阿司匹林与华法林联用在大鼠体内的药效学实验.doc

《阿司匹林与华法林联用在大鼠体内的药效学实验.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《阿司匹林与华法林联用在大鼠体内的药效学实验.doc（9页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、阿司匹林与华法林联用在大鼠体内的药效学研究摘要：目的：研究阿司匹林与华法林联用在大鼠体内的疗效。方法：取购买于我校动物中心的成年SD雄性大鼠45只，体重180-200g之间，随机分为三组：空白组、单用华法林组、阿司匹林与华法林联用组。三组均灌胃7天，空白组灌服生理盐水，单用华法林组灌服华法林（0.2mg/kg)），联用组灌服阿司匹林（10mg/kg）+华法林（0.2mg/kg）。七天后腹主动脉采血法测定三个药效学指标：血小板聚集抑制率、凝血酶原时间和国际标准化比值、血小板胞内Ca2+i。结果：SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测定，血小板聚集功能：空白组血小板聚集抑制率0.5%，单用华法林组血小板

2、聚集抑制率23%，阿司匹林+华法林组血小板聚集抑制率58%，三组比较差异有统计学意义，P0.05；凝血酶原时间和国际标准化比值：空白组凝血酶原时间16.7s，国际标准化比值1.04；单用华法林组凝血酶原时间20.1s，国际标准化比值1.42；阿司匹林+华法林组凝血酶原时间23.8s，国际标准化比值1.67，三组比较差异有统计学意义，P0.05。血小板胞内Ca2+i测定：空白组血小板胞内Ca2+i (57.613.1)nmol/L；单用华法林组血小板胞内Ca2+i(43.412.5)nmol/L；阿司匹林+华法林组血小板胞内Ca2+i(32.611.3)nmol/L，三组比较差异有统计学意义，P

3、0.05。结论：阿司匹林与华法林联用抗凝作用优于单用华法林组，可以用于凝血功能严重亢进，单用华法林无法有效控制的患者中，可以取得较好的抗凝效果，但是同时应注意两要联用后的出血倾向，在实际应用中视具体情况而选择药物配伍。关键词：阿司匹林 华法林 Abstract: Objective: To study of aspirin and warfarin Lin Lian in the rat in vivo efficacy. Method: take the purchase in our animal center of adult male SD rats45, weight180-200g

4、, were randomly divided into three groups: blank group, single use of warfarin group, aspirin and warfarin Lin Lian group. The three groups were gavage for 7 days, the blank group gavage ns, single use of warfarin group orally warfarin (0.2mg / kg ) ), combination group gavage of aspirin (10mg / kg

5、) + warfarin (0.2mg / kg ). Seven days after abdominal aortic blood sampling method for the determination of three pharmacodynamic index: inhibition of platelet aggregation rate, prothrombin time and international normalized ratio, platelet intracellular Ca2 + i. Results: SD rats by gavage for 7days

6、 after abdominal aortic blood collection for determination of platelet aggregation function: blank group, inhibition of platelet aggregation rate 0.5%, single use of warfarin group platelet aggregation inhibition rate 23%, aspirin plus warfarin group inhibition of platelet aggregation rate was 58%,

7、there was significant difference between three groups, P 0.05; prothrombin time and the international normalized ratio: blank group16.7s prothrombin time, international normalized ratio1.04; single warfarin group20.1s prothrombin time, international normalized ratio1.42; aspirin plus warfarin group2

8、3.8s prothrombin time, international normalized ratio1.67, three groups had a significant difference, P 0.05. Platelet cytosolic Ca2+ I determination: blank group of platelet cytosolic Ca2+ I (57.6 +13.1) nmol / L; single warfarin group of platelet cytosolic Ca2+ I (43.4 +12.5) nmol / L; aspirin plu

9、s warfarin group of platelet cytosolic Ca2+ I (32.6 +11.3) nmol / L, there was significant difference between three groups, P 0.05. Conclusion: aspirin and warfarin anticoagulation effect of Lin Lian is better than that of the warfarin group, can be used for coagulation function in severe hyperparat

10、hyroidism, single use of warfarin in patients unable to effectively control, can obtain good anticoagulant effect, but also should pay attention to two to be combined with the bleeding tendency, in the practical application of the specific circumstances choice of drug compatibility.Keywords：Aspirin

11、Warfarin 华法林是一种临床常用的香豆素类口服抗凝药，通过抑制肝脏的羧基化酶的作用，使维生素K依赖的部分凝血因子保持在其无活性的前体状态1，同时，华法林还可以诱导肝脏主动产生无活性的凝血因子前提，从而抑制凝血，发挥抗凝作用。阿司匹林主要抑制血小板的活性，还有一定的抗血栓的作用。其作用机制是通过与环氧化酶的丝氨酸位点结合，从而阻断了底物与环氧化酶的催化位点结合，引发环氧化酶的永久性的失活。进而抑制血小板产生血栓素A2（TXA2），永久性抑制血小板的活性，直到血小板重新生成。在内皮细胞内具有抗栓活性的PGI2，阿司匹林对其功能影响不大，故当小剂量的使用阿司匹林时，将发挥抗栓作用。已有大量的临

12、床研究证明，对于心血管疾病的抗凝治疗主要针对的应为凝血途径，而不是血小板途径，因此对于心血管疾病的抗凝显然不能单用阿司匹林，目前较多使用阿司匹林与华法林联用治疗凝血亢进疾病。但是，在阿司匹林与华法林联用增加抗凝作用的同时，有可能引起凝血功能障碍导致出血，故阿司匹林与华法林的联用需根据具体情况而定2。本文主要分析阿司匹林和华法林在大鼠体内联用的药效学作用，具体报告如下。1.资料与方法1.1一般资料取购买于我校动物中心的成年SD雄性大鼠45只，体重180-200g之间，随机分为三组：空白组、单用华法林组、阿司匹林与华法林联用组。1.2方法三组均灌胃7天，空白组灌服生理盐水，单用华法林组灌服华法林（

13、0.2mg/kg)），联用组灌服阿司匹林（10mg/kg）+华法林（0.2mg/kg）。七天后腹主动脉采血法测定三个药效学指标：血小板聚集抑制率、凝血酶原时间和国际标准化比值、血小板胞内Ca2+i。1.2.1血小板聚集功能1）富血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆（PPP）的制备 将灌胃后大鼠抽血于3.8%枸橼酸钠抗凝管内，800rpm离心6min得上清液即为富血小板血浆（platelet-rich plasma, PRP），剩余血液继续离心2000rpm10min得贫血小板血浆(platelet-poor plasma, PPP)，用PPP调PRP血小板数为3108/ml。2）Born比浊法测

14、定血小板聚集功能 于比浊管内加入500l PPP调零(100%)，同样取500l PRP，放入另一比浊管中，37预热2 min，加入诱导剂ADP，在电磁搅拌下观察并记录5 min内血小板聚集情况，记录血小板最大聚集率。按公式计算聚集抑制率：血小板聚集抑制率（%）=（对照组血小板聚集率 给药组血小板聚集率）/正常对照血小板聚集率 100% 。1.2.2凝血酶原时间的测定和国际标准化比值的计算将冷冻保存的血浆解冻，取0.1 mL，37水浴预热3分钟，迅速加入预热的PT试剂0.2 mL，混匀后立即计时，记录凝血丝出现的时间，每个血样重复测定两次，两次测定差值应在2S之内，取平均值，即为PT值。另取未

15、用药大鼠6只，测得其血浆PT值的均值为s，作为正常值(PTnor)，与用药大鼠的PT实验值(PTexp)一同用于INR的计算：INR=（PTexp/PTnor）ISI，其中 ISI(International Sensitive Index)为国际敏感度指数，其值为1.85。 1.2.3血小板胞内Ca2+i测定1）洗涤血小板悬液的制备 取1.1项方法制备的PRP，加1/4体积的ACD缓冲液（44mM枸橼酸钠，20mM柠檬酸，74mM葡萄糖，pH5.0），离心得片状沉淀，用洗涤液（113mM NaCl，4mM KCl，24mM NaH2PO4，4mM Na2HPO4，0.2mM EGTA，0.1

16、%葡萄糖，pH6.1）洗涤，离心1500rpm10min，Hepes-Tyrode液（134 mM NaCl，12 mM NaHCO3，0.34 mM NaH2PO4，2.9 mM KCl，1 mM CaCl2，0.8 mM MgCl2，5 mM HEPES，5 mM 葡萄糖 pH 7.4）悬浮，调整血小板密度为2108/ml。2）负载血小板悬液（Fura-2 platelet supension,FPS）的制备 将血小板悬液加入Fura-2/AM（荧光染料），使其终浓度为5M，37恒温避光温育45min，使Fura-2/AM载入细胞内，将已负载的血小板悬液离心2000rpm10min，去掉上

17、清液，用洗涤液洗涤2遍后用Hepes-Tyrode液重新悬浮。调整血小板数至2108/ml，测定荧光强度。3）血小板胞内Ca2+i测定 应用岛津RF-5301PC荧光分光光度计作波长扫描，发射波长（Em）于500nm，扫描负载血小板悬液的激发波长，如激发波长（Ex）波峰由380nm移至340nm，表明Fura-2/AM已负载酯解进入细胞内，可作Ca2+i荧光测定。测定时Em为500nm（波宽10nm），Ex分别为340nm和380n（波宽5nm），波长变换时间间隔为2 s 。按以上参数执行双波长测定，测定分组：分为静息态和激活态（加入PAF，终浓度0.75ug/ml），静息态和激活态均包括0.

18、9%氯化钠注射液组（NS组）和给药组。应用荧光比值法连续描记静息态和激活态的荧光强度比值（F340/F380）变化以及最大荧光强度比值（Rmax），最小荧光强度比值（Rmin）。钙离子浓度计算基本公式：Ca2+i = Kd(R-Rmax)/(Rmin-R)(S1/S2)。公式中Kd是Fura-2与Ca2+反应的解离常数，37时为224nmol/L；Rmax是胞外游离钙为1mmol/L时，加入Triton X-100（10%）破膜剂使Fura-2被Ca2+全部饱和时所测得的荧光比值；Rmin是Fura-2所结合Ca2+被EGTA全部螯合时的荧光比值。S1和S2分别为零Ca2+和Ca2+饱和时，在

19、Ex 380nm测得的荧光强度。1.3统计学方法使用统计学软件spss18.0对所得数据进行统计学分析，计数资料采用x2检验，计量资料采用t检验，P0.05为有显著性差异。2.结果2.1血小板聚集功能SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测血小板聚集功能，其中空白组血小板聚集抑制率0.5%，单用华法林组血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+华法林组血小板聚集抑制率58%，三组比较差异有统计学意义，P0.05。2.2凝血酶原时间及国际标准化比值SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测凝血酶原时间和国际标准化比值，其中空白组凝血酶原时间16.7s，国际标准化比值1.04；单用华法林组凝血酶原时间20.1s，国际标准化

20、比值1.42；阿司匹林+华法林组凝血酶原时间23.8s，国际标准化比值1.67，三组比较差异有统计学意义，P0.05。2.3血小板胞内Ca2+i测定SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测凝血酶原时间和国际标准化比值，其中空白组血小板胞内Ca2+i (57.613.1)nmol/L；单用华法林组血小板胞内Ca2+i(43.412.5)nmol/L；阿司匹林+华法林组血小板胞内Ca2+i(32.611.3)nmol/L，三组比较差异有统计学意义，P0.05。表：三组药效学比较组别只数血小板聚集抑制率凝血酶原时间（s）国际标准化比值血小板胞内Ca2+i（nmol/L）空白对照组150.5%16.71.04

21、57.613.1单用华法林组1523%20.11.4243.412.5阿司匹林+华法林组1558%23.81.6732.611.3P150.050.050.050.053 讨论3.1华法林3.1.1华法林的药理作用华法林是一类发挥间接作用的抗凝药物，其本质为香豆素类。华法林通过抑制维生素K从而阻断在肝脏细胞内进行的凝血因子的合成过程，其可具体抑制凝血因子、以及凝血因子来达到抗凝的效果。肝脏细胞内的凝血因子合成过程必须有羧基化酶参与，通过其将凝血因子所含的谷氨酸转化为-羧基谷氨酸，后者再与钙离子结合，生成有活性的凝血因子3。华法林正是一种羧基化酶的抑制剂，直接切断肝脏中的凝血因子生产流水线，使凝

22、血因子保留在其无活性的前提状态。华法林对于已经活化了的凝血因子并无作用，所以其药效的产生较慢，只有当原本有活性的凝血因子耗尽，才发挥抗凝作用。此外，华法林可以诱导肝脏产生一种维生素K的依赖性的凝血因子前体，该物质具有与凝血因子相同的抗原性，但是不仅无凝血功能，反而具有一定的抗凝效果，同时可以降低血小板的聚集反应。总的说来，在服用华法林后，可以使体内活性凝血因子减少，无活性的凝血因子前体物质增加，从而发挥凝血效应。3.1.2 华法林的监测华法林影响外源性凝血因子VII的活性，口服华法林后通过监测其对外源性凝血系统的影（凝血酶原时间，PT）来调整剂量。临床使用标准化化了的PT，即国际标准化比值(I

23、NR)来调整华法林的用药剂量。INR=PTRISI，其中ISI为国际敏感指数，代表凝血活酶的促凝活（敏感性）；PTR为受试者PT与正常血浆PT的比值。3.2 阿司匹林3.2.1阿司匹林的药理作用阿司匹林于十九世纪在德国问世，其作为一种风湿治疗药物，已经有100多年的历史。在最初的半个世纪，阿司匹林主要被用于消炎镇痛方面，但是总是伴随着出血的副作用，后来经过许多研究，人们终于弄清出血的缘由是因为阿司匹林可以有效的抑制前列腺素的合成，阻止血栓素A2的活化，从而产生抗血小板聚集作用4。在一般的血栓产生的部位，血小板产生活化，引起其胞内的Ca2浓度的升高，细胞膜的磷脂释放产生花生四烯酸，进而在环氧化酶

24、的作用下，其转化为前列腺素。血小板通过血栓转换酶的作用，产生了具有强大血小板活化作用的TXA2，引发血小板的自身活化和聚集，最后形成血凝块。阿司匹林正是作用于这一天血块形成路径，阻碍了其中的环氧化酶的机能，抑制血小板表面的稳定性，从而抑制血小板血栓的形成。阿司匹林靠近环氧化酶的活性中心的丝氨酸，通过其自身所具有的乙酰基发生乙酰化，进而发挥抗血小板的作用，其中十分重要的一点是，阿司匹林的抗血小板功能不可被逆转。血小板是一种无核细胞，其酶的作用一旦不可逆转的被阿司匹林逆转，不会产生新的酶来补充，也就是说阿司匹林发挥的药效等于血小板的寿命。3.2.2 阿司匹林服用剂量ATC研究对不同剂量的阿司匹林在

25、预防严重心脑血管事件方面的疗效进行了荟萃分析，证实阿司匹林的长期使用最佳剂量为75150 mgd1引，增加阿司匹林的剂量并不能增强其抗血小板的功效而不良反应增加，剂量过小(75 mgd)时，疗效不确定。长期服用小剂量(75150mgd)阿司匹林，能够获得相对最佳的耐受性和疗效。在急性期，为了快速抑制血小板聚集，应该给予150300rng负荷剂量，肠溶片剂应该嚼服。3.3 阿司匹林与华法林联用从上文中得出的结果所示：SD大鼠灌胃7天后腹主动脉采血测定，血小板聚集功能：空白组血小板聚集抑制率0.5%，单用华法林组血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+华法林组血小板聚集抑制率58%，三组比较差异有统计学

26、意义，P0.05；凝血酶原时间和国际标准化比值：空白组凝血酶原时间16.7s，国际标准化比值1.04；单用华法林组凝血酶原时间20.1s，国际标准化比值1.42；阿司匹林+华法林组凝血酶原时间23.8s，国际标准化比值1.67，三组比较差异有统计学意义，P0.05。血小板胞内Ca2+i测定：空白组血小板胞内Ca2+i (57.613.1)nmol/L；单用华法林组血小板胞内Ca2+i(43.412.5)nmol/L；阿司匹林+华法林组血小板胞内Ca2+i(32.611.3)nmol/L，三组比较差异有统计学意义，P0.05。可见，阿司匹林与华法林联用，在血小板抑制率，凝血酶原时间和国际标准化比

27、值及血小板胞内Ca2+浓度方面，均优于单用华法林组，两要联用使抗血小板作用与抗外源性凝血途径作用结合，在临床上可以发挥更强的抗凝作用，可以应用于单用华法林无法控制的顽固性高凝状态患者。但是血小板系统及凝血因子的功能同时被抑制，增加了用药后的出血风险，从结果中可以看出，两药联用后，凝血酶原时间显著增加，血小板抑制率大幅上升，当应用于患者身上时，有可能导致患者由高凝状态转变为凝血功能不足，引发出血，甚至危及生命5。从本文的结果中，我们可以得知，对于不同药理的药物配伍使用，应当结合具体情况，在使用过程中密切监测患者血液系统指标，以期达到在药物的作用下，患者凝血指标值基本保持在正常范围内。阿司匹林与华

28、法林的联用已有多年的研究历史，但是由于在临床使用时无法把握好使用的比例和联用时机、时间，导致两药联用收到限制。只要正确的了解阿司匹林与华法林的药理特性，密切监测联用时的血液学凝血系统指标，两药的联用必将成为各类凝血系统亢进疾病的有效治疗方式。参考文献：1 莫卫民 景华，陈冰等.心脏瓣膜置换病人口服华法林后的对映体药动学研究J中国药学杂志，2007，32(3)：522 XU MGDecreased circulating endothelial progenitor cell function：relationship with serum concentrations of high-sens

29、itivity C-reactive protein in children with Kawasaki diseaseJZhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi，2010，12(7)：5135173 陈修，陈维洲，曾贵云心血管药理学人民卫生出版社，2009：5694 Benjamin EJ，Levy D，Vaziri SM，et a1Indenpedent risk factors for atrial fibrillation in a populationbased cohoaThe Framingham heart studyJAMA，2008，271：84O-8445 Lip GY，Edwards SJStroke prevention with aspirin，warfarin and ximelagatran in patients with nonvalvular atrial fibrilation：asystematic review and metaanalysisThromb Res，2009，1 18(3)：32l_333