人类基因组DNA提取教学内容.ppt

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1、人类基因组DNA提取人类基因组人类基因组DNADNA的提取的提取DNADNADNADNA与吸附柱结合与吸附柱结合与吸附柱结合与吸附柱结合3 3用用移移液液器器TipTip转转移移上上清清并并加加入入到到离离心心吸吸附附柱柱（套套好好收收集集管管）中中，放放置置1 1分分钟钟，1212，000 000 rpmrpm离离心心3030秒，倒掉收集管中的废液。秒，倒掉收集管中的废液。注注意意：待待转转移移上上清清约约1300l1300l，离离心心吸吸附附柱柱容容量量约约650 650 ll，故故需需每每次次转转移移上上清清650 650 ll到到离离心心吸吸附附柱柱中中，离离心心，倒倒掉掉收收集集管管

2、中中的的废废液液，重重复复实实验验操作步骤操作步骤3 3。DNADNADNADNA的纯化的纯化的纯化的纯化:4.4.再再 加加 入入 600 600 ll洗洗 涤涤 缓缓 冲冲 液液（washing washing bufferbuffer）到到离离心心吸吸附附柱柱（套套好好收收集集管管）中中，1212，000 rpm 000 rpm 离心离心3030秒。秒。5 5重重复复步步骤骤4 4一一次次，1212，000 000 rpm rpm 离离心心3 3分分钟钟以以充分除去洗涤缓冲液。充分除去洗涤缓冲液。6 6小小心心取取出出离离心心吸吸附附柱柱，弃弃收收集集管管，将将离离心心吸吸附附柱柱套套入

3、入一一个个干干净净的的1.5ml 1.5ml Eppendorf Eppendorf 离离心心管管，并并加加入入50 50 ll洗洗脱脱缓缓冲冲液液(elution(elution buffer)buffer)到到离离心心吸吸附附柱柱中中(洗洗脱脱缓缓冲冲液液一一定定要要加加在在离离心心吸吸附附柱柱的的正中正中)，放置，放置1 1分钟，于分钟，于1212，000 rpm 000 rpm 离心离心3030秒。秒。7 7取取出出Eppendorf Eppendorf 离离心心管管，其其中中便便是是所所提提取取基基因组因组NANA。（口腔上皮脱落细胞）原理（口腔上皮脱落细胞）原理 哺乳动物的一切有核

4、细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外，白细胞，肝或脾组织是最常用的的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞，有时为了简易，还可以无创伤的采集材料，如用口腔上皮脱落细胞，发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞；（口腔上皮脱落细胞）操作方法：（口腔上皮脱落细胞）操作方法：1 1、用用舌舌头头舔舔颊颊粘粘膜膜上上颚颚、用用牙牙刮刮颊颊部部，嘬嘬咀咀，用用分分泌泌出出的的唾唾液液反反复复漱漱口口；将将唾唾液液吐吐到到杯杯中中。用用生生理理盐盐水水洗洗涤涤，2000rpm2000rpm离离心心1010分分钟钟，倒倒掉掉上上清清液液；重复重

5、复1 1次。次。2 2、沉沉淀淀中中加加1ml 1ml 11细细胞胞核核裂裂解解液液(STE)(STE)，打打散散细细胞胞团团、混混匀匀，再再加加酶酶解解混混合合液液（含含350l 350l STESTE、150l 150l 10%10%SDSSDS和和10l 10l 20mg/ml20mg/ml蛋蛋白白酶酶K K），摇摇匀匀，至至出出现现粘粘稠稠透透明明状状。3737温温箱箱过过夜夜或或50503434小小时时。3 3、加加等等体体积积饱饱和和酚酚（或或1/31/3体体积积的的饱饱和和NaClNaCl），轻轻摇摇混混匀匀1010分分钟钟，室室温温2000rpm2000rpm离离心心1010分

6、分钟钟，去去除除蛋蛋白和白和SDSSDS的沉淀。的沉淀。4 4、小小心心移移上上清清至至另另一一离离心心管管（尽尽量量避避免免吸吸取取中中间间层层），加加等等体体积积氯氯仿仿混混匀匀5 5分分钟钟，室室温温2000rpm2000rpm离离心心5 5分分钟。钟。5 5、重复步骤、重复步骤4 4一次。一次。6 6、将将上上清清移移入入另另一一离离心心管管中中，沿沿离离心心管管壁壁向向DNADNA溶溶液液中中加加入入2.52.5倍倍体体积积的的无无水水乙乙醇醇，轻轻轻轻摇摇动动离离心心管管混混和和至至体体系系完完全全均均一一，见见白白色色絮絮状状DNADNA。用用移移液液器器吸吸头头挑挑出出DNAD

7、NA沉沉淀淀，在在新新配配制制的的70%70%乙乙醇醇洗洗二二次次，室温干燥室温干燥5 5分钟，再将分钟，再将DNADNA溶于溶于20-100l TE20-100l TE中。中。7 7、TETE溶溶解解的的DNADNA，在在44下下可可保保存存一一年年，如如要要求求长长期期保存，则需加保存，则需加2 2倍体积无水乙醇置倍体积无水乙醇置-70-70保存。保存。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一、一、概概念念核酸酶内切酶外切酶限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：能识别双链能识别双链DNA分子内部分子内部的特异位点并裂解的特异位点并裂解磷酸二磷酸二酯键酯键二、分二、分类类vv分分类类依据：酶的基因、

8、蛋白依据：酶的基因、蛋白质结构质结构、依、依赖赖的的辅辅助因子及助因子及与与DNADNA结结合和裂解的合和裂解的特特异异性性特性特性I I类类II II类类IIIIII类类内内内内切酶的蛋白切酶的蛋白切酶的蛋白切酶的蛋白结构结构结构结构单单单单一多功能的酶一多功能的酶一多功能的酶一多功能的酶内内切酶和甲基化酶切酶和甲基化酶分分开开共同共同共同共同亚亚亚亚基的基的基的基的双双双双功能功能功能功能酶酶酶酶限制和修限制和修限制和修限制和修饰饰饰饰活性活性活性活性3 3种种种种不同的不同的不同的不同的亚亚亚亚基基基基单单一成分一成分2 2种种种种不同的不同的不同的不同的亚亚亚亚基基基基所需所需所需所需

9、辅辅辅辅助因子助因子助因子助因子ATM,Mg2+,SAMATM,Mg2+,SAMMg2+Mg2+ATM,Mg2+,SAMATM,Mg2+,SAM寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点识识识识别别别别序列序列序列序列EcoB:TGA(N)8TGCTEcoB:TGA(N)8TGCTEcoK:AAC(N)6GTGCEcoK:AAC(N)6GTGC回文序列回文序列（IIsIIs型除外）型除外）EcoP1:AGACCEcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAGEcoP15:CAGCAG 切割位点切割位点在距离在距离识别识别位点至位点至少少1000pb1000pb处随处随机切机切开开

10、一一条单链条单链位于寄主特位于寄主特异异性位性位点或其附近点或其附近距寄主特距寄主特异异性位点性位点33端端24-26pb24-26pb处处酶催酶催酶催酶催转换转换转换转换不能不能不能不能能能能能能能DNADNA易位作用易位作用易位作用易位作用能能能能不能不能不能不能不能不能甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点寄主特寄主特异异性位点性位点寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点识别为识别为识别为识别为甲基化的序甲基化的序甲基化的序甲基化的序列列列列进进进进行切割行切割行切割行切割能能能能能能能能

11、能能序列特序列特序列特序列特异异异异的切割的切割的切割的切割不是不是不是不是是是是是是是基因工程中的用途基因工程中的用途基因工程中的用途基因工程中的用途无用无用无用无用十分有用十分有用作用不大作用不大作用不大作用不大三、作用机制三、作用机制 以环状或线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核苷酸糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3-羟基和5-磷酸基的DNA片段。四、切割方法四、切割方法识别和切割位点 4-64-6个碱基对且具有个碱基对且具有回文序列回文序列的的DNADNA片段片段 大多数酶是错位切割产生大多数酶是错位切割

12、产生55或者或者33黏性末端黏性末端例如：例如：EcoR I EcoR I 切割后产生切割后产生55黏性末端黏性末端5-G5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 5-G AATTC-3AATTC-33-CTTAAG-5 3-CTTAA 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5G-5黏性末端黏性末端平末端平末端有一些酶沿对称轴切断DNA，产生的末端称为平端或钝端例如:SmaI同工异源酶同工异源酶同工异源酶同工异源酶 来源不同的酶，但能识别和切割同一位点来源不同的酶，但能识别和切割同一位点 如如BamH I BamH I 和和Bst I(GBst I(GGATCC)GATCC)同尾酶同尾

13、酶同尾酶同尾酶 有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相 同的黏性末端。同的黏性末端。如如BamH IBamH I（GGATCCGGATCC）和）和 Sau3A I(NGATCN)Sau3A I(NGATCN)琼脂糖凝胶电泳结果分析琼脂糖凝胶电泳结果分析琼脂糖凝胶电泳结果分析琼脂糖凝胶电泳结果分析琼脂糖凝胶电泳结果分析 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶:天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些集团带有点荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。什么是琼脂糖凝胶电泳

14、？琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂凝胶分子筛作用，核算片段因其分子量或者分子形状不同，电泳速度有差异而分离。这种技术是基因操作的一种方法。琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳原理泳原理v琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力,同时也由此造成了经过一定时间的泳动后按大小形成的一条“条带”。其中线状的DNA可以通过。琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳原理泳原理:核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团

15、全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳对对核核酸酸的的分分离离结结果果与与核核酸酸的的分分子子量量、分分子子构构型型和和凝凝胶胶浓浓度度密切相关。密切相关。实实验验证证明明，DNADNA片片段段迁迁移移距距离离与与其其分分子子量量的的对对数数成成反反比比。通通过过比比较较标标准准物物与与未未知知片片段段的的移移动动距距离离便便可测出未知片段的大小。可测出未知片段的大小

16、。但但当当DNADNA分分子子超超过过20kb20kb时时，普普通通琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶就就很很难难讲它们分开。讲它们分开。1 1)核酸的分子量核酸的分子量质粒质粒DNADNA有三种形式有三种形式v1 1、共价闭环共价闭环DNADNA:常以超螺旋形式存在常以超螺旋形式存在v 2 2、开环开环DNADNA:质粒质粒DNADNA两条链中有一条发生一处或两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成形成松弛的环状分子松弛的环状分子 v 3 3、线性线性DNADNA:因质粒因质粒DNADNA的两条链在同一处断裂而的两条链在同一处断裂而造成造成

17、.2 2）核酸构型）核酸构型 不不同同构构型型的的DNADNA在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中的的电电泳泳速速度度差差别别较较大大。在在分分子子量量相相当当的的情情况况下下，不不同同构构型型的的质质粒粒DNADNA的的移移动动速速度度次次序序为为：共共价价闭闭环环DNADNA直直线线DNADNA开开环环的的双双链链环环状状DNADNA。这这三三种种构构型型的的相相对对迁迁移移速速率率主主要要取取决决于于凝凝胶胶浓浓度度，同同时时也也受受到到电电流流强强度度、缓缓冲冲液离子强度等液离子强度等的影响。的影响。超螺旋超螺旋DNADNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在尽管质粒通常以开环的形式进行

18、描述，然而在细菌细胞内细菌细胞内DNADNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动构致密，它在凝胶中的泳动速度最快速度最快。线性线性DNADNA：当当DNADNA损伤在损伤在DNADNA双链相对应的两条链上同时产双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒生切口时，就会出现线性质粒DNADNA，这种，这种DNADNA的泳的泳动速率动速率介于介于超螺旋与切口质粒超螺旋与切口质粒DNADNA之间。之间。开环开环DNADNA：在质粒在质粒DNADNA复制过程中，拓

19、扑异构酶复制过程中，拓扑异构酶I I会在会在DNADNA双双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最速率最慢慢，其，其“松散松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。胶中的运动。一一定定大大小小的的DNADNA片片段段在在不不同同浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中的的电电泳泳

20、迁迁移移率率不不同同。要要有有效效地地分分离离大大小小不不同同的的DNADNA片段，需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。片段，需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。3 3）琼脂糖的浓度）琼脂糖的浓度琼脂糖凝胶电泳的应用。琼脂糖凝胶电泳的应用。v蛋蛋白白质质和和核核酸酸，由由于于pHpH的的不不同同带带有有不不同同电电荷荷，且且在在电电场场中中受受力力大大小小不不同同，导导致致发发生生泳泳动动的的速速度度不不同，最终可将其分离开来。同，最终可将其分离开来。v电电泳泳缓缓冲冲液液的的pHpH在在6969之之间间，离离子子强强度度0.020.050.020.05为为最最适适。常常用用1%1%的的琼琼脂脂糖糖作作为为电

21、电泳泳支支持持物物。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶约约可可区区分分相相差差100bp100bp的的DNADNA片片段段，其其分分辨辨率率虽虽比比聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶低低，但但它它制制备备容容易易，分分离离范范围围广广。普普通通琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶分分离离DNADNA的的范范围围为为0.2-20kb0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达，利用脉冲电泳，可分离高达107bp107bp的的DNADNA片段。片段。v电泳的缓冲液中充满了离子，因此可以导电。电泳的缓冲液中充满了离子，因此可以导电。DNADNA分子在高于等电点的分子在高于等电点的pHpH溶液中带负电荷，在电场溶液中带负电荷，在电场中向正

22、极移动。中向正极移动。由于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复磷酸骨架在结构上的重复性质，性质，相同数量的双链相同数量的双链DNADNA几乎具有等量的净电荷几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。因此它们能以同样的速率向正极方向移动。琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳注意点泳注意点选择合适的电泳方法选择合适的电泳方法v琼脂糖凝胶电泳：一般的核酸检测琼脂糖凝胶电泳：一般的核酸检测v聚丙烯酰胺凝胶电泳：高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳：高分辨率v脉冲凝胶电泳：脉冲凝胶电泳：DNADNA链巨大链巨大凝胶浓度凝胶浓度 浓度通常在浓度通常在0.50.52%2%之间，低浓度的用于大片段核酸之间，低浓度的

23、用于大片段核酸的电泳，高浓度的用于小片段分析。低浓度胶易碎，的电泳，高浓度的用于小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意：小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意：高浓度的胶可能使分子大小相近的高浓度的胶可能使分子大小相近的DNADNA带不易分辨，带不易分辨，造成条带缺失现象。造成条带缺失现象。缓冲液缓冲液:常常用用的的缓缓冲冲液液有有TAETAE和和TBETBE，而而TBETBE比比TAETAE有有着着更更好好的的缓缓冲冲能能力力。使使用用新新制制的的缓缓冲冲液液可可以以明明显显提提高高电电泳效果。泳效果。注注意意：电电泳泳缓缓冲冲液液多多次次使使用用后后，

24、离离子子强强度度降降低低，pHpH值值上上升升，缓缓冲冲性性能能下下降降，可可能能使使DNADNA电电泳泳产产生生条条带带模糊和不规则模糊和不规则的的DNADNA带迁移的现象。带迁移的现象。电压电压和和温温度度:电电泳泳时时电电压压不不应应该该超超过过20V/cm20V/cm，电电泳泳温温度度应应该该低低于于3030，对对于于巨巨大大的的DNADNA电电泳泳，温温度度应应该该低低于于1515。注注意意：如如果果电电泳泳时时电电压压和和温温度度过过高高，可可能能导导致致出出现现条条带带模模糊糊和和不不规规则则的的DNADNA带带迁迁移移的的现现象象。特特别别是是电电压压太太大大可可能能导导致致小

25、小片片段段跑跑出出胶胶而而出出现现缺缺带带现现象象 DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计比较准确。需要注意的是Marker的电泳同样要符合DNA电泳的操作标准。核酸染色核酸染色剂剂 实验室常用的核酸染色剂是实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）溴溴化化乙乙锭锭（EBEB）：是是一一种种吖吖啶啶类类染染料料，它它在在紫紫外外灯灯照照射射下下能能发发射射荧荧光光，当当DNADNA样样品品在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中电电泳泳时时，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中

26、的的EBEB就就插插入入DNADNA分分子子中中形形成成荧荧光光络络合合物物，使使DNADNA发发射射的的荧荧光光增增强强几几十十倍倍，电电泳泳后就可直接紫外灯照射检测琼脂糖中的后就可直接紫外灯照射检测琼脂糖中的DNADNAv优点：染色效果好，操作方便优点：染色效果好，操作方便v缺点：稳定性差，具有毒性。缺点：稳定性差，具有毒性。v注注意意：观观察察凝凝胶胶时时应应根根据据染染料料不不同同使使用用合合适适的的光光源源和和激激发发波波长长，如如果果激激发发波波长长不不对对，条条带带则则不不易易观察，会出现条带模糊的现象。观察，会出现条带模糊的现象。DNA样样品的品的纯纯度和度和状态状态v样样品品

27、中中含含盐盐量量太太高高和和含含杂杂质质蛋蛋白白均均可可以以产产生生条条带带模糊和条带缺失的现象。模糊和条带缺失的现象。乙乙醇醇沉沉淀淀可可以以去去除除多多余余的的盐盐，用用酚酚可可以以去去除除蛋蛋白。白。v变变性性的的DNADNA样样品品可可能能导导致致条条带带模模糊糊和和缺缺失失，也也可可能能出现不规则的出现不规则的DNADNA条带迁移。条带迁移。用用20mM NaCl20mM NaCl缓冲液稀释可以防止缓冲液稀释可以防止DNADNA变性变性DNADNA的上样的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。琼脂糖凝胶电泳操作步骤琼脂糖凝胶电泳操作步骤v1 制备琼脂糖凝胶v2.胶板制备v3.加样v4.电泳v5.漂洗v6.观察照相琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用v检测提取的DNAv设计完成引物，扩增好基因序列，做完PCR后，检测是否成功。v观察限制性内切酶的切割结果v通过切胶回收纯化某个片段实验结果观察及记录实验结果观察及记录v在波长为254nm的长波长紫外灯下，观察染色的或已加有EB的电泳胶板v记录下结果，找出实验中的问题及不足。谢谢观赏OfficeMake Presentation much more funWPS官方微博kingsoftwps