干热处理对西瓜种子活力及细菌性果斑病灭菌效果影响的研究.docx

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1、干热处理对西瓜种子活力及细菌性果斑病灭菌效果影响的研究摘要随着农业产业化的加深，生产者对种子的质量要求越来越高，维权意识也不断增强。因此加强种子的安全生产对稳定社会经济秩序、保障国民生产尤为重要。广义的种子处理是指人们在农业生产过程中使用药剂浸种、拦种或是晒种等方法来提高种子的播种品质，保证种子发芽迅速整齐、幼苗生长健壮，防治病虫害，以此提高农作物的产量及增强其品质。狭义的种子处理就是在农业生产过程中采用物理、化学、生物等方法保护种子，防治病虫害，确保作物生长健壮，从而达到高产、高质。本文以含水量为7%左右的西瓜种子为研究材料，研究不同温度预缓冲处理对干热处理过程中种子活力的影响，以及干热处理

2、对西瓜种子活力和细菌性果斑病灭菌效果的影响。以探索西瓜种子高温干热处理前最佳的温度缓冲组合，及最佳的干热处理组合。关键词：干热处理；西瓜；种子活力；细菌性果斑病目录摘要1一、引言3二、干热处理对西瓜细菌性果斑病灭菌效果的影响3（一）材料与方法4（二）结果与分析6（三）讨论10三、不同缓冲处理对种子活力的影响11（一）试验材料11（二）试验方法11（三）结果与分析13（四）讨论16四、干热处理对种子活力的影响17（一）试验材料17（二）试验方法17（三）结果与分析20（四）小结25五、结论25参考文献27致谢29一、引言全世界西瓜的种植面积很大，西瓜病害一直是严重影响西瓜生产的重要因素之一，细菌

3、性果斑病作为典型的种传性病害，从种子这个源头上去防治病害的发生、传播对西瓜安全生产尤其关键。干热灭菌是目前农业上应用于种子生产加工的一种经济有效的方法，对杀死各种病原菌都有效。并且它不需经液体浸泡种子或药剂拌种，避免了药剂残留及毒性的问题，而且对种子生产加工来说节省了工序、成本。干热处理研究主要分干热处理对病原菌的灭菌效果和干热处理对种子活力的影响两部分，现有文献针对西瓜细菌性果斑病的有效干热处理的温度、时间组合研究较少，干热处理过程中种子活力变化的研究大多局限在简单的发芽趋势，而种子在不同温度、时间干热处理过程中，种子内部生理活性及耐贮藏性的变化研究鲜有报道。并且在对种子抗逆性的研究中发现，

4、在对种子进行高温处理前，对种子进行一定温度的缓冲能让种子较好地适应高温，而缓冲方式也有待进一步探索。因此本文旨在对以下三种进行研究和完善:（1）干热处理对种子内在生理及耐贮藏性的影响。（2）干热处理前不同缓冲预处理对种子活力的影响。（3）不同干热处理对细菌性果斑病的灭菌效果。由此探索干热处理与种子活力及灭菌效果的关系，从而对实际生产应用提供理论依据。二、干热处理对西瓜细菌性果斑病灭菌效果的影响西瓜细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch of watermelon，简称BFB)，它的病原菌属燕麦噬酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenge subsp .citrulli

5、，Aac)，是葫芦科植物上的一种严重的种传性检疫性病害，该病潜伏期长，传染力大，给农业生产带来严重损失，在生产中该病一旦爆发后药剂防治效果较差，目前还没有能彻底杀灭该细菌且不影响种子或植株生长的特效药剂。因此，从种子这个源头上去控制瓜类细菌性果斑的传播与发生显得尤其重要，干热灭菌是目前农业上应用于种子生产加工的一种经济有效的方法，对杀死各种病原菌都有效，它不需经液体浸泡种子或药剂拌种，避免了药剂残留及毒性的问题，并且对种子活力的影响也较小，是目前较为推崇的一种种子处理方法。本试验针对干热处理对西瓜细菌性果斑病灭菌效果的影响进行研究，探索出有效的干热灭菌方法，从而对实际生产应用提供理论依据。（一

6、）材料与方法1、试验材料本文研究中的西瓜种子为黑媚娘、红大(湖南省瓜类研究所提供)，供试菌株由湖南农业大学植保学院提供。2、试验试剂TaqDNA聚合酶、电泳缓冲液、dNTP, D2000 DNA Maker、DNA上下游引物，溟酚蓝、buffeTris, EDTA, NaCI, NH4P04, KCI, MgS047H20,酵母提取物、硼酸、琼脂、溴甲酚(bromcresol、亮蓝R( brilliant R)、乙醇、放线菌酮(Cycloheximide) ,硫代巴比妥酸(TBA、三氯乙酸、氢氧化钠。西瓜细菌性果斑病试剂盒。3、试验仪器电子天平(岛津ALTY220)凝胶成像分析系统(Gel L

7、ogic 212 PRO)PCR扩增仪(BIO-RAD C1000TM Thermal Cycler )紫外分光光度计(YK75290176)光照培养箱(宁波海曙赛福PRX-450L)冰箱(ZANUSSI)超净工作台(SW-CJ-2D)干燥箱(上海培因DHG-9070A)高压灭菌锅(上海申安LDZX-30FBS )SelectPette移液器电泳仪4、试验方法（1）制备带菌种子将继代活化的细菌性果斑病菌在LB平板培养基上划线培养，翻转培养基，在33恒温培养箱中培养3d-4d，将平板上的菌落用无菌水洗下，并稀释成浓度约108CFU/ml的菌悬液，即波长为600nm下吸光度为0.4左右的细菌个数。

8、将西瓜种子按1克种子:4m1菌悬液的比例浸泡，振荡2h (28, 180rmp)，再35烘干备用。（2）干热处理先将己接细菌性果斑病菌的种子烘干至7%左右的含水量，由于前期预备试验得出T2: 5012h为最好的预温缓冲处理，为保证干热灭菌条件的一致性，本章的灭菌效果试验均沿用T2: 5012h温度预缓冲。种子在仪器内进行预温缓冲处理后直接调至各温度、时间干热处理，对照为不进行干热处理的带菌种子。各干热处理如下:处理完后将种子置于干净的自封袋内密封，对其进行各项检测。5、干热处理灭菌效果的测定（1）EBB培养基配制:准确称取硼酸0.25g、酵母提取物0.3g,琼脂16g, NH4PO41g、Mg

9、SO47H2O0.2g, KCl0.2g、将PH值调至5.4左右，加入600L 15mg/ml澳甲酚、1 ml 10mg/ml亮蓝R，灭菌后冷至55，加10ml乙醇、2ml 250mg/ml放线菌酮，再倒入灭菌的培养皿中。每处理随机取100粒待测西瓜种子，放入100mI锥形瓶中，加入50mI无菌水充分浸泡，26, 160rmp振荡2h后，吸取1 ml菌悬液依次稀释102倍。再从102倍的稀释液中取100L在直径为9cm的EBB平板培养基上涂板，每处理5皿，以未进行干热处理的带菌种子为对照。在33的恒温箱内黑暗培养4d，记录菌落数。（2）育苗基质用160灭菌4h后，装后50孔的育苗盘中备用。将待

10、检测的西瓜种子播入育苗盘中，每孔1粒，每处理播100粒，设三次重复，未进行干热处理的带菌种子作为对照，置于28保湿盒内培养。等子叶展开后，观察叶片上有无油浸状或水浸状病斑出现，统计发病株数。（3）PCR检测此方法主要是在育苗检测及选择性培养基检测的基础之上，对疑似细菌性果病病斑症状的病叶及特征性菌落作进一步鉴定。引物序列：上游引物WFB 1: 5-GACCAGCCACACTGGGAC-3下游引物WFB2: (5-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3 ),用本引物PCR扩增产生360bp特异性条带。西瓜病叶总DNA使用CTAB法提取。检测菌落时，直接用移液枪沾取用少量无菌水稀释，稀释液即为模

11、板。扩增体系：10*PCR缓冲液5.0l2.5mM dNTP2l10mM上下游引物各1lTaqDNA聚合酶1.0lDNA模板4.0l无菌超纯水11l总体积为25l扩增条件为:95预变性5min;95变性40s，65退火lmin, 72延伸40s，循环35次;72延伸5min; 12保存。（4）双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)从待检西瓜种子中取50粒用20m1磷酸缓冲26、160rmp振荡2h后，取浸泡液2000r/min离心l0min，取上清液作为待检样品稀释液。其余操作步骤参照BFB检测试剂盒说明书。6、试验数据分析软件数据分析与软件使用SPSS分析软件，Excel WPS软件。（二）结果

12、与分析1、种子浸提液选择性培养基检测表2-1干热处理对细菌性果斑病的灭菌效果由表2-1显示两个供试品种黑媚娘与红大种子浸泡液经稀释103倍后，经EBB选择培养培养后，各干热处理对种带果斑病的灭菌效果明显。随着干热处理温度的升高及处理时间的延长，灭菌率增长明显。70干热处理条件下，各处理时间的灭菌率之间均有显著性差异，7024h干热处理条件下，媚娘与红大的灭菌率分别达为53.2%和31.4%，而随着处理时间延长到72h干热处理条件下，黑媚娘与红大的灭菌率分别达到了90.6%和89.5%，说明此温度条件下，延长灭菌时间对提高灭菌率效果非常明显。80干热处理条件下，随处理时间的延长，灭菌率变化不明显

13、，8024h干热处理条件下，黑媚娘和红大的灭菌率分别为93.7%和93.1%，8072h干热处理条件下，灭菌率分别为100.0%和99.9%，因此在使用80干热处理时，延长处理时间对提高灭菌率效果不明显，反而会大大降低了种子的活力。综合上表，7072h、7572h和80处理是适宜选择的干热灭菌处理组合，两试验品种灭菌率均达到了89.5%以上。图2-1细菌性果斑病在EBB培养基中的菌落形态2、育苗检测表2-2是将各类试验种子放入温室中，统计发病率结果。未经干热处理的带菌种子的发病率较高，两品种分别为33.0%和33.3%，随着处理温度的升高及处理时间的延长，种苗发病率呈下降趋势，并且各干热处理之

14、间差异明显。7572h, 8048h, 8072h处理发病率最低，黑媚娘分别为8.7%, 4.0%和1.0%，红大分别为11.3% , 8.7%和5.7%，与对照均有极显著性差异，说明干热处理对细菌性果斑病防治效果较好。表2-2干热处理对细菌性果斑病的灭菌效果图2-2发病西瓜苗图2-3发病组织中提取的疑似感病植株叶片PCR鉴定结果3、酶联免疫试剂盒检测表2-3酶联免疫检测结果显示，随着处理温度的升高及处理时间的延长，酶联免疫检测结果呈现逐渐由阳性转阴性。其中7572h, 8072h处理的酶联免疫结果均为阴性，其它处理结果三重复中有两个阳性以上，7024h处理全为阳性。说明干热处理对果斑病灭菌效

15、果显著。表2-3干热处理对细菌性果斑病的灭菌效果（三）讨论带菌种子浸提液半选择性培养基检测结果表明，不同组合干热处理对种子表面带菌的灭菌效果非常明显。7024h对黑媚娘、红大的灭菌率分别为53.2%, 31.4%，而8072h处理对种子的灭菌率分别高达100%, 99.9%。说明，干热处理的灭菌效果明显随着处理温度的升高及处理时间的延长而增加。育苗检测结果显示，西瓜种子经各干热处理后，发病率与对照相比基本都有极显著性差异。并且各干热处理组合之间发病率差异也显著。因此各干热处理对抵制果斑病的发病情况有较显著的效果。酶联免疫试剂盒检测效果与半选择性培养基的检测结果具有较好的验证效果。在7572h,

16、 8072h处理时，黑媚娘菌落数为最低，分别为1.7, 0.0个，而酶联免疫结果均为阴性，红大分别为4.7, 0.3,酶联免疫结果也均为阴性。因此7572h, 8072h处理对细菌性果斑病有非常好的防治效果。三、不同缓冲处理对种子活力的影响在针对较耐高温的细菌性果斑病进行灭菌处理时，试验中所设置的干热处理温度也较高。从生物体对外界环境适应的特征分析，在对种子进行高温干热处理前，预先对种子进行阶梯温度缓冲，理论上有利于增强种子对高温逆境的适应性，从而减少高温环境对种子活力的损伤。因此本试验以西瓜种子黑媚娘为材料，探究不同温度预缓冲条件对种子活力的影响，以筛选出适宜于西瓜种子干热处理的最佳缓冲条件

17、。（一）试验材料1、试验种子试验西瓜品种为黑媚娘。2、试验试剂培养皿、镊子、硫酸铜、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸、氢氧化钠、磷酸缓冲液、研钵、石英砂、油标卡尺、发芽纸，过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶试剂盒。3、试验仪器高速台式离心机(eppendorf 5415R )电子天平岛津AUY220 )酶标仪(DNM-9602A )紫外分光光度计(YK75290176)光照培养箱(宁波海曙赛福PRX-450L )冰箱(ZANLTSSI )干燥箱(上海培因DHG-9070A )高压灭菌锅(上海申安LDZX-30FBS )恒温水浴锅（二）试验方法1、种子缓冲处理种子高温千热灭菌处理前温度预缓冲

18、处理分三种:T1: 500h(对照组)，T2：5012h, T3: 5024h。此缓冲处理的作用主要是及让种子在进行高温干热处理前经历阶梯温度缓冲，以增强种子的适应能力。2、干热处理种子进行预温缓冲处理后直接将烘箱温度调到干热灭菌处理设定温度，进行以下处理，种子原始含水量为7%左右，直接将其放入烘箱内进行不同温度、时间干热组合处理，CK为不进行干热处理的种子。各干热处理组合A1-A9如下:处理完后将种子在20室温条件下置于饱合CaCl2溶液(RH=35%)的容器中回湿24h，再置于装有饱合NH4Cl (RH=70%)的密闭容器中回湿24h，最后置于装有水的密闭容器中回湿24h(RH=100%

19、)，再对其进行各项指标测。3、试验数据分析软件数据分析与软件使用SPSS分析软件，Exce12003软件。4、干热处理后种子活力检测指标（1）发芽率、发芽势、发芽指数处理后的种子均在15d内进行发芽试验。随机选取形态饱满、发育良好的种子100粒，设4个重复，用1%硫酸铜消毒5分钟。将种子均匀平铺在垫有1层发芽纸的毛巾中，毛巾事先充分湿润拧到合适的湿度，盖上一层湿润的发芽纸后合上毛巾，放置在30恒温箱中，每天计录发芽数，直到第14d为止。计算:Dt发芽日数，Gt与Dt相对应的每天发芽种子数与发芽日数。（2）种子抗老化特性的测定将西瓜种子置于温度45、相对湿度(RH)100%的条件下老化3d，得到

20、老化后的西瓜种子。具体做法参照郑晓鹰:在玻璃干燥器底部盛入3cm深的水，中层的白磁板用塑料网格替代，在网格上铺一层纱布，种子平摊于纱布上，然后盖上干燥器盖子。将干燥器置于45恒温箱中进行高温高湿老化处理，3d后取出种子对其进行活力测定。（三）结果与分析1、干热处理对种子发芽特性的影响图3-1不同缓冲处理对种子发芽率的影响由图3-1可得，三种缓冲在70处理与7524h处理时，它的趋势线基本重合，并且各处理之间与对照无显著性差异，说明在这几种干热处理条件下，几种缓冲对种子发芽率影响不大。7548h时T2缓冲处理发芽率为96.1%，比T1, T3分别高6.8%,1.9%，8024h处理时，T2比T1

21、高5.5%，相对其它各干热处理条件，这两个干热处理组合下，不同温度预缓冲对种子的发芽特性的影响差别相对较大，但也未达到显著性差异。图3-2不同缓冲处理对种子发芽势的影响由图3-2可知，三种不同缓冲处理对干热处理后西瓜种子的发芽势影响不同，T2缓冲处理总体发芽势最高，其次为T3, T1。70处理、75处理及8024h条件下T2与T3两种缓冲对其影响不大，与对照无显著性差异。8048h处理条件下T2比T1、T3分别高20.8%, 13.6%，并且T2与对照无显著性差异，T1, T3与对照有显著性差异。8072h干热处理条件下，T2比T1、T3分别高14.1%, 12.5%，T2与对照无显著性差异，

22、T1, T3与对照有显著性差异。图3-3不同缓冲处理对种子发芽指数的影响由图3-3可以看出，干热处理在一定程度上能促进种子的萌发速度，T2处理组的发芽指数均高于CK组，T1处理的发芽指数最低。T2缓冲时间比T1长，不仅使种子在进入高温干热处理前有个足够的温度适应过程，还能让种子自由水含量处于合理超干水平，这有助于增强植物个体的抗逆境能力。而T3处理比T2温度缓冲时间更长，而这一缓冲处理条件下，种子的发芽指数相较T2有所降低，这可能是由于50缓冲时间过长，对种子产生了不良影响。2、干热处理对种子抗老化特性的影响高温高湿人工老化种子的方法，老化中控制的条件比较接近于自然条件，其老化机理与自然老化机

23、理相似，两者之间的差别在于劣变速度不同。种子人工老化能预测种子耐贮藏性的这一特征，在多种类型的种子上也得到了试验证明。图3-4不同缓冲对种子抗老化性的影响图3-5不同缓冲对种子抗老化性的影响图3-6不同缓冲对种子抗老化性的影响由图3-4,图3-5和图3-6可知，三种缓冲处理对种子发芽特性的差异较大，其中T2种子发芽特性最好，其次T3, T1。7024h, 7048h处理，各缓冲对其影响差异不大，并且发芽率与对照无显著性差异。随着处理温度的升高及处理时间的延长，各缓冲处理之间的差异呈增长趋势。7072h处理条件下，发芽势T2比T3高16.9%，T2比T1高28.9%，发芽指数T2比T3高5.5

24、, T2比T1高11.32。75 48h与72h时，发芽势T2比TI, T3分别高39.8%, 37.4%。（四）讨论1、不同预缓冲处理对种子干热处理后发芽特性的影响三种不同缓冲T2最有利于保持种子活力。不同缓冲处理对种子发芽率的影响主要体现在80高温处理时，8024h处理时，T2比T1发芽率高5.5%，T3比T1高5.2%。三种缓冲对种子发芽势的影响比较明显，各个干热处理条件下，T2与T3都明显好于T1处理。而T2与T3之间在70, 75及8024h处理时，发芽势基本持平，说明在此干热处理条件下，T2, T3缓冲对其种子发芽势的影响无区别。8048h, 72h处理时，不同缓冲处理对其发芽势的

25、影响都比较大。种子发芽指数结果显示，75, 80条件下，T2与T3缓冲处理对种子的发芽指数影响区别较大，T2发芽指数明显高于T3。2、不同预缓冲处理对种子干热处理后抗老化特性的影响用种子人工老化来预测种子的耐贮藏性是被广泛应用的研究方法。从老化后的种子发芽状况来看，三种不同缓冲对其各个温度的干热处理活力影响区别都很大，方差分析结果显示不同缓冲对其种子老化后的发芽率、发芽势及发芽指数均有极显著性差异。T2缓冲处理后的种发芽状况最好，依次为T3, T1。但是不管何种缓冲处理的种子，老化后对其发芽状况的影响都很大，与对照差异明显，说明干热处理后的种子耐贮藏性受到了严重影响。四、干热处理对种子活力的影

26、响第二章的试验结果证明，试验所设置的干热处理条件对种带细菌性果斑病有明显的灭菌效果，第三章的试验结果在前人的基础上探索出适宜于种子干热处理的温度缓冲条件。为了使干热处理安全、有效地应用于实践生产，并且全面掌握干热处理条件与种子活力的关系，本试验对不同温度、时间干热处理过程中，种子内部生理活性及耐贮藏性的变化进行探索。（一）试验材料1、试验种子试验西瓜品种为黑媚娘。2、试验试剂培养皿、镊子、硫酸铜、硫代巴比妥酸(TBA、三氯乙酸、氢氧化钠、磷酸缓冲液、研钵、石英砂、油标卡尺、发芽纸，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT)试剂盒。3、试验仪器高速台式离心机(eppen

27、dorf 5415R)电子天平(岛津AUY220 )酶标仪(DNM-9602A )紫外分光光度计(YK75290176 )光照培养箱(宁波海曙赛福PRX-450L )冰箱(ZANUSSI )干燥箱(上海培因DHG-9070A )高压灭菌锅(上海申安LDZX-30FBS )恒温水浴锅（二）试验方法1、种子缓冲处理由前期试验得出T2: 50处理12h为最好的预缓冲处理，因此本章对比高温干热处理对种子活力影响的试验均采用T2: 50处理12h温度预缓冲。2、干热处理种子进行预备处理后处理后直接将烘箱温度调到各高温干热灭菌处理设定温度，进行以下处理，不处理的种子本身含水量为7%左右，直接将其放入烘箱内

28、进行不同温度、时间干热处理组合，CK为不经过干热处理的种子。各干热处理组合A1-A9如下:处理完后将种子置于干净的自封袋内密封，对其进行各项指标测定。3、试验数据分析软件数据分析与软件使用SPSS分析软件，Exce12003软件。4、干热处理后种子活力检测指标（1）发芽率、发芽势、发芽指数方法参考第二章。（2）种子抗老化特性的测定方法参考第二章。（3）电导率的测定选取大小一致剥壳了并且无机械损伤的种子40粒，取50ml玻璃容量，用去离子水清洗干净，侄置凉干。将种子放入玻璃容器中，加入20ml去离子水，测定浸泡初始值A1。容器口用薄膜盖好，以防灰尘污染和减少蒸发。再将容器置于28下放置2h,6h

29、, 8h, 12h，分别用电导仪测定其不同时间段的电导率A2，各时间段测定完后，将容器置于100水浴30min，冷却至室温后测定A3。测定时将容器中溶液稍微振荡，并且手放置于容器口，以免影响测定值。（4）MDA丙二醛采用硫代巴比妥酸法进行丙二醛的测定。取0.6g种仁加10ml 5%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨成匀浆，8000r、4条件下离心10min，取上清液4m1加0.67%硫代巴比妥酸(TBA) 4ml混合后100水浴15min冷却，再6000r离心1 0min，对照加4ml三氯乙酸代替上清液，取上清夜分别在532nm, 600nm和450nm下测定吸光值。MDA-TBA反应产物在5

30、32nm有最大吸收峰值，TBA可溶性糖反应产物的最大吸收峰值在450nm。计算MDA的浓度:（5）SOD超氧化物歧化酶采用氮兰四(NBT)法测定SOD活性。称取0.6g剥了壳的西瓜种仁，按重量(g):(ml) =1: 9的比例，加入9倍体积的磷酸缓冲液(0.1ml/L PH7.4)及少量石英砂冰浴研磨成匀浆，再5000r/min离心l0min，取上清液再次离心，再稀释成合适的浓度进行实验，实验方法参照试剂盒说明书操作。37反应20分钟后，取反应液在450nm处读数。计算公式：（6）POD过氧化物酶采用愈创木酚法进行测定。称取0.6g剥了壳的西瓜种仁，按重量(g): (ml) =1:9的比例，加

31、入9倍体积的磷酸缓冲液(0.1 ml/L PH7.4 )及少量石英砂冰浴研磨成匀浆，再5000r/min，离心l0min，取100L上清，按试剂盒说明书操作表进行操作，37水浴反应30min，反应完成后，混匀再离心，取上清液于470nm处，测定OD值。计算公式：（7）CAT过氧化氢酶采用钥酸按法进行测定。称取0.6g剥了壳的西瓜种仁，按重量(g): (ml)=1:9的比例，加入9倍体积的磷酸缓冲液(0.1 ml/L PH7.4 )及少量石英砂冰浴研磨成匀浆，再5000r/min，离心l0min，取上清液再次离心，试验操作完成后取反应液于405nm处，双蒸水调零，测定各管吸光度。计算公式：（三）

32、结果与分析1、干热处理对种子当下发芽特性的影响表4-1为种子干热处理后15天内进行的发芽试验结果。由上图可知各干热处理对种子的发芽率、发芽势和发芽指数与对照相比无显著性差异，说明本试验的干热处理温度、时间对种子当下的发芽特性并无影响。这可能由于种子在萌发过程中具有极强的自我修复能力，并且种子随时间劣变的程度并不深，因此当下对其进行发芽试验后，种子并未表现出明显的活力受损迹象。表4-1干热处理对种子发芽的影响2、干热处理对种子抗老化特性的影响高温高湿人工老化种子的方法，老化中控制的条件比较接近于自然条件，其老化机理与自然老化机理相似，两者之间的差别在于劣变速度不同。种子人工老化能预测种子耐贮藏性

33、的这一特征，在多种类型的种子上也得到了试验证明。表4-2结果表明，随着干热处理温度的升高及处理时间的延长，西瓜种子种子人工老化后的各项发芽指标明显呈下降趋势，80处理下降速度最快。7548h, 72h和80处理的发芽率与对照有显著性差异，并且8048h, 72h处理与对照91.0%相比发芽率分别下降19.4%, 28.5%，达极显著性差异。7572h和8048h, 72h处理的发芽势与对照87.3%相比分别下降22%, 26.2%和33.5%，达极显著性差异。各干热处理发芽指数下降幅度非常明显，除7048h, 7072h外与对照均达极显著性差异。7572h与8072h处理分别比对照发芽指数降低

34、14.5(34.4%) , 19.9(47.6%)。70和80不同处理时间之间发芽特性无显著性差异，8072h处理与24h和48h处理间有极显著性差异，说明当80干热处理时间延长到72h时，对种子活力的损伤非常大。表4-2干热处理后的种子老化3d后对种子发芽特性的影响3、干热处理对种子浸出液电导率的影响图4-1干热处理对种子浸出液电导率的影响图4-2干热处理对种子浸出液电导率的影响种子受到高温逆境伤害时，细胞膜的结构和功能受到破坏，膜透性增加，从而会向溶液中渗透出较多的电解质。因此，通过测定种子浸出液的相对电导率，能反应出种子活力的高低，并且，电导率与种子活力负相关。图4-1, 4-2结果表明

35、，随着干热处理温度的的升高及处理时间的延长，种子浸出液相对电导率呈升高的趋势。8072h处理的的相对电导率明显高于其它各处理，说明膜受到的损伤最大。接着电导率较高的为7048h, 7072h, 7572h, 8048h，这四个处理相对电导率相差不大，后三个处理趋势线几乎重合。7024h, 7524h及对照趋势线在最底层，相对电导率最低，并且随着浸泡的延长，相对电导率缓慢上升，坡度较小，说明其膜的完整性保持得较好。种子浸泡2h, 4h和6h时，除8072h外，其它各处理之间的电导率相差很小，随着浸泡时间的延长，各处理之间的相对电导率值相差越来越大，并且处理温度越高、处理时间越长的组合，趋势线坡度

36、越陡，说明种子浸出液中细胞的内含物质外渗量增加，种子内部细胞膜损伤越厉害。4、干热处理对种子超氧化物歧化酶(SOD)的影响图4-3表明，西瓜种子在70, 75温度干热处理时，随着处理时间的延长，SOD酶呈增长趋势，并且各处理组合酶活性均高于对照，7072h与7524h, 48h, 72h处理的的酶活性与对照1225.5U/ml相比，分别升高26.2%. 20.8%, 22.0%和39.3%均达显著性差异。8048h处理比24h处理SOD酶活性增长18.7%，有显著性差异。8048h处理与72h处理SOD酶活性趋于平衡，分别为1480.9U/mgprot和1437.1U/mgprot，与对照相比

37、分别上升20.8%和17.3%，并且与对照达显著性差异。图4-3干热处理对种子SOD酶的影响西瓜种子由于高温的影响，脂质过氧化作用逐渐增强，种子内部生理机能为抵抗高温对种子的伤害，通过提高自身的SOD酶活性来催化超氧物阴离子自由基发生的歧化反应，生成H2O2和O2，从而消除O2-，降低对种子的伤害。因此在70, 75和80处理时，随着处理时间的延长，SOD酶活性都呈现了上升的趋势。这与娜荷雅的结论一致。5、干热处理对种子过氧化物酶(POD)活性的影响图4-4干热处理对种子POD酶的影响由4-4图可知，随着干热处理温度的升高和干热处理时间的延长，POD酶活性总体呈现先上升后下降的过程，70和75

38、各处理组合间，酶活性基本维持在一个比较平衡的水平，与对照806.7U/mgprot无显著性差异，8024h, 48h处理POD酶含量较高，分别为922.2U/mgprot, 917.8U/mgprot，与对照相比分别上升了14.3%. 13.8%。当80处理时间延长到72h时，POD酶活性突然下降到 602.2 U/mgprot，与8048h处理相比，下降了34.4%，并且两者之间有极显著性差异。西瓜种子内部的脂质过氧化作用随着处理温度的升和处理时间的延长而逐渐增强，种子内部生理机能通过提高自身的POD酶活性来清除H2O2，降低对种子的伤害。随着处理时间的延长，使得种子内活性氧产生和消除的平衡

39、被破坏，有害物质积累。导致POD抗氧化酶活性减弱含量降低，因此在8072h时，POD酶活性突然下降。6、干热处理对种子过氧化氢酶(CAT)活性的影响CAT是过氧化物酶体的标志酶，它可促使H2O2分解为O2和H2O，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。由图4-5可知，70,75干热处理随着处理时间的延长，CAT酶含量总体呈上升趋势，80干热处理，CAT酶活性随着处理时间的延长先上升后下降。7048h与72hCAT酶含量基本一致，并且与7024h处理有显著性差异。75各处理时间之间无显著性差异，8024h, 48h和72h处理之间CAT酶活性有显著性差

40、异，依次为2428.5mgprot/ml,3185.7mgprot/ml和2834.4mgprot/ml，CAT酶活性先升高后降低，可能是由于种子受到逆境伤害时，种子内部生理机能通过提高自身的CAT酶活性来清除H2O2等物质，随着逆境伤害的持续加深，使得种子内活性氧的产生和消除平衡被破坏，有害物质积累。导致CAT抗氧化酶活性减弱含量降低，因此在8072h时，CAT酶活性突然下降。图4-5干热处理对种子CAT酶的影响7、干热处理对种子丙二醛(MDA)含量的影响种子在遭受高温逆境伤害时，细胞的脂质氧化程度加深，膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量增加，因此可通过种子内丙二醛的含量来指示种子内膜脂过氧

41、化程度。MDA能强烈地与细胞内各种成分发生反应，从而引起对酶和膜的严重损伤，最终导致了膜的结构及生理完整性的破坏。图4-6干热处理对种子MDA的影响随着干热处理温度的升高及处理时间的延长，MDA含量呈现上升趋势，对照MDA含量最低。7072h与24h, 48h有显著性差异，分别比24h, 48h高38.3%, 31.7%。75和80处理对种子内部MDA含量与对照均有显著性差异。75各处理之间无显著性差异，依次分别为0.147umol/L, 0.151umol/L和0.155umol/L。80各处理对种子MDA含量的影响差异较大，72h分别比24h, 48h处理高 35.8%, 17.0%，说明

42、在此温度条件下，处理时间对种子活力的影响的差异非常明显。48h条件下，70, 75和80处理的MDA含量分别为0.126umol/L, 0.151umol/L和0.188umol/L, 70, 75之间无显著性差异，70, 75与80处理之间有显著性差异，说明相较其它两温度处理，80处理对种子的损伤的非常大。（四）小结种子酶活性的这一变化与种子当下及老化后的发芽特性规律有所不同。各干热处理组合种子当下的发芽状况与对照相比均无显著性差异，这可能由于种子在萌发过程中具有极强的自我修复能力，并且种子随时间劣变的程度并不深，因此在对其进行发芽试验后，种子并未表现出明显的活力受损迹象。而种子老化后的萌发

43、状况，随着处理温度的升高及处理时间的延长呈现明显下降趋势，这由于老化过程将种子自身微小的生理机能缺陷累积放大，因此老化后各千热处理组合能呈现明显的差异性。五、结论1、干热处理对种带细菌性果斑病灭菌效果的影响干热处理对种子表面带菌的灭菌效果非常明显。随着处理温度的升高及处理时间的延长，灭菌效果明显增强，酶联免疫结果逐渐由阳转阴，细菌性果斑病的发病率也呈明显降低的趋势，黑媚娘西瓜种子在7072h、7072h和8072h处理对种子表面的灭菌率分别高达90.6%, 99.4%和100%。2、不同缓冲处理对西瓜种子发芽特性和抗老化能力的影响以含水量为7%左右的黑媚娘西瓜种子为试验材料，探索种子干热处理前

44、最佳的缓冲处理条件。结果表明:5012h缓冲处理的种子发芽特性及抗老化能力比5024h和500h明显要好，说明5012h是适宜用于种子干热处理前最佳的温度缓冲处理组合。3、干热处理对西瓜种子活力的影响70、75干热处理条件下，随着处理时间的延长，抗氧化酶活性、MDA含量及种子浸出液相对电导率呈逐渐上升的趋势。80在各处理时间条件下CAT, POD活性分别呈现先上升后下降、缓慢下降的趋势，可能80干热处理时，高温胁迫程度深，种子首先能通过提高自身抗氧化酶来清除氧化物质的伤害，而随着处理时间的延长，逆境肋、迫程度的进一步增加，并且抗氧化酶系统长期处于消耗状态，因此其活性又逐渐降低。70, 75和8

45、0干热处理后的种子内在生理的一系列变化并未影响到种子的发芽特性，在同一时期(种子干热处理后15天内)对种子进行的发芽试验表明，各干热处理组合对种子发芽特性均无影响，与对照相比均无显著性差异，可能由于种子在萌发过程中有较强的自我修复能力，因此，种子的发芽特性并未呈现出差异性。而干热处理后种子的抗老化试验结果表明，随着干热处理温度的升高及处理时间的延长，种子老化后的萌发活力随之也降低，70各时间处理及7524h处理降低幅度较小，与对照相比发芽率、发芽势均无显著性差异，80各时间处理及75 48h. 72h处理的种子萌发活力受到严重影响，与对照均有显著性差异。说明干热处理影响了种子的耐.贮藏性，因此

46、不宜久放，需当年种植。因此综合分析干热处理对种子活力及灭菌效果的影响，7072h处理是适宜于西瓜种子细菌性果斑病干热灭菌处理的最佳组合。本试验结果为干热处理广泛应用于实践提供了理论依据。参考文献1 牛庆伟,孔秋生,黄远,别之龙. 不同药剂处理对西瓜细菌性果斑病带菌种子的影响J. 长江蔬菜. 2012(22) 2 宋顺华,吴萍,郑晓鹰,丁海凤. 干热处理对蔬菜种子质量的影响及其杀菌效果研究J. 河南农业科学. 2011(04) 3 熊亮斌,刘箐,王天昌,高丽萍,王婧,刘姝彤,宋蕤,施颖波,王军平,文朝慧. 改良DAS-Dot-ELISA检测西瓜细菌性果斑病菌J. 微生物学通报. 2010(10)

47、 4 张洁,郭数进,马金虎. 高温老化处理对棉花种子抗逆酶活性的影响J. 山西农业科学. 2010(04) 5 周玉亮. 莲金属硫蛋白和热激蛋白基因在种子活力中的功能分析D. 中山大学 2011 6 楚璞. 莲膜联蛋白的鉴定及其在种子耐热性和活力中的功能研究D. 中山大学 2011 7 吴宇芬,陈晟,张伟光. 福建高山西瓜产业发展现状与对策J. 中国瓜菜. 2013(04) 8 贾宋楠,王惠林,郑健,高强. 籽用西瓜种质资源对细菌性果斑病的抗性鉴定J. 新疆农业科学. 2013(05) 9 宋顺华,吴萍,孟淑春,宫国义,邢宝田. 种子处理对西瓜细菌性果斑病的防治效果J. 中国瓜菜. 2013(03) 10 李桂玲,刘刚. 甘草酸提取及抑菌活性研究J. 现代商贸工业. 2013(08) 11 张兴,吴志凤,李威,马志卿,冯俊涛. 植物源农药研发与应用新进展特殊生物活性简介J. 农药科学与管理. 2013(04) 12 牛庆伟,孔秋生,黄远,别之龙. 不同药剂处理对西瓜细菌性果