第二章第二节基因工程四要素优秀PPT.ppt

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1、第二章第二节基因工程四要素第一页，本课件共有67页四大要素解决四大要素解决5 5大操作元件的几大操作元件的几个问题个问题1、用什么来、用什么来”切切“？”切切“什么？什么？2、用什么来、用什么来”接接“？”接接“什么？什么？3、”转转“入哪里？入哪里？4、怎样、怎样“增增”？5、怎样、怎样“检检”？第二页，本课件共有67页人工合成、酶切、人工合成、酶切、PCRPCR、文库、文库、cRNAcRNA重组产物重组产物目的基因目的基因克隆载体克隆载体连接连接重组重组DNADNA分子分子细菌中原核表达细菌中原核表达在植物中表达在植物中表达（转基因植物）（转基因植物）在酵母中在酵母中表达表达病毒中表达病毒

2、中表达分离纯化分离纯化上上游游技技术术下下游游技技术术酶切酶切酶酶切切转化转化感受态感受态宿主细胞宿主细胞目的基因被克隆目的基因被克隆增殖增殖构建其构建其表达载体表达载体转化感受态宿转化感受态宿主细胞主细胞PCRPCR和酶和酶切鉴定切鉴定SouthernSouthernNorthernNorthernWesternWestern 筛选筛选检测检测鉴定鉴定第三页，本课件共有67页操作单操作单元元操作对象操作对象所用工具或方所用工具或方法法切切载体载体目的基因目的基因工具酶工具酶接接载体载体目的基因目的基因工具酶工具酶转转转转目的基因目的基因入入受体细胞受体细胞（宿主细胞）（宿主细胞）物理或化学方

3、物理或化学方法法增增体内体体内体外外受体细胞受体细胞中的目的基因中的目的基因受体细胞的培受体细胞的培养养检检受体细胞受体细胞中的目的基因中的目的基因Southern工具酶工具酶载体载体目的基因目的基因受体受体四大四大要素要素第四页，本课件共有67页一、工具酶一、工具酶（一）（一）限制性限制性内切内切核酸酶核酸酶 P211、概念、概念 一类能识别双链一类能识别双链DNADNA中中特殊核苷酸特殊核苷酸序列，并在合适的反序列，并在合适的反应条件下使每条链应条件下使每条链一定位点一定位点上的磷酸二酯键断开，产生上的磷酸二酯键断开，产生具有具有3-OH3-OH和和5-P5-P基团的基团的DNADNA片段

4、的内切脱氧核糖核酸酶。片段的内切脱氧核糖核酸酶。限制与修饰系统：限制与修饰系统：限制（限制（Restriction）将侵入细菌体内的外源将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断切成小片断;修饰修饰（Modification）细菌自身的细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割身的限制性内切酶识别切割第五页，本课件共有67页第六页，本课件共有67页由由19731973年年H.O SmithH.O Smith和和D.NathansD.Nathans提议的命名系统提议的命名系统由三部分构成，即由三部分构成，即菌种名、菌系编号、

5、分离顺序菌种名、菌系编号、分离顺序。1 1、用酶源生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成、用酶源生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coliEscherichia coli）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae）用）用HinHin表示。表示。2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用

6、罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如EcoR I，EcoR V。命名原则？命名原则？P21第七页，本课件共有67页第八页，本课件共有67页目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶I 类限制性内切酶II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 限制与修饰系统的种类？限制与修饰系统的种类？P21第九页，本课件共有67页识别的长度切割的位点P22识别的结构2、限制性内切核酸酶识别序列、限制性内切核酸酶识别序列P21书写：以书写：以5 3”5 3”走向的单链走向的单链DNADNA核苷酸表示核苷酸表示左右互补第十页，本课件共有67页同裂酶：P22来源不同，来源不同，识别序列相同，识别序列相同，酶切位点相同

7、或不同。酶切位点相同或不同。第十一页，本课件共有67页 G A A T T CC T T A A GGC T T A A1 1、黏性末端：、黏性末端：被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（之间碱基正好互补配对。（55粘性和粘性和33粘性）粘性）A A T T C G3、切切割割方方式式P22第十二页，本课件共有67页第十三页，本课件共有67页第十四页，本课件共有67页同尾酶：同尾酶：P22P22内切酶切割的位点不同，但具有相同的黏性末端，这一组酶成为同尾酶。第十五页，本课件共有67页平

8、末端：平末端：第十六页，本课件共有67页4 4、应用、应用（1 1）限制酶切割位点提供了）限制酶切割位点提供了DNADNA物理图物理图谱的特异性标记谱的特异性标记（2 2）酶切产生的特异性片段可用分子克）酶切产生的特异性片段可用分子克隆的手段加以纯化隆的手段加以纯化（3 3）酶切产生的片段为各种各样的其他）酶切产生的片段为各种各样的其他DNADNA酶学操作提供了基本底物。酶学操作提供了基本底物。第十七页，本课件共有67页5 5、DNADNA末端长度对限制酶切割的影响末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割限制酶切割DNA时对识别序列两时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求端的非识别序列有长度的要

9、求对引物设计的指导：对引物设计的指导：在在引物末端加上一定数目的引物末端加上一定数目的碱基数目碱基数目体现内切的特征加尾操作第十八页，本课件共有67页(二二)DNA)DNA连接酶连接酶:P25:P25作用：可以把两种来源的作用：可以把两种来源的DNADNA（用同一种限制（用同一种限制 酶切割）的黏性末端黏合起来。（以下酶切割）的黏性末端黏合起来。（以下几种情况）几种情况）同裂酶，行不？P25失去了两种酶的识别序列酶的识别序列仍存在第十九页，本课件共有67页35磷酸二酯键磷酸二酯键第二十页，本课件共有67页两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端（2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末

10、端、齐平末端功用：DNA重组中促使载体与DNA连接第二十一页，本课件共有67页限制性内切酶限制性内切酶主要用于主要用于DNADNA分子的特异分子的特异切割（切割（“分子剪刀分子剪刀”或或“分子手术刀分子手术刀”“基因刀基因刀”之称之称）核酸连接酶核酸连接酶用于用于DNADNA和和RNARNA的连接的连接第二十二页，本课件共有67页（三）其它工具酶：（三）其它工具酶：1 1、甲基化酶：、甲基化酶：-来自细菌防御系统来自细菌防御系统甲基化对限制酶切的影响甲基化对限制酶切的影响（1 1）、修饰酶切位点）、修饰酶切位点-使本可被酶切的不受酶切使本可被酶切的不受酶切（2)2)、产生新的酶切位点使本不能被

11、酶切的、产生新的酶切位点使本不能被酶切的能被酶切能被酶切(3)(3)、对基因组作图的影响、对基因组作图的影响第二十三页，本课件共有67页2 2、DNADNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)(DNA polymerase)来自来自DNADNA复制系统复制系统催化催化DNADNA的合成活性（主要活性）：的合成活性（主要活性）：把把dNTPsdNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的 3OH 3OH端，端，催化核苷酸的聚合作用。（聚合酶的共催化核苷酸的聚合作用。（聚合酶的共同特点）同特点）其他活性（相辅助的活性）其他活性（相辅助的活性）第二十四页，本课件共有67页3、耐热耐热DNADNA

12、聚合酶聚合酶来源：来源：噬高温的细菌。噬高温的细菌。基本特性：基本特性：在高温下具有活性（在高温下具有活性（90-90-100100）用途：用途：主要用于主要用于PCRPCR第二十五页，本课件共有67页4、反转录酶（反转录酶（reverse reverse transcriptasetranscriptase）依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（以聚合酶（以RNARNA为模板）为模板）基本特性：基本特性：5 5 33合成合成DNADNA活性，但无活性，但无3 3 55外切酶活性外切酶活性主要用途：主要用途：cDNAcDNA克隆中合成第一条链克隆中合成第一条链/提取提取RNARNA反

13、反转录成转录成DNADNA，再，再PCRPCR（因为内含子的存在）（因为内含子的存在）转录酶-RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5-三磷酸合成RNA的酶。在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关第二十六页，本课件共有67页5、末端转移酶末端转移酶来源：小牛胸腺来源：小牛胸腺基本特性：不依赖于模板的基本特性：不依赖于模板的DNADNA聚合酶。聚合酶。应用：应用：P26P26平末端平末端粘性末端粘性末端第二十七页，本课件共有67页6 6、核酸外切酶、核酸外切酶exonuclease（与核酸内切酶相对应）一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水

14、解一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3 3、5-5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（产物是单个的核苷酸（DNADNA为为dNTPdNTP，RNARNA为为NTPNTP）。）。（作用于（作用于DNADNA或或RNARNA）第二十八页，本课件共有67页单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶能够从能够从5-5-末端或末端或3-3-末端呈单链状态的末端呈单链状态的DNADNA分子上降解分子上降解DNADNA，产生出，产生出寡核苷酸寡核苷酸短短片段，而且是唯一不需要片段，而且是唯一不需要Mg2+Mg2

15、+离子的离子的活性活性酶酶，是一种耐受性很强的，是一种耐受性很强的核酸酶核酸酶。可以用来测定基因组可以用来测定基因组DNA中一些特中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的只切割末端有单链突出的DNA分子。分子。主要的催化活性是催化双链主要的催化活性是催化双链DNADNA按按3535的方向从的方向从3-OH3-OH末端末端释放释放5-5-单核苷酸。单核苷酸。第二十九页，本课件共有67页基因工程应用：基因工程应用：P26P26粘性末端粘性末端平末端平末端第三十页，本课件共有67页7 7、碱性磷酸酯酶：、碱性磷酸酯酶：alkaline phosp

16、hatasealkaline phosphatase最适最适pHpH在在7.07.0以上，催化各种磷酸单酯键以上，催化各种磷酸单酯键水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖的酶，也可以催化磷酸基团的转酚或糖的酶，也可以催化磷酸基团的转移反应，但不能水解磷酸二酯键。移反应，但不能水解磷酸二酯键。应用：应用：P26 P26 第三十一页，本课件共有67页8 8、RNARNA酶酶RNaseRNase：RNaseRNase的特点：的特点：抗酸抗碱抗酸抗碱,具很广具很广pHpH作用范围作用范围抗高温严寒抗高温严寒(065(065均具活性，均具活性，100100也不能使之完

17、全失活）也不能使之完全失活）抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）又可恢复活性）酶活性不需要辅助因子酶活性不需要辅助因子存在范围广存在范围广 第三十二页，本课件共有67页总之总之限制性内切酶限制性内切酶主要用于主要用于DNADNA分子的特异切割分子的特异切割 DNADNA甲基化酶甲基化酶用于用于DNADNA分子的甲基化分子的甲基化 核酸外切酶核酸外切酶用于用于DNADNA和和RNARNA的非特异性切割的非特异性切割 核酸聚合酶核酸聚合酶用于用于DNADNA和和RNARNA的合成的合成 核酸连接酶核酸连接酶用于用于DNADNA和

18、和RNARNA的连接的连接 核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于用于DNADNA和和RNARNA的末端修饰的末端修饰 RNA RNA酶酶-分解分解RNARNA其其它它酶酶类类-用用于于生生物物细细胞胞的的破破壁壁，转转化化，核核酸酸纯纯化化，检测等检测等第三十三页，本课件共有67页1 1、载体：、载体：将将外源外源DNADNA或基因或基因携带入携带入适当适当宿宿主细胞（主细胞（host cellhost cell）的工具。）的工具。二、基因克隆载体二、基因克隆载体P27P27第三十四页，本课件共有67页2、载体的种类、载体的种类克隆载体：克隆载体：携带重组携带重组DNADNA进入在宿主细胞内进行大

19、量复制进入在宿主细胞内进行大量复制 形成大量形成大量的基因克隆。的基因克隆。被克隆的基因不一定会表达被克隆的基因不一定会表达 但一定被大量复制但一定被大量复制 质粒载体质粒载体复制起点来自一些天然质粒。复制起点来自一些天然质粒。噬菌体载体噬菌体载体，P1P1和和M13M13、fdfd载体，复制起点来自噬菌体。载体，复制起点来自噬菌体。人工染色体载体人工染色体载体P33P33：大大DNADNA片段克隆载体片段克隆载体 表达载体：表达载体：使目的基因表达，生产出我们需要的产物。使目的基因表达，生产出我们需要的产物。第三十五页，本课件共有67页2 2、载体具备的条件载体具备的条件l 具有较高的拷贝数

20、染色体复制起点染色体复制起点染色体外复制起点染色体外复制起点质粒质粒复制起点具种复制起点具种的特异性的特异性分子量过大分子量过大可转移性低可转移性低利于载体的制备利于载体的制备以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞或筛选作用多克隆多克隆位点位点第三十六页，本课件共有67页(掌握质粒载体，了解病毒克隆载体、人工染色体载掌握质粒载体，了解病毒克隆载体、人工染色体载体体P28-35)你对天然质粒了解多少？你对天然质粒了解多少？第三十七页，本课件共有67页（1 1）可转移性）可转移性F质粒：F因子或性因子R质粒：抗药性因子Col质粒：大肠杆菌素因子第三十八页，本课件共有67页（2 2）自主复制性）

21、自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系第三十九页，本课件共有67页（3 3）质粒的拷贝数）质粒的拷贝数根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒：严紧型复制控制的质粒：1-3 1-3 拷贝，属低拷贝型，受拷贝，属低拷贝型，受宿主染色体基因控制宿主染色体基因控制松弛型复制控制的质粒：松弛型复制控制的质粒：10-60 10-60 拷

22、贝，属高拷贝拷贝，属高拷贝型，受宿主染色体基因控制较弱型，受宿主染色体基因控制较弱第四十页，本课件共有67页（4）标记基因）标记基因A A、选择标记基因、选择标记基因用于鉴别、指示目的用于鉴别、指示目的DNADNA（载体）是否（载体）是否进入了宿主细胞（有可能是空载）进入了宿主细胞（有可能是空载）P2745 。抗生素抗性基因，使用最广泛。抗生素抗性基因，使用最广泛。a.a.氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（AmpAmpr r）杀杀菌菌剂剂，AmpicillinAmpicillin可可抑抑制制细细菌菌细细胞胞膜膜上上参参与与细细胞胞壁壁合合成成酶酶类的活性，干扰细胞分裂，杀死细胞。类的活性

23、，干扰细胞分裂，杀死细胞。AmpAmpr r抗抗性性基基因因编编码码一一种种分分泌泌到到细细菌菌细细胞胞周周间间质质的的酶酶，催催化化内内酰酰胺胺环的水解，使氨苄青霉素失活。环的水解，使氨苄青霉素失活。第四十一页，本课件共有67页b.b.四环素抗性基因（四环素抗性基因（TetTetr r）抑抑菌菌剂剂，Tetracycline Tetracycline 可可结结合合在在核核糖糖体体30s30s亚亚基基中中的的一一种种蛋蛋白白质质分分子子上上，抑抑制制核核糖糖体体的的转转位位过过程程。抑抑制制细细胞胞蛋蛋白白质合成，细胞停止生长。质合成，细胞停止生长。四环素抗性基因编码一种四环素抗性基因编码一种

24、399 AAs399 AAs蛋白质，与细菌细胞蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。第四十二页，本课件共有67页c.c.氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（CmCmr r）抑抑菌菌剂剂，ChlorophenicolChlorophenicol可可结结合合在在核核糖糖体体50 50 S S亚基上，阻止蛋白质合成。亚基上，阻止蛋白质合成。Cm Cmr r基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。第四十三页，本课件共有67页d.d.卡那

25、霉素卡那霉素(Kan(Kanr r)、新霉素新霉素(Neo(Neor r)、G418G418抗性基抗性基因因(G418(G418r r)杀杀菌菌剂剂，KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均均属属脱脱氧氧链链霉霉胺胺氨氨基基葡葡萄萄糖糖苷苷类类抗抗生生素素，可可结结合合在在核核糖糖体体上上，导致导致mRNAmRNA发生错读。发生错读。来来自自转转座座子子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗抗性性基基因因均均可可使使这这类类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。第四十四页，本课件共有67页B

26、 B、筛选标记基因（检测性标记基因）、筛选标记基因（检测性标记基因）用于指示外源用于指示外源DNADNA分子是否插入载体分子分子是否插入载体分子形成了重组子（思考：空载是否生长的形成了重组子（思考：空载是否生长的问题？）。问题？）。P27/47P27/47第四十五页，本课件共有67页（1）lac Z标记基因-互补：互补：lac Z基因上缺失近操纵基因区段（见下图）（见下图）的突变体与带有完整的近操纵基因区段的半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。半乳糖苷酶基因编码半乳糖苷酶基因编码10211021个个 氨基酸氨基酸 其氨基末端称为其氨基末端称为链，羧基末端称为链，羧基末端称为链链 链负责将链负责

27、将链装配为四聚体链装配为四聚体 单独的单独的链不具酶活性，只有在链不具酶活性，只有在链的帮链的帮助下组装成助下组装成44才具有酶活性才具有酶活性-互补作互补作用用 为为链编码的基因称之为链编码的基因称之为lacZ(lacZ(编码编码146 146 AAs)AAs)载体：许多载体都具有一段大肠杆菌载体：许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及半乳糖苷酶的启动子及其编码其编码肽链（氨基端）的肽链（氨基端）的DNADNA序列序列lacZlacZ基因。基因。肽链即肽链即是是半乳糖苷酶氨基端的短片段半乳糖苷酶氨基端的短片段宿主细胞：含有可编码宿主细胞：含有可编码肽链（肽链（N N端）的端）的DNA

28、DNA序列序列lacZlacZ基因基因+肽链肽链+肽链肽链 半乳糖苷半乳糖苷酶有活性酶有活性IPTG/x-gal蓝色菌斑重组载体重组载体+宿宿主细胞主细胞无肽链，仅肽链，仅肽链肽链 半乳糖苷半乳糖苷酶无活性酶无活性IPTG/x-gal白色白色菌斑菌斑载体转入宿主细胞后第四十六页，本课件共有67页调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAMP复合物复合物mRNAmRNA+-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰半乳糖苷乙酰基转移酶酶基转移酶酶第四十七页，本课件共有67页第四十八页，本课件共有67页第四十

29、九页，本课件共有67页第五十页，本课件共有67页外源基因外源基因抗Amp抗Tet抗抗AmpAmp抗抗AmpAmp抗抗TetTet抗抗TetTet重组重组DNADNA空载体空载体不含有载体或不含有载体或重组重组DNADNA第五十一页，本课件共有67页筛筛选选重重组组子子的的示示意意图图怎样得到含重组子的怎样得到含重组子的菌？菌？第五十二页，本课件共有67页Amp rTet rTet rAmp sPstI.涂布有涂布有Tet的培养基的培养基涂布有涂布有Amp的培养基的培养基.重组体的筛选重组体的筛选外源基因的插入：外源基因的插入：.第五十三页，本课件共有67页3、葡萄糖苷酸酶基因（GUS）许多生物

30、中没有许多生物中没有GUSGUS基因，基因，95%的大肠杆菌具有的大肠杆菌具有GUSGUS基因基因。GUS基因作为载体的标记基因，可将底物X-Gluc（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡萄糖苷）葡萄糖苷）降解为兰色产物。应用：A.A.用于快速检测植物中用于快速检测植物中GUSGUS基因融合标记。检测本底没有基因融合标记。检测本底没有GUSGUS基因的生物（植物），重组子转入植物后，载体上的基因的生物（植物），重组子转入植物后，载体上的GUSGUS基基因产生的葡萄糖苷酸酶能将加入的底物因产生的葡萄糖苷酸酶能将加入的底物X-GlucX-Gluc降解为兰色产物，降解为兰色产物，而对照没有。而对

31、照没有。B.B.用用X-GlucX-Gluc这种发色底物的培养基可以检测以及这种发色底物的培养基可以检测以及定量食品样本如肉、奶制品以及贝类中的大肠杆菌数量。国际定量食品样本如肉、奶制品以及贝类中的大肠杆菌数量。国际上普遍采用该产品取代传统方法以精确检测饮用水中的大肠杆上普遍采用该产品取代传统方法以精确检测饮用水中的大肠杆菌数量，该方法大大降低了假阳性和假阴性。菌数量，该方法大大降低了假阳性和假阴性。第五十四页，本课件共有67页总之，一个克隆载体至少有一个以上的总之，一个克隆载体至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一个用克隆位点和两个标记基因，其中一个用于转化体（重组子和空载）选择，一

32、个于转化体（重组子和空载）选择，一个用于重组子检测。用于重组子检测。第五十五页，本课件共有67页3、载体的功能、载体的功能运送外源基因运送外源基因高效高效转入受体细胞转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的为外源基因的扩增或表达扩增或表达提供必要的条件提供必要的条件第五十六页，本课件共有67页质粒载体的一般特征质粒载体的一般特征染色体DNA质粒DNA大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞第五十七页，本课件共有67页第五十八页，本课件共有67页4 4、质粒的改造构建、质粒的改造构建删除非必需区：删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外源减小质粒的分子量，提高外源D

33、NADNA的装载量的装载量(一般来说，大于一般来说，大于20kb20kb的质粒很难的质粒很难导入受体细胞导入受体细胞)加入新的遗传标记基因。加入新的遗传标记基因。引入具有多种限制酶识别及切割位点的引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNADNA序列：序列：即多克隆位点即多克隆位点(multiple cloning sites(multiple cloning sites，MCS)MCS)。插入特殊的基因表达调控序列。插入特殊的基因表达调控序列。第五十九页，本课件共有67页第六十页，本课件共有67页由由pBR322pBR322与与M13M13噬菌体改建而成噬菌体改建而成分子量分子量更小更小拷贝数拷

34、贝数增加增加哪两个标记基因？第六十一页，本课件共有67页其它载体：其它载体：病毒（噬菌体载体）病毒（噬菌体载体）P30P30，P1P1和和M13M13、fdfd载载体，复制起点来自噬菌体体，复制起点来自噬菌体 COSCOS质粒载体质粒载体质粒载体中插入质粒载体中插入coscos片段，片段，以利于体外包装以利于体外包装 噬菌粒载体噬菌粒载体（phagemidphagemid）有质粒和有质粒和M13M13、fdfd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制人工染色体载体人工染色体载体大大DNADNA片段克隆载体片段克隆载体P33P33体内同源重组整合载体体内同源重组整合载

35、体-P35-P35第六十二页，本课件共有67页三、目的基因三、目的基因（一）定义：（一）定义：目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或特定基因或DNADNA片段，能编码某一产物或某一性状。片段，能编码某一产物或某一性状。-基因基因的编码区、也可是包含启动子和终止子的功能基因、完整的编码区、也可是包含启动子和终止子的功能基因、完整的操纵子、几个操纵子聚集的基因簇、启动子或终止子元的操纵子、几个操纵子聚集的基因簇、启动子或终止子元件件（二）来源（二）来源 ：来源于各种生物，其中主要是真核生物如来源于各种生物，其中主要是真核生物如

36、 人和动物。人和动物。第六十三页，本课件共有67页（三）目的基因获得途径（三）目的基因获得途径1 1 酶切法酶切法2 PCR2 PCR扩增扩增DNADNA前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物设计引物 3 3 化学合成目的基因化学合成目的基因-（方法：不要求）（方法：不要求）DNADNA片段很长片段很长 第六十四页，本课件共有67页4 4、通过构建基因文库或、通过构建基因文库或cDNAcDNA文库分离目的基因文库分离目的基因基因文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆基因文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌克

37、隆子群体中，这个群体即为这载体储存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。种生物的基因组文库。cDNAcDNA文库：某种生物基因组转录的全部文库：某种生物基因组转录的全部mRNAmRNA经反转录产生的经反转录产生的各种各种cDNAcDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为子群体之中，这样的群体称为cDNAcDNA文库文库第六十五页，本课件共有67页四、受体细胞四、受体细胞1 1、含义、含义 所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源源DNA

38、DNA（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。是有应用价值和理论研究价值的细胞。2 2、种类：、种类：原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是原核生物细但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是原核生物细胞。胞。第六十六页，本课件共有67页原因：原因：大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNADNA的进入的进入 没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNADNA没有固定结合的蛋白质，这为外源没有固定结合的蛋白质，这为外源DNADNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNADNA重组减少麻烦重组减少麻烦 基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析 原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料并且原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快第六十七页，本课件共有67页