不同抑制剂对果汁多酚氧化酶活性的影响 (2).docx

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1、不同遏抑剂对果汁多酚氧化酵素活性的影响摘要为探究不同生化褐变缓聚剂对智慧果生物催化剂（多酚催化酵素）活性的遏抑机制，采用磷酸缓冲液构建智慧果汁模拟系统，选取智慧果中含量较多的酚类物质绿原酸作为实验对象，以磷酸缓冲液为智慧果汁模拟系统，选取己基间苯二酚（）、乙二酸、安息香酸和对甲氧基安息香酸为缓聚剂，通过模拟实验探究缓聚剂对绿原酸模拟智慧果汁酵素生化褐变特性的影响，揭示缓聚剂对智慧果汁多酚催化酵素的作用机制。结果表明，缓聚剂对多酚催化酵素的遏抑机制差异较大，其中和乙二酸对多酚催化酵素的遏抑作用为竞争性遏抑，植酸为混合性遏抑，而安息香酸为非竞争性遏抑。该探究可为利用缓聚剂控制智慧果汁生化褐变提供理

2、论依据。:以邻苯二酚为底物,对澳洲青苹中的生物催化剂进行了探讨。分别探究了pH值、温度、底物浓度及缓聚剂等因素对生物催化剂活性的影响,结果表明:澳洲青苹生物催化剂最适pH值为6.5;最适温度为35;90处理3min,生物催化剂活性基本被遏抑;添加浓度为125mg/kg抗坏血酸或者浓度为600mg/kg的枸橼酸或者浓度为50mg/kg的亚硫酸氢钠后,生物催化剂活性分别为对照的36%,38%和23%。澳洲青萍生物催化剂的米氏方程参数为:Km=0.137mol/L,Vmax=0.460U/min关键词：智慧果汁；生化褐变缓聚剂；酵素生化褐变；多酚催化酵素； abstractIn order to e

3、xplore the inhibitory mechanism of different biochemical browning retarders on the activity of polyphenol catalytic enzymes in smart fruit, a simulation system of smart fruit juice was constructed with phosphate buffer. Chlorogenic acid, a phenolic substance with high content in smart fruit, was sel

4、ected as the experimental object, and phosphate buffer was used as the simulation system of smart fruit juice. 4-hexyl resorcinol (4-HR), glyoxylic acid, glycolic acid were selected as the simulation system of smart fruit juice. Benzoic acid and p-methoxybenzoic acid were used as retarders. The effe

5、cts of retarders on biochemical browning characteristics of chlorogenic acid-simulated smart juice enzymes were investigated by simulation experiments, and the mechanism of retarders on polyphenol catalytic enzymes in smart juice was revealed. The results showed that the inhibitory mechanism of reta

6、rders on polyphenol catalytic enzymes was quite different. The inhibitory effects of 4-HR and glyoxylic acid on polyphenol catalytic enzymes were competitive, phytic acid mixed and benzoic acid non-competitive. This study can provide theoretical basis for controlling biochemical browning of wise fru

7、it juice by retarders. With catechol as the substrate, the biocatalysts in Granny Smith were studied. The effects of pH value, temperature, substrate concentration and retarder on the activity of biocatalyst were investigated. The results showed that the optimum pH value was 6.5; the optimum tempera

8、ture was 35 and the activity of biocatalyst was basically inhibited when treated at 90 for 3 min. After adding ascorbic acid at 125 mg/kg or citric acid at 600 mg/kg or sodium bisulfite at 50 mg/kg, the activity of biocatalyst was basically inhibited. The activity of the catalyst was 36%, 38% and 23

9、% respectively. The parameters of Michaelis equation for Azolla australis biocatalyst are Km=0.137mol/L and Vmax=0.460U/min.Key words: wisdom juice; biochemical browning retarder; enzymes biochemical browning; polyphenol catalytic enzyme;目录引言51.材料与办法61.1材料61.2实验仪器61.3抑制率的计算办法61.4生化褐变程度的衡量61.5实验办法71.

10、5.1多酚催化酶的提取办法71.5.2多酚催化酶活性的检测办法76单一遏抑剂对多酚催化酶活性的影响77单一遏抑剂对鲜榨智慧果汁防生化褐变效果的探究88复合遏抑剂对鲜榨智慧果汁防生化褐变效果的探究82结果与分析82.1单一遏抑剂对多酚催化酶的效应及对智慧果汁防生化褐变的影响82.1.1乙二酸对多酚催化酶活性及效应的影响81.2乙二胺四乙酸-Na2对多酚催化酶活性及效应的影响102.1.3枸橼酸对多酚催化酶活性及效应的影响10.1.4植酸对智慧果汁模拟系统酶生化褐变的遏抑作用11.1.5安息香酸对智慧果汁模拟系统酶生化褐变的遏抑作用122.1.6亚硫酸氢钠对多酚催化酶活性的影响142.2.鲜榨智慧

11、果汁的自然生化褐变142.3单一遏抑剂对鲜榨和贮藏智慧果汁防生化褐变效果的探究15结论16谢辞18参考文献19引言我国是凝练智慧果汁生产和出口第一大国。据了解,凝练智慧果汁酸度每升高1度,每吨凝练汁的售价提高100150美元。果汁的酸度越高,Vc在制作中的损失就越少,果汁的营养价值就越高1。但是,长期以来,国产智慧果制作品种多为富士智慧果,其糖分较高,生产出来的产品酸度不够、口感差、档次低。要提高智慧果凝练汁的酸度,满足制作所需,必须选择适宜制作果汁的品种,使用酸度值高的智慧果作为制作原料。智慧果汁是人们喜爱的果蔬汁之一，近年来，中国智慧果汁的产量增加很快。在世界贸易中，凝练智慧果汁的贸易量逐

12、年提高。但是在制作和贮藏的过程中，智慧果汁易产生生化褐变反应，由诱人的金黄色变成棕褐色，色值下降、感官品质劣变，营养价值降低。果汁的生化褐变主要是由酵素生化褐变引起的，这一直是采后生理探究的重点。酵素生化褐变是在氧气参与条件下，果蔬中的多酚物质经多酚催化酵素催化变色所致。多酚催化酵素是产生酵素生化褐变的主要酵素，存在于大多数果蔬中。鉴于多酚催化酵素对智慧果汁品质的不利作用，果汁生产过程中常采用缓聚剂遏抑多酚催化酵素的活性，从而达到控制生化褐变的目的，所以，探究生化褐变缓聚剂对智慧果生物催化剂的遏抑机制具有重要意义。酵素生化褐变的产生需要个条件，即适当的酚类底物、酚氧化酵素和氧。在控制酵素生化褐

13、变实验过程中，通过除去底物遏抑生化褐变的可能性很小，有探究者曾设想改变酚类底物的结构，但当下为止未取得成功。实践中控制酵素生化褐变的办法主要是添加缓聚剂影响酵素活性。根据缓聚剂与酵素的作用是否可逆，通常将遏抑作用分为不可逆遏抑和可逆遏抑两类，可逆遏抑作用除了竞争性遏抑、非竞争性遏抑和反竞争性遏抑以外，还有混合型缓聚剂，混合型缓聚剂包括两种种类：非竞争性和反竞争性混合遏抑，非竞争性和竞争性混合遏抑。当下国内外已探究出多种生化褐变缓聚剂，其中、谷胱甘肽、有机钙盐、半胱氨酸和植物提取物等是探究较多的新型生化褐变缓聚剂。等发现与有很好的协助作用，这两种缓聚剂联合使用对多酚催化酵素活性的遏抑效果比单独使

14、用要好，但具体的遏抑机制当下尚不清楚。赵坚华等探究缓聚剂对智慧果梨中生物催化剂的遏抑作用表明，智慧果梨中生物催化剂的最佳缓聚剂是谷胱甘肽，可以有效遏抑活性，当谷胱甘肽浓度为时，生物催化剂的活性降到，当浓度增大到时，生物催化剂完全失去活性。周会玲等对不同品种智慧果汁的生化褐变及其遏抑办法的探究表明，对黄元帅智慧果汁用的、对乔纳金智慧果汁用的在榨汁时进行处理能较好地遏抑生化褐变。但是有关常用缓聚剂的机制没有做出系统的探究。1.材料与办法1.1材料澳洲青苹,磷酸二氢钾、氢氧化钠、枸橼酸、枸橼酸三钠、邻苯二酚、亚硫酸氢钠、抗坏血酸等均为分析纯。1.2实验仪器电子天平、DS-1高速组织捣碎机、UNICO

15、2000可见分光光度计、PHS-4C酸度计、SIGMA3K3D冷冻离心机等。1.3抑制率的计算办法不同浓度的缓聚剂,以蒸馏水为参比,用UV2000紫外可见分光光度计420nm下测其OD值3,考察缓聚剂的浓度对多酚催化酵素活性的影响。本实验用遏抑率来反映缓聚剂对多酚催化酵素的遏抑程度,遏抑率越高说明防生化褐变剂对多酚催化酵素的遏抑效果越好。式中:A0对照实验的吸光值;A添加防生化褐变剂的吸光值。1.4生化褐变程度的衡量取3mL智慧果汁放入比色槽中(控制25),用全自动色差计通过反射法间隔一定时间测色(以L值,a值和b值表示),其中L值越大则果汁越亮,反之越暗。a值越大则果汁越红,反之越绿。b值越

16、大则果汁越黄,反之越蓝4。检测前仪器用标准白板进行校正,式中:L0智慧果加防生化褐变剂后制果汁的第1个L值;L1智慧果不加防生化褐变剂破碎后制的果汁放置t时间后的L值;L2智慧果加防生化褐变剂破碎后制的果汁放置t时间后的L值。生化褐变遏抑率=100%生化褐变率。1.5实验办法1.5.1多酚催化酶的提取办法称取20.0g智慧果,然后加入一定量的磷酸盐缓冲溶液,用组织捣碎机捣碎,之后在4下10000r/min冷冻离心20min,上清液即为多酚催化酵素酵素液。1.5.2多酚催化酶活性的检测办法室温,在波长为420nm的条件下,取1ml缓冲液、1ml底物(0.1mol/L的邻苯二酚)、1ml酵素液加入

17、比色皿中,每隔10s记录1次吸光值,总共检测4min。以直线段的斜率(A/t)计算酵素活性,以每毫升酵素液每分钟引起吸光值改变0.001为1个酵素活性单位。6单一遏抑剂对多酚催化酵素活性的影响取若干试管,按顺序加入0.1000mol/L1mL邻苯二酚及不同浓度的缓聚剂,混匀。于30水浴10min后,分别加入酵素液1mL于30水浴反应1min。立即加入三氯乙酸混匀,终止反应。取出,立即于分光光度计420nm处,以蒸馏水为参比,测OD值。根据不同浓度的缓聚剂对多酚催化酵素的遏抑率制作曲线,考察防生化褐变剂的浓度对多酚催化酵素活性的影响。7单一遏抑剂对鲜榨智慧果汁防生化褐变效果的探究配制一定浓度缓聚

18、剂,然后按照料液比11.25打浆1min,过滤、离心,放入瓶中(未封口),放置一段时间(15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h)测其色值,并计算生化褐变遏抑率。8复合遏抑剂对鲜榨智慧果汁防生化褐变效果的探究将乙二酸、乙二胺四乙酸Na2和枸橼酸组合进行鲜榨智慧果汁防生化褐变的正交实验,按L9(33)设计两因素三水平实验如表1。然后按照料液比11.25打浆1min,过滤、离心,放入瓶中(未封口),放置一段时间(15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h)测其色值,并计算生化褐变遏抑率。2结果与分析2.1单一遏抑剂对多酚催化酵素的效应及对智慧果汁防生化褐变

19、的影响2.1.1乙二酸对多酚催化酵素活性及效应的影响不同浓度的乙二酸对多酚催化酵素活性影响如图1所示。随着乙二酸添加量的增加,多酚催化酵素的活性逐渐降低。当乙二酸添加量在0.1000mol/L时,遏抑率达89.81%;当添加量在0.2500mol/L,遏抑率达94.30%;当添加量在0.5000mol/L遏抑率达97.45%。可见,随着乙二酸浓度的增加,遏抑率也提高,但成本及添加剂的安全风险也增加,所以乙二酸浓度选用0.2500mol/L作为遏抑多酚催化酵素活性的浓度.乙二酸是很强的酸化剂,可以改变环境的pH来遏抑酵素活,它还是一种鳌合剂,通过螯合多酚催化酵素的活性部位铜离子而遏抑多酚催化酵素

20、的活性。在测酵素活系统中,固定底物(邻苯二酚)浓度为0.1000mol/L,加入不同浓度的乙二酸,改变加入的酵素量,检测酵素催化的活性。以酵素催化活性与加入的酵素量作图,见图2,得到一组平行直线。随着乙二酸浓度的增大,直线的斜率基本不变,但横轴的截距随着乙二酸浓度的增大而增大。说明乙二酸对多酚催化酵素的遏抑作用属于不可逆过程,乙二酸是通过降低有效的酵素量导致活性的下降。1.2乙二胺四乙酸-Na2对多酚催化酵素活性及效应的影响不同浓度的乙二胺四乙酸-Na2对多酚催化酵素活性影响显示,随乙二胺四乙酸Na2添加量的增加多酚催化酵素的活性逐渐降低。当乙二胺四乙酸Na2添加量在0.1000mol/L时,

21、遏抑率达77.06%;当添加量在0.2000mol/L,遏抑率达81.07%;当添加量在0.5000mol/L,遏抑率达83.01%。可见,乙二胺四乙酸-Na2可以较好地遏抑多酚催化酵素活性。选择0.5000mol/L作遏抑多酚催化酵素活性的浓度。乙二胺四乙酸Na2是很强的螯合剂,通过螯合多酚催化酵素的活性部位铜离子而遏抑多酚催化酵素的活性。在测活系统中,固定底物(邻苯二酚)浓度为0.1000mol/L,加入不同浓度的乙二胺四乙酸-Na2,改变加入的酵素量,检测酵素催化的活性。以酵素催化活性与加入的酵素量作图(见图3),得到一组平行直线。随着乙二胺四乙酸Na2浓度的增大,直线的斜率基本不变,但

22、横轴的截距随着乙二胺四乙酸-Na2浓度的增大而增大。说明乙二胺四乙酸-Na2对多酚催化酵素的遏抑作用属于不可逆过程,乙二胺四乙酸Na2是通过降低有效的酵素量导致活性的下降。2.1.3枸橼酸对多酚催化酵素活性及效应的影响不同浓度的枸橼酸对多酚催化酵素活性影响如图4所示。随着枸橼酸添加量的增加,多酚催化酵素活性逐渐降低,当枸橼酸添加量在0.1000mol/L时,遏抑率达76.30%;当枸橼酸添加量在0.2000mol/L时,遏抑率达81.31%;当枸橼酸添加量在0.5000mol/L时,遏抑率达84.25%。可见,枸橼酸浓度超过0.2000mol/L时,随着浓度的增加,遏抑率变化不大,所以,选择0

23、.2000mol/L作为枸橼酸遏抑多酚催化酵素活性的浓度。枸橼酸不仅可以作为酸化剂,改变环境的pH来遏抑酵素活,它还是一种鳌合剂,通过螯合多酚催化酵素的活性部位铜离子而遏抑多酚催化酵素的活性。在测酵素活系统中,固定底物(邻苯二酚)浓度为0.1000mol/L,加入不同浓度的枸橼酸,改变加入的酵素量,检测酵素催化的活性。以酵素催化活性为纵坐标,加入的酵素量为横坐标作图(见图5),得到一组平行直线。随着枸橼酸浓度的增大,直线的斜率基本不变,但横轴的截距随着枸橼酸浓度的增大而增大。说明枸橼酸对多酚催化酵素的遏抑作用属于不可逆过程,枸橼酸是通过降低有效的酵素量导致活性的下降。.1.4植酸对智慧果汁模拟

24、系统酵素生化褐变的遏抑作用植酸（肌醇六磷酸）是一种很强的缓聚剂，具有个羧基，能够通过与金属螯合作用来遏抑生物催化剂的活性。虽然有报道指出植酸对果蔬汁有护色效果，但当下关于植酸在智慧果汁中的应用探究不深入，赵玉生等探究表明，植酸及其盐天然无毒，是理想的植物性食品护色保鲜剂，应积极推广。本实验探究植酸对模拟果汁酵素生化褐变的遏抑作用及其机制见图。由图（）可知，加入植酸后酵素催化速率明显降低，且随着植酸添加量的增加，酵素催化速率逐渐降低，该探究结果与宋连军等的探究结果一致。由图（）可知，加入植酸后，酵素催化的增大，降低，不符合可逆遏抑种类中的任一模式，可见，植酸对多酚催化酵素的作用属于混合型遏抑。.

25、1.5安息香酸对智慧果汁模拟系统酵素生化褐变的遏抑作用对绿原酸模拟果汁系统生化褐变的遏抑动力学见图。由图可知，酵素催化中加入安息香酸后，最大反应速率变小，不变；不同浓度缓聚剂的双倒数直线相交于横轴，纵轴截距因缓聚剂的存在而变大，遏抑分数与缓聚剂浓度成正比，与底物浓度无关，说明安息香酸是多酚催化酵素的非竞争性缓聚剂，这与黄晓丹等探究结果一致，即安息香酸能遏抑蘑菇酪氨酸酵素的单酚酵素和二酚酵素的活性，其效应为可逆遏抑效应，安息香酸对二酚酵素的遏抑作用表现为非竞争性遏抑。2.1.6亚硫酸氢钠对多酚催化酵素活性的影响图8结果表明,在050mg/kg的用量范围内,随着亚硫酸氢钠在反应液中浓度的增加,酵素

26、活性显著下降;超过50mg/kg,多酚催化酵素活性变化不大;亚硫酸氢钠浓度为50mg/kg时多酚催化酵素活性为对照的23%。所以,浓度为50mg/kg亚硫酸氢钠能有效遏抑多酚催化酵素活性,防止生化褐变。但在实际应用中要考虑Na+超标问题。2.2.鲜榨智慧果汁的自然生化褐变衡量酵素生化褐变可用色差计得到的L值,L值越低则酵素生化褐变越严重。如果在一个时间段内值在不断减小,表明酵素生化褐变一直在产生。由图6、表2可知,智慧果破碎后制得的智慧果汁的L值由15min时的64.02下降到24h后的41.30;同时a值和b值都升高了。这表明在自然条件下,智慧果一经破碎,其细胞中的多酚催化酵素则有机会与多酚

27、底物接触,生化褐变反应将产生且有持续性,不能以此来衡量其他缓聚剂的防生化褐变效果。2.3单一缓聚剂对鲜榨和贮藏智慧果汁防生化褐变效果的探究由表3可知,这3种缓聚剂单独使用时,在所测条件下的防生化褐变效果是有很大区别的。其防生化褐变能力(生化褐变遏抑率)依次为:0.2500%乙二酸0.5000%枸橼酸,0.5000%乙二胺四乙酸-Na2在智慧果汁中无防生化褐变效果。由表3单一缓聚剂对鲜榨智慧果汁防生化褐变效果的实验,将制得的智慧果汁贮藏90天后,0.2500%的乙二酸对智慧果汁防生化褐变效果也不好,其生化褐变遏抑率仅为71.04%结论、乙二酸、植酸和安息香酸对多酚催化酵素酵素催化绿原酸模拟果汁系

28、统生化褐变均有遏抑作用。不同缓聚剂对含绿原酸模拟果汁中多酚催化酵素遏抑机制不同。和乙二酸对多酚催化酵素遏抑作用为竞争性遏抑，植酸为混合性遏抑，安息香酸酵素为非竞争性遏抑。本实验只对智慧果中含量较多的绿原酸酵素生化褐变遏抑机制进行探究，而智慧果中多酚物质种类繁多，所以，缓聚剂对其他主要酚类物质酵素生化褐变的遏抑作用，还有待于进一步探究。3)抗坏血酸、枸橼酸、亚硫酸氢钠均为多酚催化酵素的有效缓聚剂。添加浓度为125mg/kg抗坏血酸或者浓度为600mg/kg的枸橼酸或者浓度为50mg/kg亚硫酸氢钠后,智慧果中的多酚催化酵素活性分别为对照的36%,38%和23%。探究表明,单一缓聚剂对多酚催化酵素

29、的遏抑能力依次是:0.2500mol/L乙二酸0.2000mol/L枸橼酸0.5000mol/L乙二胺四乙酸-Na2,遏抑率分别为94.30%、86.31%、83.01%。三者对多酚催化酵素的遏抑能力均表现出一定的浓度依赖性,遏抑机制为不可逆效应。0.2500mol/L乙二酸对鲜榨智慧果汁的防生化褐变能力较强,生化褐变遏抑率为87.39%;0.5000mol/L枸橼酸防生化褐变效果弱,生化褐变遏抑率仅为45.15%,0.5000mol/L乙二胺四乙酸-Na2在智慧果汁中无防生化褐变效果。在单一缓聚剂对鲜榨智慧果汁防生化褐变效果的基础上,筛选出0.2500mol/L乙二酸用于智慧果汁的贮藏实验,

30、将制得的智慧果汁常温贮藏90天后,生化褐变遏抑率仅为71.04%。0.3000mol/L乙二酸联合0.5000mol/L乙二胺四乙酸-Na2、0.5000mol/L枸橼酸,能较好的遏抑鲜榨及贮藏过程中智慧果汁的生化褐变,遏抑率分别达到91.21%和89.47%。谢辞本论文是在我的老师某某教授的耐心指导下完成的。某某老师知识广博、内涵深远、教导严谨、严格要求和和蔼亲切，不仅只是我学生道路的指路人，也成为了我人生的向导。他在这短短的时间里，让我把学到的利用到实践中和自主思考的习惯，对我未来的学习和工作路上产生了很大的作用。在此谨向某某老师表示最真诚的谢意和尊敬。它的次，感谢学校里的老师和同学，在学

31、习中他们帮了我很多，在生活中，同学和老师一直关心我和帮助我，他们的陪伴见证的我的成长。还要感谢我的亲人，他们总是的支持着我的学习，激励着我不断努力，没有他们就没有我的今天。我会不辜负父母的期望，在以后的学习、工作和生活中努力做到最佳。最后，感谢为我答辩和评审的各位专家和评委，感谢你们对我提出的宝贵的建议和意见，感谢你们的批评和指正。谢谢！参考文献1张敬滋.我国凝练智慧果汁价格攀升J.北京农业,2004,(5):3939.2鲁玉妙,高华,赵政阳,等.粉红女士智慧果品质特性分析评价J.果树学报,2003,20(6):503505.3王雪静,张子德.桃果实中影响生物催化剂活性因素的探究J.河北农业大学学报,2005,28(3):6062.4赵光远,张培旗,白艳红,等.热协同超高压处理对鲜榨智慧果汁品质影响的探究J.河南工业大学学报:自然科学版,2007,28(2):赵坚华，郑玉淑，李官浩，等智慧果梨中生物催化剂缓聚剂的遏抑效果探究食品科学，（）：周会玲，段长青，周存田，等不同品种智慧果汁的生化褐变及其遏抑办法探究西北农林科技大学学报，（）：