液相色谱方法开发new0603ppt课件.ppt

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1、ZJGSUZJGSU液相色谱的应用以及方法开发ZJGS UniversityZJGS University提提 纲：纲：一一一一.HPLC.HPLC的应用的应用的应用的应用二二二二.方法开发过程方法开发过程方法开发过程方法开发过程 1 1）选择）选择）选择）选择HPLCHPLC检测器检测器检测器检测器 2 2）方法开发的具体步骤）方法开发的具体步骤）方法开发的具体步骤）方法开发的具体步骤 3 3）梯度洗脱方法）梯度洗脱方法）梯度洗脱方法）梯度洗脱方法ZJGS UniversityZJGS University一一.HPLC的广泛应用的广泛应用v 据2008年统计，世界上化合物总数多达5000多

2、万种v在全部有机化合物中仅有20左右的样品适用于GC分析v而HPLC可对80左右的有机化合物进行分离和分析ZJGS UniversityZJGS UniversityHPLC的广泛应用的广泛应用v HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备v 在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力。ZJGS UniversityZJGS UniversityHPLC的应用领域的应用领域vv在食品研究中的分析应用在食品研究中的分析应用食品中的天然成分食品中的天然成分碳水化合物类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、

3、肽、氨基酸食品添加剂食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素维生素污染物污染物霉菌（黄曲霉毒素农药残留和兽药残留多环芳烃（PAHS和亚硝酸ZJGS UniversityZJGS UniversityHPLC的应用领域的应用领域vv 在医药研究中分析应用在医药研究中分析应用在医药研究中分析应用在医药研究中分析应用 药物分析有药物分析有药物分析有药物分析有USPUSP、BPBP、CPCP等标准等标准等标准等标准 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。管药、磺胺类消炎药等。甾体药

4、物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。素和孕激素等。抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。四环素、氯霉素、诺氟沙星等。中草药研究中的应用：生物碱、甙类中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙皂甙、强心甙、黄酮甙等等)、萜类、萜类手性药物手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂如解毒剂D-D-青霉青霉胺毒性小，胺毒性小，L-L-异构体毒性很强异构体毒性很强)医疗药物的检测

5、、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。v 在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用ZJGS UniversityZJGS UniversityHPLC 的应用领域的应用领域v 在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)v 在精细化工分析中的应用在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮

6、、醚的分离分析酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品ZJGS UniversityZJGS UniversityHPLC的应用领域的应用领域vv化妆品行业要控制和分析：化妆品行业要控制和分析：化妆品行业要控制和分析：化妆品行业要控制和分析：防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；vv在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工

7、作需要投毒药物、毒品分析等投毒药物、毒品分析等投毒药物、毒品分析等投毒药物、毒品分析等vv在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测酚类和胺类的检测酚类和胺类的检测酚类和胺类的检测v 在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析 ZJGS UniversityZJGS Un

8、iversityZJGS UniversityZJGS UniversityZJGS UniversityZJGS University二二.方法开发的过程方法开发的过程Adapted from:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;Practical HPLC Method Development 2nd Ed.,Wiley-Interscience,New York,1997,p.21.1.得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标2.2.确定特定确定特定确定特定确定特定HPLCHPLC过程、

9、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求3.3.选择合适的检测器选择合适的检测器选择合适的检测器选择合适的检测器4.4.选择选择选择选择HPLCHPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件5.5.优化分离条件优化分离条件优化分离条件优化分离条件6.6.检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要7.7.定量校正定量校正定量校正定量校正8.8.日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认ZJG

10、S UniversityZJGS University第一步干什么第一步干什么?想办法得到各种信息想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法品的分析方法查文献和方法，如查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-CA,AA,AOAC,EPA-仪器制造商的文献，如仪器制造商的文献，如Dionex,WatersDionex,Waters对色谱柱有足够的了解对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品充分了解您自己的样品ZJGS UniversityZJGS University分析

11、时要了解哪方面的情况？分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析有多少组份要分析?对分析的精确度、准确度等有多高要求对分析的精确度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用是否因是日常检验，而要求方法容易使用?ZJGS UniversityZJGS University分离分离(制备制备)时要了解哪方面的情况？时要了解哪方面的情况？要分离（即制备）的样品量有多大要分离（即制备）的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量还是微量?是否需要保持生物活性是否需要

12、保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成纯度或活性的鉴定如何完成?ZJGS UniversityZJGS University使用文献方法注意点使用文献方法注意点色谱柱填料的种类、品牌是否相同色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相注意文献方法的流动相是否损害色谱柱是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量需要调整流速、进样量注意梯度条件注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）了解系统的滞后体积（梯度）ZJGS Un

13、iversityZJGS University1）选择）选择HPLC检测器检测器对样品有响应并有一个输出信号对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是：但是：但是：但是：由于受由于受HPLCHPLC系统其他部件的影响会产生响应与系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象浓度之间关系的与线性偏离现象并不是所有的检测器是线性的并不是所有的检测器是线性的受受HPLCHPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可系统其他部件的影响，检

14、测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距能与其最佳水平有较大的差距ZJGS UniversityZJGS University2）方法开发一般的具体步骤）方法开发一般的具体步骤先用一根短的色谱柱先用一根短的色谱柱用相对较高的流速用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液先用高强度的洗脱液调节调节k k 值改变保留值值改变保留值调节调节a a值改变选择性值改变选择性通过改变流动相的pH值，使样品成中性加入“对离子”，使样品呈中性调节柱长度改变柱效及分离速度调节柱长度改变柱效及分离速度ZJGS UniversityZJGS University反相色谱的方法开

15、发反相色谱的方法开发开发过程实例开发过程实例色谱条件色谱条件 色谱柱：C18，4.6mm15mm流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度）举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：1ml/minZJGS UniversityZJGS University方法开发的其他因素方法开发的其他因素流速对柱效的影响流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有自己的最佳流速不同内径的色谱柱有自己的最佳流速样品的进样量样品的进样量(浓度浓度)对柱效的影响对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响以上因素均影响分离度

16、ZJGSUZJGSU 3）液相色谱的方法开发 梯度洗脱法梯度洗脱法ZJGS UniversityZJGS University液相色谱泵液相色谱泵稳定平滑并且重现性好的流速稳定平滑并且重现性好的流速可靠且充分的溶剂混合可靠且充分的溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的梯度形成准确及重现的梯度形成有效的流速范围有效的流速范围制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑滞后体积滞后体积梯度分析更为关注梯度分析更为关注目的：在任何情况下保持最高精度目的：在任何情况下保持最高精度目的：在任何情况下保持最高精度目的：在任何情况下保持最高精度ZJGS Univ

17、ersityZJGS University梯度的洗脱方式梯度的洗脱方式高压梯度及低压梯度高压梯度及低压梯度ZJGS UniversityZJGS University梯度：高压混合梯度：高压混合高压梯度高压梯度使用多台色谱泵，在泵后混合使用多台色谱泵，在泵后混合配置灵活、简单，脱气简单配置灵活、简单，脱气简单易调节梯度的滞后体积易调节梯度的滞后体积ZJGS UniversityZJGS University梯度：低压混合梯度：低压混合低压梯度低压梯度用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合对脱气要求高对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积不易调节梯度的滞后体积如设计不当

18、，梯度的如设计不当，梯度的准确性受影响准确性受影响滞后体积（系统滞后体积（系统体积）设计合理体积）设计合理ZJGS UniversityZJGS University梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点优点优点单位时间的分离能力增加单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高检测灵敏度提高缺点缺点仪器设备要求高仪器设备要求高不适合某些检测方式不适合某些检测方式(RI)(RI)柱需再生平衡柱需再生平衡定量分析的重复性较低？定量分析的重复性较低？ZJGS UniversityZJGS University一般流出问题一般流出问题n早流出峰的分离度差.n迟流出峰的峰宽增加而峰高降低.n由于k范围宽，所以分析时间长.

19、n强保留组分造成柱污染.等梯度洗脱等梯度洗脱-在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.ZJGS UniversityZJGS UniversityAnalytical Education CenterH5929A 11-09梯度洗脱梯度洗脱-一个解决方案一个解决方案优点优点 改善分离度 提高检测性能 能够分离复杂样品 缩短分析时间 降低由于强保留组分而使色谱 柱性能变差的可能性其他应用其他应用 柱清洗 方法开发中的尝试运行 梯度洗脱梯度洗脱-在分离过程中改变流动相组成.ZJGS UniversityZJGS University梯度平衡时间的影响（一）梯度平衡时间的影响（一）10分钟的梯

20、度，6分钟的平衡时间色谱图不重复ZJGS UniversityZJGS University梯度平衡时间的影响（二）梯度平衡时间的影响（二）平衡时间6分钟平衡时间7分钟平衡时间8分钟平衡时间9分钟 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。ZJGS UniversityZJGS University高效液相经常使用粒径5um 的色谱柱，用过一段时间后，柱压会略有升高，尤其是做中药。常用来洗色谱柱的溶剂为甲醇，当色谱柱用甲醇洗过之后，再用含乙腈的流动相平衡，会使柱压迅速升高，色谱柱渗漏，这是由于甲醇和乙腈

21、汇合产生局部高压。因此，这种情况下，应慢慢升高流速，可以从0.6ml/min开始，一步步的平稳柱压，防止色谱柱漏液。梯度洗脱装置分两种：梯度洗脱装置分两种：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂分别输入，高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂分别输入，低压梯度：在常压下将两种或多种溶剂先混合，然后用高压低压梯度：在常压下将两种或多种溶剂先混合，然后用高压 泵将流动相输入到色谱柱中。泵将流动相输入到色谱柱中。梯度洗脱优点：梯度洗脱优点：提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。在使用梯度洗脱时需要注意的地方：在使用梯度洗脱时需要注

22、意的地方：1.1.注意各溶剂间的互溶性；注意各溶剂间的互溶性；2.2.对溶剂的纯度要求更高（影响重现性）；对溶剂的纯度要求更高（影响重现性）；3.3.注意梯度变化导致系统压力的变化，防止超出限度注意梯度变化导致系统压力的变化，防止超出限度。混合溶剂的粘度常随组成的变化而变化。在梯度洗脱时，常会出现压混合溶剂的粘度常随组成的变化而变化。在梯度洗脱时，常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是，当二者以相近的比例混合力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是，当二者以相近的比例混合时，粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要时，粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇

23、为流动相时的两倍。因此要防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。ZJGS UniversityZJGS University4.4.低压梯度混合后易产生气泡，要注意脱气。一般低压梯度是需低压梯度混合后易产生气泡，要注意脱气。一般低压梯度是需要在线脱气机来完成的，因各流路溶剂混合后会产生很多气泡；要在线脱气机来完成的，因各流路溶剂混合后会产生很多气泡；而高压梯度可不用脱气机脱气。而高压梯度可不用脱气机脱气。5.5.梯度操作容易出现鬼峰，应作空白试验。空白对照至少做三梯度操作容易出现鬼峰，应作空白试验。空白对照至少做三

24、次。次。6.6.选择梯度操作时，几相之间相变化要尽量小选择梯度操作时，几相之间相变化要尽量小,否则不易平衡。否则不易平衡。7.7.梯度洗脱应选用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如梯度洗脱应选用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。8.要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出。要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出。特别要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱特别

25、要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和溶。例如：乙腈和1mol/L1mol/L的醋酸铵（的醋酸铵（pH5.16pH5.16）做梯度洗脱，乙）做梯度洗脱，乙腈含量超过腈含量超过70%70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于于30%30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。盐的结晶体，尤其使用磷

26、酸盐时需特别小心。9.9.每次梯度洗脱后必须对色谱柱进行再生处理，将柱子平衡到每次梯度洗脱后必须对色谱柱进行再生处理，将柱子平衡到初始状态。梯度结束后用初始流动相冲洗，可用初始状态。梯度结束后用初始流动相冲洗，可用10103030倍柱容倍柱容积的初始流动相洗脱色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全积的初始流动相洗脱色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡！柱子再生。（梯度周期）平衡！柱子再生。（梯度周期）9.9.要检测的峰尽量在有机相和水相的比例稳定时出峰，这要检测的峰尽量在有机相和水相的比例稳定时出峰，这样出峰时间的重现性较好；样出峰时间的重现性较好；10.10.有机相的比例不是越高越好，只要

27、样品峰能满足要求有机相的比例不是越高越好，只要样品峰能满足要求即可，有机相比例相差越大，梯度要平衡的时间越长即可，有机相比例相差越大，梯度要平衡的时间越长 ；11.11.低压混合，流速慢，做质谱时，尽量不要跑梯度，平衡低压混合，流速慢，做质谱时，尽量不要跑梯度，平衡时间比较长（除非你要测多个成分，比如中药指纹图谱），时间比较长（除非你要测多个成分，比如中药指纹图谱），如果非要跑，一定要尽量减小死体积。如果非要跑，一定要尽量减小死体积。12.12.梯度淋洗和气相色谱中的程序升温相似，给色谱分离带来梯度淋洗和气相色谱中的程序升温相似，给色谱分离带来很大的方便，它对于复杂混合物，特别是保留强度差异很

28、大的很大的方便，它对于复杂混合物，特别是保留强度差异很大的混合物的分离，是重要的手段。但离子色谱电导检测器是一种混合物的分离，是重要的手段。但离子色谱电导检测器是一种总体性质的检测器，因此梯度淋洗一般只在含氢氧根离子的淋总体性质的检测器，因此梯度淋洗一般只在含氢氧根离子的淋洗液中采用抑制电导检测时才能实现。洗液中采用抑制电导检测时才能实现。13.13.初始平衡时间尽量长点初始平衡时间尽量长点,第一针最好不要第一针最好不要,每走完一针后的每走完一针后的平衡时间尽量一致。平衡时间尽量一致。(很重要很重要)14.14.注意柱子的耐水性如何注意柱子的耐水性如何,如果水相过高如果水相过高,很难做到重现。

29、很难做到重现。18.18.注意测量的波长注意测量的波长,如果接近截止波长如果接近截止波长,请选用梯度级试剂。请选用梯度级试剂。ZJGS UniversityZJGS University改变流速改变流速5%/min1 ml/min-5%/ml5%/min2.5 ml/min-2%/mlZJGS UniversityZJGS University结论结论充分用已知样品结构确定以哪种方法开始充分用已知样品结构确定以哪种方法开始普通反相普通反相?离子抑制离子抑制?离子对离子对?还是其他还是其他观察流动相条件改变时色谱峰的移动观察流动相条件改变时色谱峰的移动根据变化的方向及大小决定下一步干什么根据变化

30、的方向及大小决定下一步干什么改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！色谱柱的改变影响最大色谱柱的改变影响最大梯度洗脱有利于复杂样品的分离梯度洗脱有利于复杂样品的分离ZJGS UniversityZJGS University开发液相色谱方法的考虑因素开发液相色谱方法的考虑因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素除除分分离离度度之之外外，在在开开发发色色谱谱方方法法时时，以以下下几几个个因因素也都要考虑：素也都要考虑：灵敏度灵敏度载样量载样量分析速度分析速度溶剂损耗溶剂损耗成本成本容易使用容易使用色谱柱寿命色谱柱寿命效率效率ZJGS UniversityZJGS University谢谢 谢谢ZJGS UniversityZJGS University