真核细胞DNA提取与酶切鉴定-liuchang培训讲学.ppt

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1、真核细胞DNA提取与酶切鉴定-liuchang Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望生化实验内容安排生化实验内容安排实验室实验室实实 验验 内内 容容一一实验实验1616：DEAEDEAE纤维素离子交换层析纤维素离子交换层析二二实验实验1717：血清：血清-球蛋白的提纯球蛋白的提纯实验实验8 8：醋酸纤维素薄膜电泳：醋酸纤维素薄膜电泳三三实验实验9 9：聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳四四实验实验3 3：测定蛋白质的比色分析法：测定蛋白质的比色分析

2、法实验实验1212：血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳：血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳五五实验实验1818：真核基因组：真核基因组DNADNA的分离提取的分离提取六六实验实验7 7：酶促反应动力学实验：酶促反应动力学实验第一轮第二轮：考试（6个实验室）实验本身:实验室规则:时间、穿着、仪器不能乱动、赔偿制度、整洁、卫生。实验报告（如实记录）规范操作（辨认标签）、污染物、毒物、废弃物（酸碱烧伤大量自来水冲洗）l实验 实验报告要求：实验报告要求：题目，组号题目，组号实验目的实验目的实验原理实验原理实验操作：如实记录实验操作：如实记录实验结果及结果分析：实事求是实验结果及结果分析：实事求是讨论或小结：认真分析，

3、仔细思考讨论或小结：认真分析，仔细思考2022/12/65真真核核细细胞胞基基因因组组DNA的的分分离离提提取取及及酶酶切切电电泳泳 实验目的实验目的1.1.掌握人外周血基因组掌握人外周血基因组DNADNA的提取原理、原的提取原理、原 则、提取方法和注意事项，熟悉外源基因则、提取方法和注意事项，熟悉外源基因 的基本制备方法。的基本制备方法。2.2.学习琼脂糖凝胶电泳分离鉴定学习琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNADNA的原理的原理 和技术。和技术。n基因组基因组DNADNA提取的操作流程提取的操作流程 实验步骤实验步骤、取、取0.3ml0.3ml抗凝全血，加入到抗凝全血，加入到1.5ml 1.5ml

4、Eppendorf Eppendorf 离心管中。离心管中。n 抗凝剂抗凝剂 EDTA-NaEDTA-Na2 2或枸橼酸钠作为抗凝剂或枸橼酸钠作为抗凝剂 不宜使用肝素不宜使用肝素 、加入、加入1ml STMT1ml STMT，充分混匀，充分混匀 使其溶血使其溶血。nSTMT（破坏细胞膜（破坏细胞膜)葡萄糖：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止葡萄糖：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNADNA受机械作受机械作 用而降解。用而降解。TrisTrisHCl:HCl:不含金属离子不含金属离子,与与EDTAEDTA更能稳定更能稳定DNADNA的活性。的活性。Triton X-100:Triton X-100:非离

5、子去污剂（表面活性剂），直接破裂非离子去污剂（表面活性剂），直接破裂 血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及 细胞核。细胞核。MgClMgCl2 2:提供提供MgMg2+2+，稳定，稳定DNADNA。、10000g10000g离心离心2min2min，弃上清，弃上清。n注意离心机的使用注意离心机的使用 配平配平 上清丢弃到废液缸，尽量空净。上清丢弃到废液缸，尽量空净。4 4、用、用0.4ml0.4ml生理盐水洗沉淀，生理盐水洗沉淀，10000g10000g 离心离心2min2min，弃上清。，弃上清。n注意离心机的使用注意离心机的使用 配平配平 上清丢弃到废液

6、缸，尽量空净。上清丢弃到废液缸，尽量空净。、加、加450lNE450lNE溶液将沉淀重新悬浮。溶液将沉淀重新悬浮。nNENaCL:50mmol/L NaCL:50mmol/L EDTA:1.EDTA:1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2.2.降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性、加、加50l 10%SDS50l 10%SDS，迅速混匀，迅速混匀;再加再加50l50l蛋蛋 白酶白酶K K，轻轻摇匀后置，轻轻摇匀后置5050水浴水浴1h1h。nSDSSDS 1.1.溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂2.2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核

7、酸释放出来溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来3.3.对对RNARNA、DNADNA酶有抑制作用酶有抑制作用4.4.与蛋白质形成与蛋白质形成R-O-SO3 R-O-SO3.R.R蛋白质复合物，使蛋白质变性蛋白质复合物，使蛋白质变性n蛋白酶蛋白酶K(K(或链霉蛋白酶或链霉蛋白酶)广谱蛋白酶，水解蛋白质。能在广谱蛋白酶，水解蛋白质。能在SDSSDS和和EDTAEDTA的存在下保的存在下保持很高的活性。持很高的活性。、加入、加入TETE饱合酚饱合酚500l500l，轻摇，轻摇2min2min，10000g10000g离心离心 1min1min，将上层水相移至另一新，将上层水相移至另一新Eppe

8、ndorfEppendorf管内。管内。n酚能有效地使蛋白质变性；酚能有效地使蛋白质变性；n酚不能抑制酚不能抑制RNAaseRNAase的活性；的活性；n酚能溶解入酚能溶解入1010一一1515的水分。的水分。、加入、加入酚氯仿异戊醇酚氯仿异戊醇混合液混合液500l500l，轻摇，轻摇 1min1min，10000g10000g离心离心1min1min，将上层水相移至另，将上层水相移至另 一一EppendorfEppendorf管内。管内。n氯仿也是一种蛋白变性剂，但氯仿的变性作用氯仿也是一种蛋白变性剂，但氯仿的变性作用不如酚。不如酚。n氯仿有助于加速有机相和水相的分离；氯仿有助于加速有机相和

9、水相的分离；n使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一一种有机溶剂效果好。酚和氯仿两者交替反复一种有机溶剂效果好。酚和氯仿两者交替反复抽提，还可克服酚的缺点。抽提，还可克服酚的缺点。、加入、加入氯仿异戊醇氯仿异戊醇混合液混合液500l500l，轻摇，轻摇 1min1min，10000g10000g离心离心1min1min，将上层水相移至另，将上层水相移至另 一新一新EppendorfEppendorf管内。管内。（定体积）（定体积）n移上清时要定量，宁少勿多移上清时要定量，宁少勿多n氯仿：氯仿：将残留在水相中的酚带走将残留在水相中的酚带走 也可以再次使蛋

10、白变性也可以再次使蛋白变性n异戊醇：异戊醇：降低分子表面张力，减少气泡产生降低分子表面张力，减少气泡产生 有助于分层有助于分层 上层为水相上层为水相 中间为变性的蛋白中间为变性的蛋白 下层为有机相下层为有机相1010、向上清中加入、向上清中加入1/101/10体积的体积的NaAc NaAc，并混匀。，并混匀。再加入再加入2 2倍体积的冰冻无水乙醇，充分混匀，倍体积的冰冻无水乙醇，充分混匀，于于8080放置放置10min10min。n核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，能与钠、钾、核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，能与钠、钾、镁等很多镁等很多1 1价、价、2 2价阳离子形成盐类而沉淀，在许价阳离子形成

11、盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。n最常用的沉淀剂为最常用的沉淀剂为1 1价钠、钾、铵和锂等离子盐类，价钠、钾、铵和锂等离子盐类，如醋酸钠、氯化钠等。如醋酸钠、氯化钠等。n常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。1111、10,000g10,000g离心离心5min5min，弃上清，弃上清,将小将小 管倒置于滤纸上。室温干燥管倒置于滤纸上。室温干燥5min5min。1212、加入、加入20l20l双蒸水溶解基因组双蒸水溶解基因组DNA DNA。基因组基因组DNA 8lDNA 8l10 X 10

12、 X 缓冲液缓冲液 1l 1l EcoR 1l EcoR 1l 离心甩一下，离心甩一下，3737温浴温浴1h1h。另外剩余的另外剩余的10l10l留做电泳分析用。留做电泳分析用。酶切酶切体系体系 酶切注意事项酶切注意事项n按顺序加样，每加一个样品更换一次按顺序加样，每加一个样品更换一次tiptip头头n一定要将酶加进去一定要将酶加进去n加酶的时候一定保证低温，在冰上操作加酶的时候一定保证低温，在冰上操作n加完后要充分混匀，用离心机加完后要充分混匀，用离心机“甩甩”一下再水一下再水浴（配平后，随意调时间，将转速调到接近最浴（配平后，随意调时间，将转速调到接近最大值，即刻再调回零）大值，即刻再调回

13、零）1313、1 1琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测n10L 10L 酶切后基因组酶切后基因组DNADNA 2L 10Loading buffer 2L 10Loading buffern12L12L基因组基因组DNADNA 2L 10Loading buffer 2L 10Loading buffern1TBE 1TBE 恒压恒压100V 100V 电泳电泳 0.5-1h0.5-1h 实验原理实验原理核酸：包括核酸：包括DNADNA、RNARNA两种分子。两种分子。DNADNA RNA RNA多呈单链线性分子多呈单链线性分子双链线性分子双链线性分子双链环状分子双链环状分子 真核生物真核生

14、物DNADNA95%95%存在于细胞核存在于细胞核5%5%存在于细胞器存在于细胞器真核生物真核生物RNARNA10%10%存在于细胞核存在于细胞核15%15%存在于细胞器存在于细胞器75%75%存在于细胞质存在于细胞质 分离纯化核酸总的原则分离纯化核酸总的原则n应保证核酸一级结构的完整性应保证核酸一级结构的完整性n排除其它分子的污染排除其它分子的污染 完整性的保证完整性的保证n尽量简化操作步骤，缩短提取过程尽量简化操作步骤，缩短提取过程n减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解n减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解 如机械剪切力、高温如机械剪切力、高温n防止核酸的生物降解防

15、止核酸的生物降解 DNADNA酶、酶、RNARNA酶酶 纯度的保证纯度的保证n核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子剂和过高浓度的金属离子n其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度污染应降低到最低程度n排除其它核酸分子的污染排除其它核酸分子的污染 从全血中制备基因组从全血中制备基因组DNADNAn首先用去污剂首先用去污剂TritonX-100TritonX-100直接破裂红细胞和白细胞膜，直接破裂红细胞和白细胞膜，使之释放出血红蛋白及细胞核，通过离心分离即可获得白使之释放

16、出血红蛋白及细胞核，通过离心分离即可获得白细胞核；细胞核；n用用SDSSDS破坏核膜；用破坏核膜；用EDTAEDTA抑制抑制DNaseDNase的活性；蛋白酶的活性；蛋白酶K K将蛋将蛋白质降解成小肽或氨基酸，从而使白质降解成小肽或氨基酸，从而使DNADNA释放入水相中。释放入水相中。n用酚氯仿抽提除去蛋白质，再用氯仿除去用酚氯仿抽提除去蛋白质，再用氯仿除去DNADNA溶液中残溶液中残存的蛋白质及酚；存的蛋白质及酚；n用无水乙醇沉淀水相中的用无水乙醇沉淀水相中的DNADNA，即可获得基因组，即可获得基因组DNADNA。nConcise process：破裂细胞破裂细胞消化蛋白质消化蛋白质有有机

17、抽提除去蛋白质机抽提除去蛋白质沉淀水相中的沉淀水相中的DNA。DNADNA抽提示意图抽提示意图 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶是是识识别别DNADNA的的特特异异序序列列,并并在识别位点或其周围切割双链在识别位点或其周围切割双链DNADNA的一类的一类内切酶内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HMolecular scissor 均来自微生物，并据此而进行命名；均来自微生物，并据此而进行命名；识别序列长度识别序列长度常为常为4 4 8 8 核苷酸序列核苷酸序列 ;大部分酶识别序列呈二元旋转对称结构大部分酶识别序列呈二元旋转对称结

18、构 即即回文结构回文结构 ;其切割后的其切割后的DNADNA可产生不同的末端。可产生不同的末端。限制酶的特点（限制酶的特点（类酶）类酶）DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 n琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合链线性分子。链线性分子。n线性线性DNADNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比反比 nDNADNA的空间构型不同，即使分子量相同其迁移率也不的空间构型不同，即使分子量相同其迁移率也不相同相同 Making an Agarose GelCasting tray Gel combs

19、Power supplyGel tank CoverElectrical leads Electrophoresis EquipmentGel casting tray&combsThe tray is the actual mold which provides a shape for the gel as it polymerizes.The comb can make some“wells”in the gel.Seal the edges of the casting tray and put in the combs.Place the casting tray on a level

20、 surface.None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.Preparing the Casting TrayAgaroseAgarose is a linear polymer extracted from seaweed.D-galactose3,6-anhydroL-galactoseAgaroseBuffer SolutionCombine the agarose powder and buffer solution.Use a flask that is several time

21、s larger than the volume of buffer.Agarose is insoluble at room temperature(left).The agarose solution is boiled until clear(right).Microwave for about 1 minute to dissolve the agarose.Melting the AgaroseAllow the agarose solution to cool slightly(60C)and then carefully pour the melted agarose solut

22、ion into the casting tray.Push any bubbles away to the side using a disposable tip.Pouring the gelEach of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.When cooled,the agarose polymerizes,forming a flexible gel.It should appear lighter in color when completely cooled(30-45 minutes

23、).Carefully remove the combs and tape.Place the gel in the electrophoresis chamber.buffer Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm.Make sure each well is filled with buffer.Cathode(negative)Anode(positive)wellsDNA Loading Buffer:Bromophenol Blue(for color)Glycer

24、ol(for weight)Sample PreparationMix the samples of DNA with the loading buffer(w/tracking dye).This allows the samples to be seen when loading onto the gel,and increases the density of the samples,causing them to sink into the gel wells.Loading the GelCarefully place the pipette tip over a well and

25、gently expel the sample.The sample should sink into the well.Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.Place the cover on the electrophoresis chamber,connecting the electrical leads to the power supply.Be sure the leads are attached correctly-DNA migrates toward the anode(red).Running

26、the Gel wells Bromophenol BlueCathode(-)Anode(+)GelAfter the current is applied,make sure the Gel is running in the correct direction.Bromophenol blue will run in the same direction as the DNA.DNA(-)Staining the Gel*CAUTION!Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic.Gloves should

27、 be worn at all times.Ethidium bromide(EB)is the special dye of DNA molecules.It binds to DNA and fluoresces under UV light,allowing the visualization of DNA on a Gel.Ethidium bromide can be added to the gel before the gel run or the gel can be stained after it has run.Ethidium Bromide requires an u

28、ltraviolet light source to visualize 核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂 n最常用的是溴乙锭染色法。最常用的是溴乙锭染色法。n(ethidium bromide(ethidium bromide，EB)EB)n对对1ng RNA1ng RNA，DNADNA均可显色。均可显色。nEBEB染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，应戴上聚乙烯手套。护，应戴上聚乙烯手套。n在紫外线激发下，发出红色荧光在紫外线激发下，发出红色荧光(590nm(590nm）。实实 验验 结结 果果酶切后的基因组酶切后的基因组DNADNA基因组基因组DNADNA