上，避避免有气泡产生；免有气泡产生；v细细胞胞悬悬液液密密度度过过大大时时，应应适适当当稀稀释释后后再再计计数数。加样处加样处加样处加样处细胞密度的结果记录细胞密度的结果记录左上左上角角左下左下角角右上右上角角右下右下角角细胞细胞总数

11、总数稀释稀释倍数倍数细胞细胞密度密度脾脏脾脏淋巴淋巴细胞细胞骨髓骨髓细胞细胞在在1010的低倍镜下计数，细胞为透亮的小圆点。的低倍镜下计数，细胞为透亮的小圆点。细胞成活率的测定细胞成活率的测定利用染色法，判断细胞的死活；利用染色法，判断细胞的死活；活细胞的细胞膜具有选择通透性，不能被活细胞的细胞膜具有选择通透性，不能被 台盼蓝台盼蓝染色，呈无色透明状；染色，呈无色透明状；死细胞的细胞膜通透性增大，被染成蓝色死细胞的细胞膜通透性增大，被染成蓝色；细胞总数细胞总数死细胞数死细胞数 细胞存活率细胞存活率=100%100%细胞总数细胞总数在载玻片上操作在载玻片上操作注意事项注意事项应应在在短短时时间间

12、内内完完成成细细胞胞存存活活率率的的测测定定，否否则则活活细细胞会被染料毒死而着色，影响实验结果的准确性；胞会被染料毒死而着色，影响实验结果的准确性；应应在在几几个个视视野野下下计计算算死死活活细细胞胞的的数数量量，避避免免人人为为因素的干扰；因素的干扰；可可以以在在4040倍倍的的高高倍倍镜镜下下，计计算算视视野野中中的的细细胞胞总总数和其中的死细胞数。数和其中的死细胞数。细胞成活率的结果记录细胞成活率的结果记录 视野视野1 1视野视野2 2视野视野3 3视野视野4 4细胞细胞总数总数死细死细胞总胞总数数细胞细胞成活成活率率脾脏脾脏淋巴淋巴细胞细胞骨髓骨髓细胞细胞v每每一一方方格格网网可可分

13、分为为九个大方格。九个大方格。v中中央央大大方方格格分分为为2525个个中中方方格格，每每个个中中方方格格又又可可分分为为1616个个小小方方格格。中中央央大大方方格格共共含含有有400400个个小小方格。方格。双线分隔双线分隔双线分隔双线分隔实验报告实验报告实验过程中将原始数据记录在实验讲义中；实验过程中将原始数据记录在实验讲义中；在实验报告纸上进行实验数据的计算和结果分析；在实验报告纸上进行实验数据的计算和结果分析；回答问题；回答问题；阅读文献资料。阅读文献资料。成成 绩绩每次实验报告均打分并累计为平时成绩；每次实验报告均打分并累计为平时成绩；如发现实验报告和作业的抄袭，抄袭者和被抄袭如发

14、现实验报告和作业的抄袭，抄袭者和被抄袭者的成绩均记为者的成绩均记为0 0分。分。显微镜的组成部分显微镜的组成部分目镜目镜观察筒观察筒物镜转换台物镜转换台物镜物镜标本夹标本夹载物台载物台X,YX,Y轴旋纽轴旋纽电源开关电源开关光强调节纽光强调节纽光源光源聚光镜升降旋钮聚光镜升降旋钮光阑调节器光阑调节器调节瞳间距调调节瞳间距调节屈光度节屈光度所需物镜、所需物镜、聚焦聚焦5、4、1、放入放入样品样品转换转换聚光镜聚光镜 10X 物镜物镜2、3、40X 物镜物镜观察观察6、明场观察明场观察 观察步骤思思 考考本次实验要解决什么问题？本次实验要解决什么问题？采用什么方法来解决这些问题？采用什么方法来解决这些问题？还能用其他什么方法来解决这些问题吗？还能用其他什么方法来解决这些问题吗？应用这些方法还能解决什么问题？应用这些方法还能解决什么问题？