生物化学第34章DNA的复制和修复.ppt

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1、生物化学第34章DNA的复制和修复 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、DNA的复制（一）（一）DNA的半保留复制的半保留复制DNA复制的三种可能模式 Conservative Semiconservative dispersiveAfter onegenerationAfter twogenerationsWatson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型oldnewDNA半保留复制的实验证明 1958年年，Meselson和和Stahl利利用用1

2、5N标标记记大大肠肠杆杆菌菌DNA的的实实验验，首首先先证证明明了了DNA的的半半保保留留复复制制。他他们们让让大大肠肠杆杆菌菌在在以以15NH4Cl为为唯唯一一氮氮源源的的培培养养基基中中生生长长，经经过过连连续续培培养养12代代，使使所所有有的的DNA分分子子都都标标记记上上15N。15N-DNA的的密密度度比比普普通通14N-DNA大大，在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种DNA。DNA半保留复制的实验证明 这这时时将将大大肠肠杆杆菌菌转转移移到到普普通通培培养养基基（含含14N）上上培培养养，经经过过一一代代以以后后，所所有有DNA的的密密度度都都介

3、介于于15N-DNA和和14N-DNA之之间间，说说明明这这时时的的DNA为为14N和和15N的的杂杂合合分分子子。两两代代后后，14N分分子子和和杂杂合合分分子子等等量量出出现现。当当把把杂杂合合分分子子加加热热，使使它它们们分分开开成成单单链链再再离离心心，可可见见有有一一半半与与单单链链15N-DNA的的密密度度相相同，另一半与单链同，另一半与单链14N-DNA的密度相同。的密度相同。The Meselson-Stahl experimentDNA extracted and centrifuged to equi-librium in CsCl density gradient（二）D

4、NA复制的起点和方式 DNA上上能能独独立立进进行行复复制制的的单单位位称称为为复复制制子子（replicon），每每个个复复制制子子都都有有复复制制起起始始点点，可可能能还还有有复复制制的的终终点点。DNA复复制制起起始始点点一一般般有有特特定定的的序序列列，DNA在在复复制制起起始始点点处处解解开开双双链链，形形成成一一个个复复制制泡泡（也也叫叫复复制制眼眼）。有有些些DNA的的复复制制从从复复制制起起始始点点开开始始向向两两边边复复制制，也也有有些些DNA的的复复制制从从复复制制起起始始点点开开始始向向一一边边复复制制，它它们们分分别别称称为为双双向向复复制制和和单单向向复复制制。DNA

5、复制的方向未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制DNA复制的方向 先先将将大大肠肠杆杆菌菌在在含含有有少少量量3H标标记记的的胸胸腺腺嘧嘧啶啶的的培培养养基基中中培培养养，然然后后换换到到含含有有大大量量3H标标记记的的胸胸腺腺嘧嘧啶啶的的培培养养基基中中短短时时间培养，放射自显影可以观察到复制叉。间培养，放射自显影可以观察到复制叉。中国仓鼠卵巢细胞DNA复制的电镜照片 大大箭箭头头所所指指为为复复制制泡泡，小小箭箭头头所所指指为为复复制制叉叉处处的的单单链链部部分分，注注意意两两个个复复制制叉叉处处的的单单链链部部分分在在相反的链上。相反的链上。各种生物DNA的结构 DNA有有线

6、线性性双双链链和和环环状状双双链链的的，也也有有环环状状单单链链的的。原原核核生生物物的的染染色色体体DNA和和质质粒粒，以以及及真真核核细细胞胞中中的的线线粒粒体体和和叶叶绿绿体体DNA都都是是双双链链环环状状的的，真真核核生生物物的的染染色色体体DNA是是双双链链线线性性的的。病病毒毒的的DNA有有单单链链环环状状的的，也也有有双双链链环环状状的的，还还有有双双链链线性的。线性的。DNA上复制子的数目 原原核核生生物物染染色色体体DNA和和质质粒粒DNA就就是是一一个个复复制制子子，从从一一个个复复制制起起始始点点开开始始完完成成整整个个DNA分分子子的的复复制制。真真核核细细胞胞一一个个

7、染染色色体体DNA上上有有许许多多复复制制子子，许许多多复复制制起起始始点点同同时时开开始始复复制制，每每一一个个复复制制起起始始点点完完成成一一段段DNA的的复复制制，然然后后将将各各个个片片段段连连接起来。接起来。复制起始点的确定 大大肠肠杆杆菌菌染染色色体体DNA只只有有一一个个复复制制起起始始点点。在在一一个个生生长长的的群群体体中中几几乎乎所所有有细细胞胞的的染染色色体体都都在在复复制制过过程程中中，因因此此离离复复制制起起始始点点越越近近的的基基因因拷拷贝贝数数就就越越多多，也也就就是是出出现现的的频频率率越越高高。将将从从大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取出出来来的的DNA切切成成大大

8、约约1%染染色色体体长长度度的的片片段段，通通过过分分子子杂杂交交的的方方法法测测定定各各基基因因片片段段的的频频率率，结结果果表表明明复复制制起起始始点点ori C位位于于基基因因图图谱谱的的ilv位位点点处处（83分分附附近近）。一一旦旦复复制制开开始始，复复制制叉叉向向两两侧侧以以相相等等的的速速度度向向前前移移动动。两两个个复复制制叉叉在在离离起起始始点点180的的trp位位点点处处（33分分附附近近）会合。会合。大肠杆菌染色体DNA复制起始点的确定DNA的复制方式直线双向直线双向多起点双向多起点双向（真核细胞染色体）（真核细胞染色体）型双向型双向型单向型单向 大大 肠肠 杆杆 菌菌染

9、染色色体体DNA即即是是双双向向复复制制，噬噬菌菌体体的的早早期期复复制制也也是是双双向向复制。复制。DNA的复制方式滚环复制滚环复制噬菌体噬菌体DNA的后期复制即是此种方式。的后期复制即是此种方式。先先以以轻轻链链为为模模板板复复制制一一条条重重链链，而而原原来来的的亲亲本本重重链链被被置置换换出出来来称称为为D loop。当当D loop扩扩大大到到整整个个线线粒粒体体DNA的的大大约约67%的的位位置置时时，被被置置换换出出来来的的亲亲本本重重链链上上的的轻轻链链复复制制原原点点OL才暴露出来，然后开始轻链的合成。才暴露出来，然后开始轻链的合成。DNA的复制方式D环复制环复制 最最典典型

10、型的的D环环复复制制是是哺哺乳乳动动物物线线粒粒体体DNA的的复复制制。在在环环状状双双链链DNA的的特特定定位位点点即即重重链链的的复复制制原原点点OH附附近近，解解开开双双链链，形成一个复制泡。形成一个复制泡。DNA的复制方式2D环环大肠杆菌的多复制叉染色体DNA酶促合成的引物链和模板链（三）DNA聚合反应有关的酶DNA聚合酶催化的聚合反应5 端端3 端端DNADNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的反应特点 以以4种种dNTP作底物；作底物；反应需要接受模板的指导；反应需要接受模板的指导；反应需要有引物反应需要有引物3-羟基存在；羟基存在；DNA链的延长方向为链的延长方向为53；产物产物DNA的

11、性质与模板相同。的性质与模板相同。大肠杆菌DNA聚合酶 1955年年，Arthur Kornberg等等发发现现了了大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶，后后来来又又发发现现了了4种种DNA聚聚合合酶酶，分分别别称称为为DNA聚聚合合酶酶、和和，它它们有各自不同的用途。们有各自不同的用途。（DNA polymerase）The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deox

12、yribonucleic acidSevero OchoaArthur KornbergNew York University,College of Medicine Stanford UniversityThe Nobel Prize in Chemistry 2006for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcriptionRoger D.KornbergStanford University Stanford,CA,USAb.1947大肠杆菌DNA聚合酶 大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶由由一一条条肽肽链链（92

13、8个个氨氨基基酸酸残残基基）组组成成，含含有有一一个个锌锌原原子子，分分子子量量103kD。它是一个多功能酶，具有以下活性：它是一个多功能酶，具有以下活性：53聚合活性；聚合活性；35外切活性（校对活性）；外切活性（校对活性）；53外切活性（只作用于双链外切活性（只作用于双链DNA）；）；从从3端端使使DNA链链发发生生焦焦磷磷酸酸解解（聚聚合合反反应应的的逆逆反反应）；应）；无机焦磷酸盐与无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。之间的焦磷酸基交换。大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段 用用枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶裂裂解解完完整整的的大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶，得得到到C端端3

14、24928氨氨基基酸酸残残基基的的片片段段，称称为为Klenow片片段段。1-323氨氨基基酸酸残残基基为为小小片片段段。小小片片段段具具有有53外外切切活活性性，Klenow片片段具有聚合酶活性和段具有聚合酶活性和35外切活性。外切活性。酶切位点酶切位点Klenow片段片段Klenow片段的立体结构蓝蓝色色为为模模板板链链，红红色色为为引引物物链。链。Klenow片段的活性位点DNA聚合酶的校对作用 在在正正常常聚聚合合条条件件下下，35外外切切活活性性不不能能作作用用于于生生长长链链；一一旦旦出出现现错错配配碱碱基基时时，聚聚合合反反应应立立即即停停止止，生生长长链链的的3末末端端核核苷苷

15、酸酸落落入入35外外切切活活性性位位点点，错错配配核核苷苷酸酸被被迅迅速速切切去去，然然后后继继续续进进行行聚聚合合反反应应。35外切活性起着校对的作用。外切活性起着校对的作用。校校对对作作用用越越强强，DNA复复制制的的准准确确性性越越高高。适适当当的的错错配配有有利利于于发发生生突突变变，有有利利于于物物种种的的进进化化。突突变变率率太太高也不利于保持物种的稳定性。高也不利于保持物种的稳定性。DNA聚合酶的切口平移作用关于大肠杆菌DNA聚合酶的研究 根根据据对对各各种种DNA聚聚合合酶酶在在大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞中中的的活活性性、合合成成DNA的的速速度度、该该酶酶基基因因突突变变对对D

16、NA复复制制的的影影响响的的研研究究，发发现现DNA聚聚合合酶酶是是大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞中中DNA复复制制的的主主酶酶，而而DNA聚聚合合酶酶和和的的功功能能只只是是参与参与DNA损伤的修复。损伤的修复。大肠杆菌中3种DNA聚合酶性质的比较项项 目目聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶53聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性相对分子量（相对分子量（103）1031038888830830一个细胞内分子数一个细胞内分子数400400？10102020生物学活性生物学活性1 10.050.051515聚合速度（核苷酸聚合速度（核苷酸/分）分）1000100020

17、0020002 2,4004001515,0000006060,00000 0持续合成能力持续合成能力3 32002001 1,500500 500 500,000000功能功能切除引物，修复切除引物，修复修复修复复制复制大肠杆菌DNA聚合酶亚基亚基分子量分子量亚基数目亚基数目亚基功能亚基功能132,0002聚合活性聚合活性27,000235外切校对活性外切校对活性10,0002组建核心酶组建核心酶71,0002核心酶二聚化核心酶二聚化52,0002依赖依赖DNA的的ATP酶，形成酶，形成复合物复合物35,0001可与可与亚基结合，形成亚基结合，形成复合物复合物33,0001形成形成复合物复合

18、物15,0001形成形成复合物复合物12,0001形成形成复合物复合物37,0004两个两个亚基形成滑动夹子，以提高酶的亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力持续合成能力DNA聚合酶全酶的结构与与结结合合两两个个亚亚基基各各催催化化复复制制叉叉处处一条链的合成。一条链的合成。二聚体的滑动夹子结构红、绿色各为一个红、绿色各为一个亚基亚基DNA聚合酶和 DNA聚聚合合酶酶和和是是在在1999年年才才被被发发现现的的。它们的功能是进行易错修复。它们的功能是进行易错修复。DNA连接酶 大大肠肠杆杆菌菌DNA连连接接酶酶可可以以连连接接切切口口和和粘粘性性末末端端，T4噬噬菌菌体体DNA连连接接酶酶除

19、除可可以以连连接接切切口口和和粘粘性性末端外，还可以连接平末端。末端外，还可以连接平末端。（DNA ligase）DNA的连接类型（四）DNA的半不连续复制 在在复复制制叉叉处处，两两条条新新生生链链是是同同时时合合成成的的，新新生生链链延延伸伸的的方方向向一一条条是是53，而而另另一一条条是是35，这这就就不不符符合合DNA聚聚合合酶酶催催化化反反应应的的性性质质。为为了了解解决决这这个个矛矛盾盾，日日本本学学者者冈冈崎崎等等提提出出了了DNA的的不不连连续续复复制制模模型型，认认为为35走走向向的的新新生生DNA链链实实际际上上是是由由许许多多53方方向向合合成成的的片片段段连连接起来的。

20、接起来的。DNA复制叉处的前导链和滞后链 53链链是是连连续续合合成成的的，35链链是是不不连连续续合成的，因此称为半不连续复制。合成的，因此称为半不连续复制。冈崎片段的发现 1968年年，冈冈崎崎等等用用3H-脱脱氧氧胸胸苷苷标标记记T4噬噬菌菌体体感感染染的的大大肠肠杆杆菌菌，然然后后通通过过碱碱性性密密度度梯梯度度离离心心法法分分离离标标记记的的DNA产产物物，发发现现短短时时间间内内首首先先合合成成的的是是较较短短的的DNA片片段段，接接着着出出现现较较大大的的分分子子，最最初初出出现现的的DNA片片段段的的长长度度约约为为1000个个核核苷苷酸酸左左右右，这这种种片片段段称称为为冈冈

21、崎崎片片段段（Okazaki fragment）。用用DNA连连接接酶酶变变异异的的温温度度敏敏感感株株进进行行实实验验，在在连连接接酶酶不不起起作作用用的的温温度度下下，有有大大量量DNA片片段段积积累累。这这些些实实验验都都说说明明在在DNA复复制制的的过过程程中中，首首先先合合成成较较短短的的片片段段，然然后后再再由由连连接接酶酶连连接接成成大分子大分子DNA。原核生物和真核生物的冈崎片段 细细菌菌的的冈冈崎崎片片段段长长度度为为10002000个个核核苷苷酸酸，相相当当于于一一个个顺顺反反子子（cistron）的的长长度度；真真核核生生物物的的冈冈崎崎片片段段长长度度为为100200个

22、个核核苷苷酸酸，相当于一个核小体相当于一个核小体DNA的长度。的长度。DNA复制中的引物 由由于于DNA聚聚合合酶酶必必须须在在已已有有的的核核酸酸链链的的3-羟羟基基上上延延伸伸新新链链，所所以以在在前前导导链链合合成成开开始始时时以以及及滞滞后后链链的的每每一个冈崎片段开始时都需要有引物。一个冈崎片段开始时都需要有引物。RNA聚聚合合酶酶以以DNA为为模模板板合合成成RNA的的过过程程称称为为转转录录，转转录录是是不不需需要要引引物物的的。DNA复复制制的的引引物物就就是是小小片片段段的的RNA，这这个个RNA引引物物的的合合成成是是由由引引物物合合成成酶酶催催化化合合成成的的。RNA引引

23、物物的的长长度度通通常常为为几几个个核核苷苷酸酸至至十十几几个核苷酸。个核苷酸。（六）DNA复制的过程DNA ligase DNA polymeraseOld Okazaki fragmentOkazaki fragmentPrimerLagging strand templatePrimerHelicase/primaseNewly synthesized leading strandDimeric replicative DNA polymerasesubunit“sliding clamp”SSBLeading strand templateDNA gyraseDNA复制叉处的结构复制叉

24、处的结构PrimerDNA复制时涉及的部分酶和蛋白质Gyrase：拓扑异构酶：拓扑异构酶，旋转酶。，旋转酶。Helicase：解旋酶。：解旋酶。SSB（single-stranded DNA binding protein）：）：单链单链DNA结合蛋白。结合蛋白。Primase：引发酶，引物合成酶。引发酶，引物合成酶。Primer：引物。引物。拓扑异构酶 拓拓扑扑异异构构酶酶可可以以改改变变DNA双双螺螺旋旋的的连连环环数数，其其功能是引入超螺旋或解开超螺旋。功能是引入超螺旋或解开超螺旋。拓拓扑扑异异构构酶酶可可分分为为两两类类：类类型型的的酶酶能能使使DNA的的一一条条链链发发生生断断裂裂和

25、和再再连连接接，反反应应无无需需提提供供能能量量；类类型型的的酶酶能能使使DNA的的两两条条链链同同时时发发生生断断裂裂和和再再连连接接，当它引入超螺旋时需要由当它引入超螺旋时需要由ATP提供能量。提供能量。拓扑异构酶 拓拓扑扑异异构构酶酶属属于于类类型型。它它只只能能消消除除负负超超螺螺旋旋，对正超螺旋不起作用。对正超螺旋不起作用。拓拓扑扑异异构构酶酶在在使使DNA的的一一条条链链断断裂裂时时，由由于于酶酶与与DNA结结合合，DNA链链不不能能自自由由转转动动，超超螺螺旋旋的的扭扭曲曲张张力力不不会会自自动动消消失失。但但是是酶酶分分子子可可牵牵引引另另一一条条链链通通过过切切口口，然然后后

26、使使断断链链重重新新连连接接起起来来，从从而而改改变变DNA的的连环数和超螺旋数。连环数和超螺旋数。拓扑异构酶 拓拓 扑扑 异异 构构 酶酶 属属 于于 类类 型型，又又 叫叫 旋旋 转转 酶酶（gyrase）。它它可可连连续续引引入入负负超超螺螺旋旋，反反应应需需要要消消耗耗ATP。在在无无ATP存存在在时时，它它可可以以松松弛弛负负超超螺螺旋旋，但但不不作用于正超螺旋。作用于正超螺旋。大大肠肠杆杆菌菌旋旋转转酶酶由由两两个个A亚亚基基和和两两个个B亚亚基基组组成成，A亚亚基基是是抗抗萘萘啶啶酮酮酸酸和和奥奥啉啉酸酸的的作作用用位位点点，B亚亚基基是是抗抗香香豆豆霉霉素素A1和和新新生生霉霉

27、素素的的作作用用位位点点。这这些些抗抗生生素素均均能能抑抑制制DNA复复制制，因因而而推推测测旋旋转转酶酶对对DNA复复制制是是必需的。必需的。旋转酶的作用机制解旋酶（helicase）解解旋旋酶酶能能将将DNA两两条条链链解解开开，每每解解开开一一对对碱碱基基，需需要要水水解解2分分子子ATP。大大肠肠杆杆菌菌有有许许多多种种解解旋旋酶酶，其其中中解解旋旋酶酶、可可以以沿沿着着模模板板链链的的53方方向向移移动动，而而rep蛋蛋白白则则沿沿着着35方方向向移移动动。过过去去认认为为在在DNA复复制制中中，这这两两种种酶酶配配合合作作用用解解开开DNA双双链链，但上述酶经诱变并不影响但上述酶经

28、诱变并不影响DNA的复制。的复制。DnaB蛋白 曾曾经经分分离离出出一一些些大大肠肠杆杆菌菌DNA复复制制的的温温度度敏敏感感突突变变株株。其其中中一一株株当当培培养养温温度度由由30升升高高到到40时时，DNA复复制制立立即即停停止止，分分析析表表明明dnaB基基因因发发生生了了温温度度敏敏感感突突变变。该该基基因因产产物物DnaB是是一一种种解解旋旋酶酶，可可沿沿DNA链链53 方方向向移移动动，由由ATP提提供供能能量量。这这就就证明该解旋酶参与证明该解旋酶参与DNA的复制。的复制。单链DNA结合蛋白 大大肠肠杆杆菌菌的的单单链链DNA结结合合蛋蛋白白（single-stranded D

29、NA binding protein，SSB）由由4个个相相同同的的亚亚基基组组成成，它它的的功功能能是是与与已已经经解解开开的的单单链链DNA结结合合，阻阻止止重重新新形成双链，保护单链部分不被核酸酶降解。形成双链，保护单链部分不被核酸酶降解。原原核核生生物物的的SSB蛋蛋白白与与单单链链DNA的的结结合合有有正正协协同同效效应应，当当第第一一个个SSB蛋蛋白白结结合合后后，后后面面的的SSB蛋蛋白白的的结结合合力力可可提提高高103倍倍。因因此此一一旦旦结结合合反反应应开开始始，全全部部单单链链DNA迅迅速速被被SSB覆覆盖盖。但但真真核核生生物物的的SSB蛋蛋白白没没有这种协同作用。有这

30、种协同作用。大肠杆菌染色体oriC的结构DNA复制的起始超螺旋超螺旋模板模板起始起始复合物复合物DnaA 四聚体四聚体靠近结合位点靠近结合位点DnaA 四聚体结四聚体结合在结合位点上合在结合位点上13-bp segments 9-bp segments20-40 moreDnaA 单体单体oriC被多个被多个DnaA缠绕缠绕DNA复制的起始开放开放复合物复合物DnaB6DnaC6六聚物六聚物DnaCsubunitsDnaBsubunitsOpen oriC regionDnaT开放的复制起始区开放的复制起始区DNA复制的起始DnaB有有 解解 旋旋酶酶活活性性，它它每每解解开开一一个个碱碱基基

31、对对需需要要消消耗耗2个个ATP。预引发预引发复合物复合物SSB 结合到单链结合区结合到单链结合区打开打开 DnaA富集区域富集区域SSBDnaBsubunitDnaBsubunitOpen region引发和复制引发和复制DNA复制体的装配DnaB complexDnaB complexEnd of oriCDnaAtetramerdisplacedDnaAtetramerdisplacedPrimasePrimosomeSSB tetramer onSingle-strand DNAPrimase,PriA,PriB,PriCPriB,PriCDNA复制体的装配滞后链滞后链RNA前导链前导

32、链RNA 引物引物DnaAtetramerdisplacedDnaAtetramerdisplaced前导链前导链RNA 引物引物滞后链滞后链RNADNA复制体的装配DNA聚合酶聚合酶 最后一个最后一个DnaA四聚四聚物被置换物被置换DNA聚合酶聚合酶 岗琦片段的连接DNA polymerase DNA ligaseDNA连接酶催化的反应DNA复制叉的延伸Leading strand“core”DNA polymerase 2 SSB Rep proteinLeading Laggingstrand strand1st RNA primerLagging strand“core”DNA pol

33、ymerase 3rd RNA primer(most recent)PrimosomeHelicase 2nd RNA primerGrowingOkazaki fragmentDNA复制的终止 Ter位位点点是是一一个个20bp的的短短序序列列，其其中中含含有有一一个个保保守守核核心心GTGTGTTGT，Tus蛋蛋白白与与Ter位位点点结结合合后后起起终终止止复复制制叉叉前前进的作用。进的作用。DNA复制的终止DNA topoisomerase（七）真核生物DNA的复制 真真核核生生物物染染色色体体有有多多个个复复制制起起始始点点。5-氟氟脱脱氧氧尿尿苷苷是是细细胞胞内内胸胸腺腺嘧嘧啶啶核

34、核苷苷酸酸合合成成的的抑抑制制剂剂，用用5-氟氟脱脱氧氧尿尿苷苷处处理理真真核核生生物物的的培培养养细细胞胞可可以以抑抑制制DNA复复制制，随随后后加加入入3H-脱脱氧氧胸胸苷苷就就可可以以使使DNA复复制制同同步步化化。复复制制进进行行大大约约30分分钟钟，然然后后制制成成DNA的的放放射射自自显显影影图图像像，在在电电子子显显微微镜镜下下观观察察，可可以以看看到到很很多多复复制制眼眼，每每个个复复制制眼眼都都有有独独立立的的起起点点，并并呈呈双双向向延延伸。通过测量和换算，可以估算出复制子的大小。伸。通过测量和换算，可以估算出复制子的大小。真核生物的复制子 哺哺乳乳动动物物的的复复制制子子

35、大大多多在在100200kb之之间间。人人的的细细胞胞有有23对对染染色色体体，单单倍倍体体基基因因组组大大约约有有3109bp,平平均均每每个个染染色色体体有有1000个个复复制制子子。果果蝇蝇或酵母的复制子较小，平均为或酵母的复制子较小，平均为40kb。真核DNA的复制速度 真真核核生生物物DNA的的复复制制速速度度比比原原核核生生物物慢慢。大大肠肠杆杆菌菌DNA复复制制叉叉的的移移动动速速度度为为50,000bp/min，哺哺乳乳类类动动物物复复制制叉叉的的移移动动速速度度仅仅为为10003000bp/min。但但因因真真核核细细胞胞染染色色体体有有许许多多复复制制起起始始点点同同时时起

36、起始始复复制，所以总的复制速度并不慢。制，所以总的复制速度并不慢。哺乳动物的DNA聚合酶DNA聚合聚合酶酶（）DNA聚合聚合酶酶（）DNA聚合聚合酶酶（M）DNA聚合聚合酶酶（）DNA聚合聚合酶酶（）定位定位细胞核细胞核细胞核细胞核线粒体线粒体细胞核细胞核细胞核细胞核亚基数目亚基数目41221外切酶活性外切酶活性无无无无35外切酶外切酶35外切酶外切酶35外切酶外切酶引物合成酶活性引物合成酶活性有有无无无无无无无无持续合成能力持续合成能力中等中等低低高高有有PCNA时高时高高高抑制剂抑制剂蚜肠霉素蚜肠霉素双脱氧双脱氧TTP双脱氧双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素功能功能引物合成引物合

37、成修复修复线粒体线粒体DNA合成合成核核DNA合成合成修复修复PCNA：proliferating cell nuclear antigen，增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原细菌和真核生物复制体的组成组组 成成细细 菌菌真核生物真核生物复制酶复制酶DNA聚合酶聚合酶全酶全酶DNA聚合酶聚合酶进行性因子进行性因子夹子夹子PCNA定位因子定位因子复合物复合物RF-C引物合成酶引物合成酶BnaGDNA聚合酶聚合酶去除引物去除引物RNase H和和DNA聚合酶聚合酶RNase H1和和MF-1滞后链修复滞后链修复DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶连接酶解旋酶解旋酶D

38、naB（定位需要（定位需要DnaC）T抗原抗原消除拓扑张力消除拓扑张力旋转酶旋转酶拓扑异构酶拓扑异构酶单链结合单链结合SSBRP-APCNA同源三聚体夹子真核染色体末端的复制 对对于于线线性性DNA的的复复制制，两两条条新新链链5末末端端的的引引物物切切除除后后出出现现缩缩短短现现象象，这这种种现现象象会会使使染染色色体体不不稳定。稳定。真核染色体末端的复制 为为了了解解决决这这个个问问题题，染染色色体体的的两两端端有有一一段段特特殊殊序序列列，称称为为端端粒粒（telomeres）。端端粒粒由由许许多多短短序序列列的的串串联联重重复复组组成成。原原生生动动物物四四膜膜虫虫端端粒粒的的重重复复

39、序序列列为为TTGGGG，人人的的端端粒粒重重复复序序列列为为TTAGGG。TG链链比比其其互互补补链链更更长长，形形成成有有数数百百个个核核苷苷酸酸的的3突突出出末末端端。端端粒粒的的长长度度从从原原生生动动物物的的数数十十bp到到哺哺乳乳动动物物的的数万数万bp。端端粒粒可可防防止止染染色色体体间间末末端端连连接接，并并可可补补偿偿滞滞后后链链5末端在消除末端在消除RNA引物后造成的短缺。引物后造成的短缺。端粒酶（telomerase）端端粒粒酶酶是是一一种种含含有有RNA的的逆逆转转录录酶酶，它它以以自自身身携携带带的的RNA为为模模板板来来合合成成DNA的的端端粒粒结结构构，以以延延长

40、长缩缩短短了了的的端端粒粒。四四膜膜虫虫端端粒粒酶酶的的RNA为为159个个碱碱基基，含含有有CAACCCCAA序序列列。端端粒粒酶酶可可结结合合到到染染色色体体端端粒粒的的3末末端端上上，RNA模模板板的的5末末端端识识别别DNA的的3末末端端碱碱基基并并与与之之配配对对，并并在在DNA 3末末端端的的羟羟基基上上延延伸伸合合成成新新的的重重复复序序列列。合合成成1个个重重复复单单位位后后酶酶向向前前移移动动一一个个重重复复单单位位，继继续续延延长长DNA的的3末末端端。当当3突突出出足足够够长长时时，就就可可以以在在其其互互补补链链上上增增加加一一个个冈冈崎崎片片段段的的合合成。这样两条链

41、都得到了延长。成。这样两条链都得到了延长。新生链5 5端的短缺和端粒酶延长端粒的功能真核染色体端粒的延长细胞的寿命与端粒的关系 在在动动物物的的生生殖殖细细胞胞中中，由由于于端端粒粒酶酶的的存存在在，端端粒粒一一直直保保持持着着一一定定的的长长度度。体体细细胞胞随随着着分分化化而而失失去去端端粒粒酶酶活活性性，在在缺缺乏乏端端粒粒酶酶活活性性时时，细细胞胞连连续续分分裂裂使使得得端端粒粒不不断断缩缩短短，短短到到一一定定程程度度即即引引起起细胞生长停止或凋亡。细胞生长停止或凋亡。实实验验表表明明，经经过过多多代代培培养养的的细细胞胞其其染染色色体体的的端端粒粒变变短短，染染色色体体也也变变得得

42、不不稳稳定定。但但在在肿肿瘤瘤细细胞胞中却有端粒酶活性。中却有端粒酶活性。二、DNA的损伤修复 尽尽管管DNA聚聚合合酶酶有有校校对对功功能能，DNA在在复复制制过过程程中中，仍仍可可能能产产生生错错配配；其其他他内内因因、外外因因也也会会造造成成DNA的的损损伤伤，如如紫紫外外线线照照射射、电电离离辐辐射射、化化学学诱诱变变剂剂、病病毒毒DNA的的整整合合、DNA重重组组等等。DNA损损伤伤会会引引起起生生物物突突变变，甚甚至至导导致致死死亡亡。在在一一定定的的条条件件下下，生生物物机机体体能能使使其其DNA的的损损伤伤得得到到修修复复。这这种种修修复复是是生生物物在在长长期期进进化化过过程

43、程中中获获得得的一种保护功能。的一种保护功能。DNA损伤修复的种类 目目前前已已经经知知道道，细细胞胞对对DNA损损伤伤的的修修复复系系统有统有5种：种：错配修复（错配修复（mismatch repair）直接修复（直接修复（direct repair）切除修复（切除修复（excision repair）重组修复（重组修复（recombination repair）易错修复（易错修复（error-prone repair）（一）错配修复 DNA在在复复制制过过程程中中发发生生错错配配，如如果果新新合合成成的的链链被被校校正正，基基因因编编码码的的信信息息可可得得到到恢恢复复；但但是是如如果果模

44、模板板链链被被校校正正，突突变变就就被被固固定定。细细胞胞错错配配修修复复系系统统能能够够区区分分“旧旧链链”和和“新新链链”。Dam甲甲基基化化酶酶可可使使DNA的的GATC序序列列中中的的腺腺嘌嘌呤呤N6位位甲甲基基化化。复复制制后后DNA在在短短期期内内（数数分分钟钟）为为半半甲甲基基化化的的GATC序序列列，错错配配修修复复系系统统一一旦旦发发现现错错配配碱碱基基，即即将将未未甲甲基基化化的的新链切除，并以甲基化的旧链为模板进行修复合成。新链切除，并以甲基化的旧链为模板进行修复合成。错配修复 在在大大肠肠杆杆菌菌中中，Mut S二二聚聚体体识识别别并并结结合合到到DNA的的错错配配碱碱

45、基基部部位位，Mut L与与Mut S结结合合，二二者者组组成成的的复复合合物物可可沿沿着着DNA双双链链向向两两个个方方向向移移动动，DNA由由此此形形成成突突环环。复复合合物物的的移移动动需需要要水水解解ATP提提供供能能量量。当当遇遇到到GATC序序列列时时，Mut H核核酸酸内内切切酶酶结结合合到到Mut SL上，并在未甲基化的新链上，并在未甲基化的新链GATC的的5端切断。端切断。错配修复 如如果果切切开开处处位位于于错错配配碱碱基基的的3侧侧，由由核核酸酸外外切切酶酶或或核核酸酸外外切切酶酶沿沿35方方向向切切除除核核酸酸链链，如如果果切切开开处处位位于于错错配配碱碱基基的的5侧侧

46、，则则由由核核酸酸外外切切酶酶或或Rec J沿沿53方方向向切切除除核核酸酸链链。在在此此切切除除过过程程中中，解解旋旋酶酶和和SSB帮帮助助链链的的解解开开。切切除除的的链链可可长长达达1000个个核核苷苷酸酸以以上上，直直到到将将错错配配碱碱基基切切除除。新新的的DNA链链由由DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶合成并连接。连接酶合成并连接。DNA的甲基化replicationFor a short period following replication,the template strand is methylated and the new strand is not.Hemimeth

47、ylated DNAMethylated DNADam methylases错配修复(寻找切割位点)Mut SMut L错配修复(寻找切割位点)Mut HMut H cleaves the unmodified strand错配修复（切除和合成）Mut SMut LMut HMutL-MutSDNA helicase exonuclease or RecJ nucleaseDNA polymerase SSBMutL-MutSDNA helicase exonuclease or exonuclease DNA polymerase SSB（二）直接修复 紫紫外外线线照照射射可可以以使使DNA

48、分分子子中中同同一一条条链链上上相相邻邻的的两两个个胸胸腺腺嘧嘧啶啶碱碱基基之之间间形形成成二二聚聚体体。其其它它嘧嘧啶啶碱碱基基之之间间也也能能形形成成类类似似的的二二聚聚体体，但但数数量量较较少少。嘧嘧啶啶二二聚聚体体的的形形成成，影影响响了了DNA的的双双螺螺旋旋结结构构，使其复制和转录功能均受到阻碍。使其复制和转录功能均受到阻碍。嘧啶二聚体的结构嘧啶二聚体的光复活直接解开嘧啶二聚体直接解开嘧啶二聚体O6-甲基鸟嘌呤的修复 O6-甲甲基基化化的的鸟鸟嘌嘌呤呤在在O6-甲甲基基鸟鸟嘌嘌呤呤-DNA甲甲基基转转移移酶酶作作用用下下，可可将将甲甲基基转转移移到到酶酶自自身身的的半半胱胱氨氨酸酸

49、残残基基上上。甲甲基基转转移移酶酶因因此此而而失失活活，但但却却成成为为其其自自身身基基因因和和另另一一些些修修复复酶酶基基因因转录的活化物，促进它们表达。转录的活化物，促进它们表达。（三）切除修复 切切除除修修复复就就是是在在一一系系列列酶酶的的作作用用下下，将将DNA分分子子中中受受损损伤伤的的部部分分切切掉掉，然然后后以以完完整整链链为为模模板板，合合成出切掉的部分，使成出切掉的部分，使DNA恢复正常的过程。恢复正常的过程。一一些些糖糖苷苷酶酶能能够够识识别别错错误误的的碱碱基基，将将这这些些碱碱基基水水 解解，使使 得得 这这 些些 部部 位位 无无 碱碱 基基（apurinic or

50、 apyrimidinic site），称称为为AP位位点点。一一旦旦AP位位点点形形成成，即即有有AP核核酸酸内内切切酶酶在在AP位位点点附附近近将将DNA链链切切开开，然然后后核核酸酸外外切切酶酶将将包包括括AP位位点点在在内内的的一一段段DNA链切掉。链切掉。DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶补上缺口。连接酶补上缺口。另另一一种种切切除除修修复复是是利利用用切切除除酶酶在在损损伤伤部部位位的的两两侧切开，除去错误片段，再合成出正确的序列。侧切开，除去错误片段，再合成出正确的序列。切除修复碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配 结构缺陷结构缺陷切掉错误碱基切掉错误碱基 N-N-糖苷酶糖苷酶 切开切开