质粒的提取及检测精.ppt

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1、质粒的提取及检测第1页，本讲稿共29页质粒质粒（plasmid）是染色体外小型（是染色体外小型（1-200kb1-200kb）的）的共价、闭合、环状的共价、闭合、环状的双链双链DNADNA分子（分子（cccDNAcccDNA），），能自主复制并能稳定遗传能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等酶等 质粒的复制：严紧型复制（质粒的复制：严紧型复制（1 1 n n个）个）松弛型复制（松弛型复制（2020个以上）个以

2、上）第2页，本讲稿共29页常用的质粒载体是通过是通过DNADNA重组技术构建而成的。重组技术构建而成的。pUC18,pUC19(500pUC18,pUC19(500700700第3页，本讲稿共29页AmpAmpr r抗抗性性基基因因编编码码一一种种周周质质酶酶（-内内酰酰胺胺酶酶）可可特特异异地地切切割割AmpAmp的的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力内酰胺环，从而使其失去杀菌能力第4页，本讲稿共29页提纯的思路提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNADNA要去除的物质：要去除的物质：蛋白蛋白基因组基因组DNADNA脂类及小分子杂质脂类及小分

3、子杂质RNARNA 第5页，本讲稿共29页质粒的检测质粒的检测凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第6页，本讲稿共29页第一部分质粒DNA的提取第7页，本讲稿共29页一、实验目的一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。第8页，本讲稿共29页二、实验原理二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性扑学上的差异来分离它们，在碱性P PH H，DNADNA变性，恢复中性时，变性，恢复中性时，线性染色体线性染色体DNADNA不能准确复性，与

4、其它大分子共沉淀，而质粒不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNADNA却可以准确复性，留在上清中。却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNADNA分子相对较小和共价闭分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。线形、开环、闭环超螺旋。第9页，本讲稿共29页三、实验材料、器具及药品实验材料、器具及药品 v实验器具实

5、验器具微量取液器(20l,200l,1000l)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器。v实验材料实验材料含PUCm-T的E.coli DH5菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。第10页，本讲稿共29页v实验药品实验药品1.LB培养基配制及分装培养基配制及分装(每升用量每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g酵母提取物(Bacto-yeast extract)5gNaCl 10gpH 7.5121，20min 高压灭菌 第11页，本讲稿共29页2.溶液溶液 溶液溶液 200ml50mmol/L 葡萄糖 1.98g 25

6、mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)5ml 1M 10mmol/L EDTA(pH 8.0)5ml 0.4M 溶液溶液0.4mol/L NaOH 2%SDS临用前1:1混合贮存液即为II液.溶液溶液5mol/L 醋酸钾 60ml冰醋酸 11.5ml水 28.5ml(最终最终pH4.8)第12页，本讲稿共29页3.分离液分离液酚/氯仿/异戊醇25:24:14.无水乙醇无水乙醇5.70%乙醇乙醇6.无菌水无菌水第13页，本讲稿共29页各试剂的作用：各试剂的作用：溶液溶液I I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液溶液IIII作用：细胞壁肽聚糖碱

7、性下水解，核酸和蛋白质变性。作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液溶液IIIIII作用：酸性下质粒作用：酸性下质粒DNADNA复性，变性蛋白复性，变性蛋白SDSSDS线性线性DNADNA沉淀，沉淀，K K可中和可中和DNADNA第14页，本讲稿共29页平衡酚：氯仿：异戊醇（平衡酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚衡酚pH7.8pH7.8（酸性下（酸性下DNADNA分配于有机相，酚的密度大），可使分配于有机相，酚的密度大），可使DNADNA在在上清中。异戊醇有助

8、于消除抽提过程中出现的泡沫）上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去无水乙醇：除去DNADNA水化层，使水化层，使DNADNA沉淀沉淀TETE缓冲液：溶解缓冲液：溶解DNADNA第15页，本讲稿共29页四、实验步骤四、实验步骤接含接含PUC18(PUC18(或或pET21a)pET21a)质粒的单菌落于质粒的单菌落于3 3ml LB Ampml LB Amp+液体培养基中液体培养基中37370 0C C，190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取1.5菌液入菌液入1.5ml的的do

9、rf管中管中 60006000rpmrpm、离心离心2 2minmin，弃上清，收集菌体弃上清，收集菌体100100uLuL溶液溶液I I悬浮菌体（悬浮菌体（充分振荡充分振荡），室温（或冰浴），室温（或冰浴）1010minmin加入加入200200uLuL溶液溶液IIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置5 5minmin裂解菌体裂解菌体第16页，本讲稿共29页加入加入150150uLuL溶液溶液IIIIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置1515minmin质粒质粒DNADNA复性复性1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin，取上清记录体积到一新管取上

10、清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀振荡混匀）1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin，取上清记录体积到一新管取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀振荡混匀）1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin，取上清记录体积到一新管取上清记录体积到一新管上清加上清加2 2倍体积的无水乙醇（倍体积的无水乙醇（充分混匀充分混匀），冰浴），冰浴 30min 30min第17页，本讲稿共29页1200012000rpmrpm，离心离心1515minm

11、in沉淀用沉淀用75%75%乙醇乙醇1 1mLmL洗涤两次（洗涤两次（振荡混匀、离心振荡混匀、离心）1200012000rpmrpm，离心离心1010minmin沉淀超净台中风干沉淀超净台中风干沉淀用沉淀用2020uL RTEuL RTE溶解，溶解，-20-200 0C C保存保存第18页，本讲稿共29页第二部分琼脂糖凝胶电泳第二部分琼脂糖凝胶电泳第19页，本讲稿共29页相关知识相关知识电泳：泳动速度决定于？电泳：泳动速度决定于？琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（天然琼脂（AgarAgar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose Agarose，约占，约占8080

12、）及琼脂胶（）及琼脂胶（AgaropectinAgaropectin）组成。琼脂糖是由半）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板因此，目前多用琼脂糖为电泳

13、支持物进行平板电泳。电泳。第20页，本讲稿共29页核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb 5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3第21页，本讲稿共29页核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型不同构型DNADNA的移动速度次序为：的移动速度次序为：共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线）直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条链发生断裂）开环的双链环状条链发生断裂）开环的双链环状DN

14、ADNA（ocDNAocDNA，1 1条条链发生断裂）链发生断裂）。第22页，本讲稿共29页影响迁移率的因素影响迁移率的因素DNADNA分分子子的的大大小小、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的浓浓度度、DNADNA的的构构象象、所所加加电电压压 一般一般5V/cm5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。第23页，本讲稿共29页常用染料常用染料EB:EB:溴溴化化乙乙锭锭（3 3，8-8-二二氨氨基基-5-5-乙乙基基-6-6-苯苯基基菲菲啶啶溴溴盐盐EthidiumEthidiumBromideBromide，EBEB），EBEB能能插插入入

15、DNADNA分分子子碱碱基基对对之之间间，导导致致EBEB与与DNADNA结结合合。DNADNA吸吸收收的的260nm260nm的的紫紫外外光光传传递递给给EBEB，或或者者结结合合的的EBEB本本身身在在300300和和360360吸吸收收的的射射线线，均均可可在在可可见见光光区区以以590590波波长长发发射射出出来来，呈呈橙红色。橙红色。EBEB染染料料优优点点：染染色色操操作作简简便便，快快速速，室室温温下下15-20min15-20min；不不会会使使核核酸酸断断裂裂；灵灵敏敏度度高高，10ng10ng或或更更少少的的DNADNA即即可可检检出出；可可以以加加到到样样品中可胶中。品中

16、可胶中。EBEB是是诱诱变变剂剂，使使用用时时一一定定要要戴戴手手套套。EBEB废废液液要要经经过过处处理理才才能丢弃。能丢弃。SYBR:SYBR:新新型型低低毒毒，高高灵灵敏敏度度染染料料，加加入入样样 品品中中，价价格格较较昂昂贵。贵。Gene finder:Gene finder:新型低毒，高灵敏度染料，加入样胶中，价格较低。新型低毒，高灵敏度染料，加入样胶中，价格较低。第24页，本讲稿共29页一、实验目的一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA的方法和技术。的方法和技术。第25页，本讲稿共29页二、实验原理二、实验原理 DNADNA在琼脂

17、糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在核酸为两性分子，在PH3.5PH3.5时，整个分子带正电；时，整个分子带正电；P PH8H8左右时，碱基几乎不左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。解离，整个分子带负电。在碱性环境下，相同碱基数量的双链在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNADNA几乎具有等量的净负电荷，能以几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNADNA片段泳动速度不片段泳动速度不一样，可进行分离。一样，可进行分离。DNADNA分子的迁

18、移速度与相对分子质量的对数值成反比分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。分子。共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线）直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条链发生断裂）开条链发生断裂）开环的双链环状环的双链环状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发生断裂）。条链发生断裂）。第26页，本讲稿共29页三、仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂（一）（一）仪器仪器（二）材料（二）材料1.1.自

19、已提取的质粒自已提取的质粒DNADNA2.2.相对分子质量标准品相对分子质量标准品（三）试剂（三）试剂 1 15 TBE5 TBE储液储液(P PH8.0)H8.0)使用时稀释使用时稀释 1010倍成倍成0.5TBE 0.5TBE（1TBE1TBE也可）。也可）。2 2凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液0.2%0.2%溴酚蓝，溴酚蓝，50%50%蔗糖蔗糖 3.3.琼脂糖琼脂糖 4.10mg/ml4.10mg/ml溴化乙锭溶液（溴化乙锭溶液（EBEB），），44保存。用时稀释成保存。用时稀释成5ug/ml5ug/ml的的EBEB。第27页，本讲稿共29页四、实验操作步骤四、实验操作步骤 琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）.凝胶板的制备凝胶板的制备 加样（加样体积在加样（加样体积在1010 30ul30ul）电电泳泳 染色染色结结果果观观察察 第28页，本讲稿共29页五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论根据观察结果，绘图。根据观察结果，绘图。分析自提质粒的情况。分析自提质粒的情况。第29页，本讲稿共29页